快速鉴定梨自花结实性植株的分子标记法.pdf

本发明提供了早期快速鉴定梨自花结实性株系的分子标记方法，属于分子遗传学领域。通过设计的梨自花结实性S4sm-RNase基因特异正反向引物S4smF与S4sm R分别对自花结实性品种‘奥嗄二十世纪’的杂交授粉后代基因组DNA的进行扩增，凡是能扩增得到666bp特异条带的梨植株，表明该植株中含有S4sm-RNase基因，就是自花结实性株系。本发明标记的鉴定方法简便快捷，只涉及基因组DNA的PCR扩增，提高了自花结实性基因型的检测效率。可在植株的幼苗期进行，并不受环境条件的影响，在短时间内可进行大量群体后代的检测，节约生产成本，缩短育种进程，具有良好的应用价值和产业化前景。

1.  快速鉴定梨自花结实性株系的分子标记方法，其特征在于：
用梨自花结实性S₄^sm-RNase基因特异正反向引物
S₄^smF：5’-TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’
S₄^smR：5’-GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’
扩增自花结实性品种‘奥嗄二十世纪’与其他品种杂交的后代基因组DNA，若能扩增出666bp片段的，表明该植株中含有自花结实S₄^sm-RNase基因，除基因型为S₄S₄^sm的植株外，均表现自花结实。

2.  根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：
用梨自花结实性S₄-RNase特异正反向引物
PF  5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′
PR4 5′-TCCCAGAAGCCTACATGATCG-3′
扩增权利要求1所述的分子标记方法鉴定出的含S₄^sm-RNase基因植株的基因组DNA，若能扩增出一条333bp的条带，表明该植株中含有S₄-RNase基因，该植株基因型为S₄S₄^sm，表现自花不结实。

快速鉴定梨自花结实性植株的分子标记法
一、技术领域
本发明提供了早期鉴定梨自花结实性植株的分子标记方法，属于分子遗传学领域，建立了高效、简捷、快速的鉴定梨品种后代中自花结实性株系的技术体系，用于果树自花结实性品种(株系)的鉴定、育种亲本的选择及授粉品种的配置等。
二、背景技术
梨是我国乃至世界主要水果之一，我国现有栽培面积108.74万公顷(2007年中国农业年鉴的数据)。梨是典型的配子体型自交不亲和性(自花不结实性)果树，在生产中必须合理配置授粉树或进行人工辅助授粉，才有可能获得应有的产量，也常常因授粉树配置不当、花期不良气象条件影响昆虫传粉或人工授粉不及时等原因造成减产。如果自花授粉能结实的话，就能避免或减少因坐果率低而减产的问题，尤其是对于保护地栽培的果树来说更为重要。为此，许多果树工作者孜孜以求，寻找良策，以摆脱自花不结实性在果树生产上的负面影响。而且有一些国家，如日本、美国、加拿大等已把选育自花结实性品种作为梨、苹果、甜樱桃等果树的育种目标之一。通过研究揭示果树自花不结实性与自花结实性突变的机理，采取相应技术手段，创新自花结实性种质，逐步培育出综合经济性状优良的梨、苹果等果树的自花结实性品种。梨品种“奥嗄二十世纪”(S基因型为S₂S₄^sm)为“二十世纪”(S基因型为S₂S₄)的自花结实性芽变品种，由于其S₄单元型表现为雌蕊自花不结实性功能丧失(style-part mutant，SM)，但花粉功能正常(吴华清，齐永杰，张绍铃.‘奥嗄二十世纪’梨自交亲和性分子机制及遗传特性研究[J].园艺学报，2008，35(8)：1109-1116)。“奥嗄二十世纪”已经被用于自花结实性品种的种质创新，日本已经培育出自花结实性品种“秋荣”(S₄^smS₅)。正是由于自花结实性品种在栽培上有着良好应用前景，所以寻找一种快速准确标记自花结实性后代株系(品种等)的方法显得尤为重要。
三、发明内容
技术要求
本发明的目的是：提供了早期鉴定梨自花结实性株系的分子标记方法。通过扩增后代基因组的DNA，从而可以建立了快速准确鉴定突变品种后代中自花结实性株系的技术体系，加快了选育自花结实性梨品种的进程。
技术方案
快速鉴定梨自花结实性株系的分子标记方法，其特征在于：
用梨自花结实性S₄^sm-RNase基因特异正反向引物
S₄^sm F：5’-TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’
S₄^sm R：5’-GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’
扩增自花结实性品种‘奥嗄二十世纪’与其他品种杂交的后代基因组DNA或‘奥嗄二十世纪’自花授粉的后代基因组DNA，若能扩增出666bp片段的，表明该植株中含有自花结实S₄^sm-RNase基因，除基因型为S₄S₄^sm的植株外，均表现自花结实。
用梨自花结实性S₄-RNase特异反向引物
PR4 5′-TCCCAGAAGCCTACATGATCG-3′
扩增用上述的分子标记方法鉴定出的含自花结实S₄^sm-RNase基因植株的基因组DNA，若能扩增出若能扩增出一条333bp的条带，表明该植株中含有S₄-RNase基因，该植株基因型为S₄S₄^sm，表现自花不结实。
有益效果
本发明所提供的早期鉴定梨自花结实性株系的分子标记方法，具有以下优点：
(1)本发明的分子标记鉴定方法简便、快速。用于鉴别果树自花结实的传统方法是通过自花授粉后坐果率的调查。这一方法周期长，需要花费很多劳力，而且常因授粉树配置不当、花期不良气象条件影响结果。本标记的鉴定只涉及基因组DNA的PCR扩增，可以在幼苗期进行，不受环境条件的影响，并可在短时间内进行大量样品的检测，节约生产成本。
(2)本发明的分子标记检测准确性高。该标记与控制花粉自花不结实基因的遗传距离为0，没有遗传重组，检测的准确性为100％。
(3)本发明能大大加快自花结实性梨品种的选育进度，具有良好的应用价值，可在品种选育的早期鉴定上直接应用。
四、附图说明：
图1通用引物和特异引物分别扩增OA，XSJ，以及OA×XSJ 21株后代
图2通用引物和特异引物分别扩增OA，F，以及OA×F 45株后代
A：通用引物扩增结果           B：S₄^sm-RNase特异引物扩增结果
C：S₄-RNase特异引物扩增结果   SC：自花结实             SI：自花不结实
OA：‘奥嗄二十世纪’(S₂S₄^sm)  XSJ：‘新世纪’(S₃S₄)    F：‘丰水’(S₃S₅)
五、具体实施方式：
(一)实验方法
1.筛选标记引物的过程如下：
(1)梨通用引物的设计
根据梨S-RNase基因的保守序列，用Primer premier 5.0软件设计通用正反向通用引物：
PF 5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′
PR 5′-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′
(2)S₄^sm-RNase特异引物的设计
通过梨S₄和S₄^sm单元型的比较，可以发现S₄^sm单元型较S₄单元型存在一个236kb片段的缺失，在缺失的区域中，包括了S₄-RNase基因的缺失，但控制花粉的S基因正常，故设计S₄^sm-RNase基因特异正反向引物，以方便鉴定S₄^sm-RNase基因的存在。用引物
S₄^sm F 5’-TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’
S₄^sm R 5’-GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’
扩增自花结实性品种‘奥嗄二十世纪’杂交授粉后代基因组的DNA，若能扩增出666bp的片段，则标志着植株中含有自花结实S₄^sm-RNase基因。除基因型为S₄S₄^sm的植株外，均表现自花结实。
(3)基因型为S₄S₄^sm的植株的鉴定(S₄-RNase特异反向引物的设计)
对于基因型为S₄S₄^sm的植株，虽然含有S₄^sm-RNase，但其S₄花粉功能正常，故表型依然为自花授粉不结实，所以需根据S₄-RNase基因的序列设计特异反向引物PR₄，用PF和PR₄这套引物鉴定出含有S₄-RNase基因的植株。若能扩增出一条333bp的条带，则可以方便鉴定出植株中有S₄-RNase基因的存在：
PR4 5′-TCCCAGAAGCCTACATGATCG-3′
(4)供试组合共2个(均为生产上常用品种)：‘奥嗄二十世纪’ב新世纪’(S₃S₄)的杂交后代21株；‘奥嗄二十世纪’ב丰水’(S₃S₅)的杂交后代45株；共66个株系。
(5)CTAB法(张妤艳，黄绍西，张绍铃，等.京白梨等品种S基因型鉴定及新基因S₂₈、S₃₀的核苷酸序列分析[J].园艺学报，2006，33(3)：496-500)提取各后代株系幼叶的基因组DNA。
(6)用梨通用引物PF、PR和设计的特异引物S₄^smF、S₄^smR分别对后代基因组DNA进行扩增。
(7)利用设计的引物对基因组DNA进行扩增：
反应体系总体积均为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL 3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，各引物0.1μM，20-50ng模板，Taq酶1.0U；
通用引物和S₄-RNase特异引物PCR所用程序为：94℃预变性2min，94℃15s，48℃30s，72℃3min，10个循环后，94℃变性15S，48℃退火30S，72℃3.5min，25个循环后72℃延伸7min；
S₄^sm-RNase基因的特异引物PCR所用程序为：94℃预变性2min，94℃，15s，65℃，30s，72℃3min，10个循环后，94℃变性15S，65℃退火30S，72℃，3.5min，25个循环后72℃延伸7min；
应用PTC-200扩增仪(BIO-RAD)进行扩增；
(8)反应结束后取PCR产物5μl，用1.5％的琼脂糖凝胶在80V电压条件下电泳45分钟，检测PCR产物。EB染色，在紫外灯下观测，拍照。
(二)结果与分析：
通用引物PF和PR不能扩增出S₄^sm-RNase基因，特异引物S₄^smF和S₄^smR若能扩增出666bp的片段，则标志着植株中含有S₄^sm-RNase基因的存在，表现为自花授粉能结实，但S₄S₄^sm的植株除外，仍然自花授粉不结实。
1.从图1中可以看出，21株OA×XSJ后代中，S₂S₃∶S₂S₄∶S₄S₄^sm∶S₃S₄^sm＝5∶7∶4∶5≈1∶1∶1∶1，符合基因分离规律。用5₄^smF/S₄^smR和PF/PR₄这两套引物均能扩增出条带的植株即为S₄S₄^sm的植株，表现自花不结实。
2.从图2中可以看出，45株OA×F后代中，用S₄^sm-RNase特异引物可以扩增出21株自花结实后代，SC∶SI＝21∶24≈1∶1，符合基因分离规律。
序列表
<110>南京农业大学
<120>快速鉴定梨自花结实性植株的分子标记法
<130>说明书
<140>00
<141>2009-6-03
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>梨自花结实性S4^sm-RNase基因特异正向引物S4^smF
<222>(1)..(22)
<223>
<400>1
tcgtcttagg gatttccaat gc                                     22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>梨自花结实性S4^sm-RNase基因特异反向引物S4^smR
<222>(1)..(20)
<223>
<400>2
gccttaaggg ttcattgggc                                        20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>通用正向通用引物PF
<222>(1)..(22)
<223>
<400>3
gttgtttacg gttcacggtt tg                                     22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>通用反向通用引物PR
<222>(1)..(22)
<223>
<400>4
cttttggcac ttgarttttg gt                                     22
210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>特异反向引物PR4
<222>(1)..(21)
<223>
<400>5
tcccagaagc ctacatgatc g                                      21