土壤中弓形虫的分子检测方法.pdf

本发明属于寄生虫分子检测技术领域，涉及一种土壤中弓形虫的分子检测方法，尤其涉及一种利用环介导的等温扩增(LAMP)技术快速检测土壤环境中弓形虫卵囊的方法。本发明的特征是，通过设计一套弓形虫的特异性引物，提取被检土壤样品中总DNA，LAMP扩增，采用显色方法或琼脂糖凝胶电泳方法对扩增产物进行鉴定分析，判定所述样品中弓形虫是否为阳性或阴性。本发明的另一特点是在所述的LAMP反应体系中添加了牛血清白蛋白(BSA)，从而降低了土壤环境中PCR抑制因子对LAMP反应的干扰，提高了检测的准确率。本发明能快速、准确地将被检土壤样品中的弓形虫检测出来，同时适用于动物弓形虫感染的检测以及环境中弓形虫的监测。

1.  一种土壤中弓形虫的分子检测方法，其特征在于，通过设计弓形虫特异引物对，提取被检土壤样品总DNA，采用环介导的等温扩增，对扩增产物进行分析以判定待测土壤样品中所述弓形虫是否为阳性或阴性，其步骤如下：
(1)根据报道的登录号为EU572718的弓形虫MIC3基因序列设计特异引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：
外引物对F3：5’-TAGATGTATTGATGACGCCTCG-3’；
外引物对B3：5’-TATTCATTTTTTCACTCAAGCTCC-3’；
内引物对BIP：5’-AATTCGGCATCAGCGCGTCCCCCGATTCTCCTTTCCCAT-3’；
内引物对FIP：5’-GACTTCGACTCCTTCCACACACGGAGAATGCTACACCTGCGAGT-3’；
促环形成引物对LF：5’-CTCCGCCTTGAAGTCACTC-3’；
促环形成引物对BF：5’-GATCTGCTTCCGCAACCTCC-3’；
(2)待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合并自然晾干，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草；
(3)待检土壤样品中DNA的提取：
1)将处理过的0.5g的土壤与0.5g的直径为0.5mm的玻璃珠混合加入pH为8.0的2mL裂解缓冲液涡旋3min直至土壤样品被打散，在70℃下水浴1h；
2)将步骤1)的土壤样品在5000r/min下离心10min，保留上清备用；
3)将步骤2)的沉淀用DNA提取液洗一次，于12000r/min下离心10min，并将得到的沉淀溶于1.5mL的DNA提取液中，得到混合物；
4)将步骤3)的混合物分别置于-20℃及65℃下水浴，循环3次，于12000r/min下离心10min后取清并与步骤2)的上清合并；
5)用体积比为25∶24∶1的等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液抽提2次，取水相加等体积的异丙醇沉淀；
6)将步骤5)的样品在12000r/min下离心10min，用100μL灭菌水溶解沉淀；
7)用DNA纯化柱纯化DNA样品。
(4)环介导的等温扩增：
1)建立环介导的等温扩增反应体系：2.5μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，7.0mmol/L MgCl₂，1.0ng/μL牛血清白蛋白，1mol/L甜菜碱，1.4mmol/L脱氧核苷酸，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物LF和引物LB，8U的BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL，其中阳性对照为土壤中提取的弓形虫DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；
2)环介导的等温扩增条件：95℃预变性5min后加入8U的BstDNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63.5℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应；
3)扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，所述的显色反应的步骤为：加入1-2μL的荧光显色剂1000×SYBR Green I至25μL的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果；所述的琼脂糖凝胶电泳步骤为：取25μL的环介导等温扩增的最终反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果；
其中
步骤(3)的1)中的裂解缓冲液的组分及配比为：pH为8.0的50mmol/LTris，20mmol/L的EDTA，100mmol/L的NaCl，1％十二烷基硫酸钠，补足双蒸水至1L。
步骤(3)的3)中DNA提取液的组分及配比为：pH为8.0的50mmol/L的Tris，20mmol/L的EDTA，100mmol/L的NaCl，补足双蒸水至1L。

土壤中弓形虫的分子检测方法
技术领域
本发明属于寄生虫分子检测技术领域，涉及一种土壤中弓形虫卵囊污染的检测方法，尤其涉及一种利用环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术快速检测土壤环境中弓形虫卵囊的方法。
技术背景
弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人畜共患病。其终末宿主是猫，中间宿主是人和其他哺乳类、鸟类、爬行类、鼠类、鱼类等，它不仅对畜牧业的发展造成很大的影响，更对人类造成严重危害。在人体多为隐性感染，发病者临床表现复杂，其症状和特征又缺乏特异性，易造成误诊，主要侵犯眼、脑、心、肝、淋巴结等。孕妇感染后，病原可通过胎盘感染胎儿，直接影响胎儿发育，致畸严重，其危险性较未感染孕妇大10倍，成为人类先天性感染中最严重的疾病之一，本病与艾滋病的关系密切。
根据欧洲多中心病例对照研究，食用未煮熟的、生的、咸肉会造成30-63％的弓形虫感染，而接触土壤会造成17％的孕妇感染^【1】。卵囊在环境中通过风、水、粪便、蚯蚓和节肢动物传播：它们污染地表水、土壤、收获的粮食、水果、蔬菜。卵囊对外界环境以及化学消毒剂有很强的抵抗性，在水中54个月以及土壤中1年后仍然具有感染性。因此，环境(水、土壤)可能是人和动物感染弓形虫病的重要途径之一。在全世界范围内已有通过水和土壤感染人引起弓形虫爆发的相关报道。1982年巴西爆发了人感染弓形虫病，土壤是最可疑的传染源，并从中分离得到了弓形虫卵囊^【2】。
土壤中寄生虫检测的相关报道较少，多采用传统的饱和食盐水或NaNO₃浮集后镜检，但此方法检出率低，土壤用量大，最新的报道是用ZnSO₄溶液采用离心-悬浮的方法在1克土壤中可以检测到1个犬弓蛔虫^【3】。对于环境中弓形虫卵囊的检测方法已从传统的镜检转向分子生物学方法。土壤和水中弓形虫卵囊检测的相关报道较少，采用卵囊回收和PCR方法相结合，此方法耗时长，检出率低，成本高。2008年A.Lass等对波兰TriCity进行了弓形虫卵囊的检测，在40克土壤中存在1000个卵囊才可以被检测到^【4】。卵囊回收率低以及PCR抑制因子的存在大大降低了土壤环境中弓形虫的检出率，是环境中弓形虫分子生物学检测的难题之所在。土壤成分比较复杂，包括多种PCR抑制物，如重金属离子、腐殖质、酚类化合物等。因此，对土壤中提取的DNA必须纯化才能用于下游实验。
随着分子生物学方法的发展，2000年Notomi等报道了一种新的核酸扩增技术-环介导的等温扩增^【5】。目前，该方法已有较多的报道，并建立了专门的官方网站。LAMP技术相比PCR具有以下优点：灵敏度高；特异性强；快速高效，在1h内即可完成，若在靶序列上进一步设计两条促环形成引物，扩增时间将在原来的基础上减少1/3～1/2；设备简单，在恒温水浴锅中即可完成；产物检测方便，可肉眼直接观察焦磷酸镁沉淀或荧光显色剂SYBR Green I显色来判定结果。
从目前的文献和专利查询结果知道，LAMP方法检测环境中弓形虫卵囊仅在水体中有相关报道，但对于在土壤中还未见报道(尤其是在LAMP体系中添加牛血清白蛋白(BSA)来消除PCR抑制因子对扩增的影响方面尚未检索到相关文献)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的快速检测土壤环境中弓形虫卵囊污染的方法，以消除在LAMP体系中PCR抑制因子对扩增的影响，提供一种经济适用的弓形虫快速检测方法。
本发明的具体方案如下列步骤所述：
(1)根据已报道的登录号为EU572718的弓形虫MIC3基因序列设计三对特异性引物，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：
外引物对F3：5’-TAGATGTATTGATGACGCCTCG-3’；
外引物对B3：5’-TATTCATTTTTTCACTCAAGCTCC-3’；
内引物对BIP：5’-AATTCGGCATCAGCGCGTCCCCCGATTCTCCTTTCCCAT-3’；
内引物对FIP：5’-GACTTCGACTCCTTCCACACACGGAGAATGCTACACCTGCGAGT-3’；
促环形成引物对LF：5’-CTCCGCCTTGAAGTCACTC-3’；
促环形成引物对BF：5’-GATCTGCTTCCGCAACCTCC-3’。
上述引物对的核苷酸序列已经采用专用软件PatentIn3.1处理成专利程序的核苷酸序列计算机可读形式副本。这些引物对在序列表中被依次命名为SEQ ID NO：2-7。
(2)待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合并自然晾干，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草；
(3)待检土壤样品中DNA的提取：
1)将处理过的0.5g的土壤与0.5g的直径为0.5mm的玻璃珠混合加入pH为8.0的2mL裂解缓冲液(TENS：pH为8.0的50mmol/L Tris，20mmol/L的EDTA；100mmol/L的NaCl；1％十二烷基硫酸钠(SDS))中，涡旋3min直至土壤样品被打散，70℃下水浴1h；
2)将步骤1)的土壤样品置于离心机上在5000r/min下离心10min，保留上清备用；
3)将步骤2)的沉淀用DNA提取液(TEN：pH为8.0的50mmol/L的Tris，20mmol/L的EDTA，100mmol/L的NaCl)洗一次，于12000r/min下离心10min，并将得到的沉淀溶于1.5mL的TEN中，得到混合物；
4)将步骤3)的混合物分别置于-20℃及65℃下水浴，循环3次，于12000r/min下离心10min后取上清并与步骤2)的上清合并；
5)用体积比为25∶24∶1的等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液抽提2次，取水相加等体积的异丙醇沉淀；
6)将步骤5)的样品于12000r/min下离心10min，用100μL灭菌水溶解沉淀；
7)用DNA纯化柱纯化DNA样品。
(4)环介导的等温扩增：
1)建立环介导的等温扩增(LAMP)反应体系：2.5μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，7.0mmol/L MgCl₂，1.0ng/μL牛血清白蛋白(BSA)，1mol/L甜菜碱，1.4mmol/L脱氧核苷酸(包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP各0.35mmol/L)，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物LF和引物LF，8U的BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL。其中阳性对照为土壤中提取的弓形虫总DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；
2)环介导的等温扩增反应：95℃预变性5min后加入8U的Bst DNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63.5℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应；
3)扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
显色反应：加入1-2μL的荧光显色剂1000×SYBR Green I至25μL的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果。若扩增产物变为黄绿色则为弓形虫阳性，若扩增产物为棕色则为弓形虫阴性。
琼脂糖凝胶电泳：取25μL的环介导等温扩增的最终反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果。扩增产物为由不同大小的区带组成的阶梯式图谱为弓形虫阳性。
本发明的土壤环境中弓形虫卵囊污染的方法快速特异、灵敏度高，与现有的技术相比有以下优点：
1、检出率高：直接提取土壤总DNA，将从土壤中回收卵囊的损失降到零，提高了土壤中弓形虫的检出率；
2、灵敏度高：LAMP检测方法灵敏度高，0.5g土壤中两个弓形虫卵囊就可以被检测出来；
3、特异性强：3对引物对靶序列的8个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；
4、准确性高：LAMP反应体系中添加了牛血清白蛋白(BSA)，从而降低了土壤环境中PCR抑制因子对LAMP反应的干扰，提高了检测的准确率。
5、设备简单：不需要昂贵的PCR仪，在恒温水浴锅中即可完成；
6、检测方便：加入荧光显色剂1000×SYBR Green I至扩增产物后用肉眼即可观察结果。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是弓形虫基因MIC3的部分核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：2-7是本发明用于弓形虫基因MIC3扩增的特异性引物对的核苷酸序列。
图1：本发明对土壤中总DNA电泳图。
图中：泳道M：λDNA/Hind III，泳道1、2为土壤样品。
图2：本发明对土壤中总DNA扩增产物中加入荧光显色剂SYBR Green I后照片。1#管为弓形虫阴性结果，2#管为弓形虫阳性结果。
图3：本发明对弓形虫DNA扩增电泳结果。
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道1、2、3、4为弓形虫DNA样品。
图4：本发明对临床上所采土壤样品弓形虫进行电泳检测结果。
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道1-5为临床上所采土壤样品，依次为：1、2、3为湖北省武汉市洪山区狮子山地区的华中农业大学土壤样品，4、5为湖北省武汉市洪山区狮子山地区的华中农业大学试验猪场土壤样品，泳道N为阴性对照，泳道P为弓形虫阳性对照。
图5：本发明对BSA的量土壤中弓形虫LAMP检测体系的影响检测结果。
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道1-8BSA的量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6ng/μL，泳道N为阴性对照。
图6：本发明对土壤中弓形虫LAMP检测特异性试验结果。
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道1-9别为血吸虫虫卵、猪细小病毒、肺炎链球菌、大肠杆菌、牛分枝杆菌标准株、胸膜肺炎放线杆菌1型、猪产毒多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，泳道N为阴性对照，泳道P为弓形虫阳性对照。
图7：本发明对土壤中弓形虫LAMP检测方法敏感性检测结果。
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道N为阴性对照，泳道1-6分别为弓形虫卵囊含量为0.2、2、20、100、200、500个。
图8：LAMP方法检测土壤环境中弓形虫卵囊污染的方法流程图。
图9：LAMP扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域，其中黄色区域为促环形成引物。
具体实施方式
实施例1：对土壤样品进行弓形虫检测
1、待检土壤样品的处理：
在湖北省武汉市洪山区狮子山地区的华中农业大学试验猪场和住宅区按照常规的土壤采样的五点法取土样，将所采集的土壤样品混合并自然晾干，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草。
2、待检土壤样品中DNA的提取：
1)将处理过的0.5g的土壤与0.5g的直径为0.5mm的玻璃珠混合加入pH为8.0的2mL裂解缓冲液(TENS：50mmol/L Tris，20mmol/L的EDTA；100mmol/L的NaCl；1％十二烷基硫酸钠(SDS))中，涡旋3min直至土壤样品被打散，70℃下水浴1h；
2)将步骤1)的土壤样品置于离心机上在5000r/min下离心10min，保留上清备用；
3)将步骤2)的沉淀用DNA提取液(TEN：pH为8.0的50mmol/L的Tris，20mmol/L的EDTA，100mmol/L的NaCl)洗一次，于12000r/min下离心10min，并将得到的沉淀溶于1.5mL的TEN中，得到混合物；
4)将步骤3)的混合物分别置于-20℃及65℃下水浴，循环3次，于12000r/min下离心10min后取上清并与步骤2)的上清合并；
5)用体积比为25∶24∶1的等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液抽提2次，取水相加等体积的异丙醇沉淀；
6)将步骤5)的样品于12000r/min下离心10min，用100μL灭菌水溶解沉淀；
7)用DNA纯化柱纯化DNA样品，琼脂糖凝胶电泳后见图1。
3、环介导的等温扩增：
以F3、B3为内引物对，FIP、BIP为外引物对，LF、LB为促环形成引物对，进行环介导的等温扩增：2.5μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，7.0mmol/L MgCl₂，1.0ng/μL牛血清白蛋白(BSA)，1mol/L甜菜碱，1.4mmol/L脱氧核苷酸，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物LF和引物LB，8U的BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL。其中阳性对照为土壤中提取的DNA弓形虫阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。95℃预变性5min后加入8U的Bst DNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63.5℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应。
4、扩增产物分析：
显色反应：加入1-2μL的荧光显色剂1000×SYBR Green I至25μL的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果。若扩增产物变为黄绿色则为弓形虫阳性，若扩增产物为棕色则为弓形虫阴性。结果如图2。
琼脂糖凝胶电泳：取10μL的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果。扩增产物由不同大小的区带组成的阶梯式图谱的样品为弓形虫阳性。结果如图4。
实施例2：土壤中弓形虫LAMP检测体系牛血清白蛋白(BSA)量的确定
用弓形虫阳性的土壤总DNA为模板，来确定土壤中弓形虫LAMP检测体系BSA的量，方法如下：
1、按照实施例1的方法提取土壤总DNA。
2、按照实施例1的方法进行LAMP检测，保留弓形虫阳性的土壤总DNA，作为土壤中弓形虫LAMP检测体系BSA量确定的模板。
3、LAMP检测体系BSA量的确定：
反应体系的配制：以F3、B3为内引物，FIP、BIP为外引物，LF、LB为促环形成引物，进行环介导的等温扩增，使体系中BSA的量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6ng/μL。体系中其它试剂为：2.5μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，7.0mmol/L MgCl₂，1mol/L甜菜碱，1.4mmol/L脱氧核苷酸，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物LF和引物LB，8U的BstDNA聚合酶，2μL DNA阳性模板，灭菌双蒸水补齐至25μL。
LAMP扩增：95℃预变性5min后加入8U的Bst DNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63.5℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应。
结果分析：取10μL的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果，BSA量为1.0以及1.2ng/μL泳道扩增的不同大小的区带组成的阶梯式图谱最亮，如图5。
实施例3：土壤中弓形虫LAMP检测方法特异性实验
如表1所列菌种以及病毒：血吸虫虫卵、猪细小病毒、肺炎链球菌、大肠杆菌、牛分枝杆菌标准株、胸膜肺炎放线杆菌1型、猪产毒多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。
表1土壤中弓形虫LAMP检测的特异性试验(验证试验)