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1、10申请公布号CN101962635A43申请公布日20110202CN101962635ACN101962635A21申请号201010512607X22申请日20101020C12N9/5020060171申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市泰山区岱宗大街61号72发明人唐晓珍谢芳位思清54发明名称生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法57摘要本发明涉及一种生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法。取鲜姜汁，用硫酸铵、无水乙醇制备生姜蛋白酶粗酶，磷酸缓冲液溶解得到粗酶液。将聚乙二醇、硫酸铵、电解质按照一定比例配制，调PH，形成双水相体系。加入生姜蛋白酶粗酶液，将分液漏斗封口，反复倒置，充分混合均匀。
2、，室温下静置分相，使体系上下相分离完全。将下相盐相放出，存好。然后往上相中加入硫酸铵盐溶液，二次萃取分离后，放出下相盐相，存好。往上相中再次加入硫酸铵盐溶液，进行第三次萃取，收集下相盐相进行透析，透析完后冻干即得纯酶。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页附图1页CN101962636A1/1页21一种生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法，其特征在于由聚乙二醇、硫酸铵、电解质按照不同比例在一定条件下形成的双水相进行三步萃取生姜蛋白酶的提取方法，配制分子量为4000、浓度为30的聚乙二醇溶液，10的硫酸铵溶液和2的NACL电解质溶液，充分溶解后作为双水相。
3、体系，调节体系的PH为80，将双水相体系溶液倒入分液漏斗中进行分相，待分相完成后，每20ML双水相体系溶液中加入3ML生姜蛋白酶粗酶液，将分液漏斗封口，反复倒置23MIN，每分钟1015次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相23H，使体系上下相分离完全；生姜蛋白酶粗酶液进行第一步萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入10ML20的硫酸铵盐溶液，将分液漏斗封口，反复倒置23MIN，每分钟1015次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相23H，使体系上下相分离完全；生姜蛋白酶粗酶液进行两步纯化萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入15ML12的硫酸铵盐溶液，将分液漏斗封口，反。
4、复倒置23MIN，每分钟1015次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相23H，使体系上下相分离完全，经三步萃取纯化后，收集下相盐相进行透析，透析完后冻干即得纯酶。权利要求书CN101962635ACN101962636A1/2页3生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法一技术领域0001本发明涉及一种生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法。二背景技术0002生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，对食品的质量、风味、营养起重要作用，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。在生姜蛋白酶提取分离技术上，可以用超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。然而，生姜蛋白酶属大分子物质，在超滤过程中易在膜表面聚积。
5、而产生浓差极化现象，且存在生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及有机溶剂残留问题；盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强，制得的生姜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业上的产业化生产，且用于亲和层析的前处理液是需经过初步纯化的酶液。而双水相萃取法能高效分离提取高纯度生姜蛋白酶。其原因是由于双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，目标产物有较高的收率，不存在有机溶剂残留，分离过程经济等，其在生姜蛋白酶的制备中前景良好，但这方面迄今为止还未见报道。0003双水相萃取ATPS。
6、技术是近年来发展起来的一项蛋白纯化方法，该方法是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力如憎水键、氢键和离子键等因素的影响，使得目标蛋白质和其它蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。三发明内容0004本发明的目的是研发一种直接从生姜中提取较为纯化的生姜蛋白酶的新型萃取方法。0005其方法是将生姜切成小块，与磷酸缓冲液按一定料液比例进行打浆，搅拌浆液，过滤，静置，离心，取上清液用无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀即粗酶。将聚乙二醇、硫酸铵、电解质按照一定比例配制，调PH，形成双水相体。
7、系。加入生姜蛋白酶粗酶液，将分液漏斗封口，反复倒置，充分混合均匀，室温下静置分相，使体系上下相分离完全。将下相盐相放出，存好。然后往上相中加入硫酸铵盐溶液，二次萃取分离后，放出下相盐相，存好。往上相中再次加入硫酸铵盐溶液，进行第三次萃取，收集下相盐相进行透析，透析完后冻干即得纯酶。0006生姜蛋白酶的三步双水相萃取纯化方法是在双水相萃取技术基础上，增加了两步萃取，通过三步调整双水相系统中一系列参数，从而可选择性萃取、纯化目标蛋白酶，直接得到纯化的生姜蛋白酶。四附图说明0007图1生姜蛋白酶的三步双水相萃取流程说明书CN101962635ACN101962636A2/2页40008图1中1是鲜姜。
8、汁，2是硫酸铵，3是无水乙醇，4是粗酶，5是粗酶液，6是聚乙二醇，7是硫酸铵，8是电解质NACL，9是配制双水相体系，10是第一步分相萃取，11向第一步分相萃取后的上相中加入硫酸铵盐溶液，12是第二步分相萃取，13向第二步分相萃取后的上相中加入硫酸铵盐溶液，14是第三步分相萃取，15将下相盐液透析，16是冻干的纯酶。五具体实施方式00091生姜蛋白酶的第一步双水相萃取0010取鲜姜汁1，按照常规提取方法，用硫酸铵2、无水乙醇3制备生姜蛋白酶粗酶4。磷酸缓冲液溶解得到粗酶液5。配制分子量为4000、浓度为30的聚乙二醇6溶液，10的硫酸铵溶液7和2的NACL电解质溶液8，充分溶解后作为双水相体系。
9、9，调节体系的PH为80。将双水相体系溶液倒入分液漏斗中进行分相，待分相完成后，每20ML双水相体系溶液中加入3ML粗酶液。将分液漏斗封口，反复倒置23MIN，每分钟1015次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相23H，使体系上下相分离完全10。第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为617，酶活力回收率为39377，上相酶纯化倍数为185，酶的得率为120。00112生姜蛋白酶的第二步双水相萃取0012生姜蛋白酶粗酶液进行第一步萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入10ML20的硫酸铵盐溶液11。将分液漏斗封口，反复倒置23MIN，每分钟1015次，将体系各组分充分混合均。
10、匀后，室温下静置分相23H，使体系上下相分离完全12。第二步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为803，酶活力回收率为13126，上相酶纯化倍数为281，酶的得率为107。00133生姜蛋白酶的第三步双水相萃取0014生姜蛋白酶粗酶液进行两步纯化萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入15ML12的硫酸铵盐溶液13。将分液漏斗封口，反复倒置23MIN，每分钟1015次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相23H，使体系上下相分离完全14。第三步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为204，酶活力回收率为8063，上相酶纯化倍数为291。经三步萃取纯化后，收集下相盐相进行透析15，透析完后冻干即得纯酶16，得率为072。0015应用上述方法获得的纯化生姜蛋白酶是一种优良的肉类嫩化剂，且具有酒类澄清、凝乳、水解大豆蛋白等作用，并对大肠杆菌、啤酒酵母和青霉有抑制生长效果。生姜蛋白酶II还能够特异地水解P2位含有脯氨酸的多肽和蛋白质，这种对脯氨酸的特殊亲合性使其在生化研究中成为一种很有前途的工具酶。可广泛应用于食品加工、保健品、医药、生物技术等领域，是一种应用性强、应用范围广的新酶源，有很好的产业化和市场前景。说明书CN101962635ACN101962636A1/1页5图1说明书附图CN101962635A。