水稻OSRPA1A基因在育性控制中的应用.pdf

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻育性控制基因OsRPA1a在水稻育性控制中的应用，其特征在于，所述的OsRPA1a基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。本发明公开了所述基因的分离克隆、生物学功能验证及遗传转化步骤，所克隆的基因对水稻的遗传改良具有重要作用。

1、  OsRPAla基因在水稻育性控制中的应用，其特征在于，所述的OsRPAla基因是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或
2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

水稻OsRPAla基因在育性控制中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及利用水稻T-DNA随机插入突变体库，分离克隆一种通过参与水稻减数分裂从而控制水稻花粉育性和胚囊育性的基因OsRPAla，对该基因的生物学功能验证、遗传转化以及作为不育基因在水稻杂交种子生产和育性控制中的应用。
背景技术
在真核生物的生活史中，要经历二倍体的孢子体时代和单倍体的配子体时代。在孢子体时代，真核生物进行减数分裂形成单倍体的孢子；接下来，来自父母本的配子的融合使后代恢复到其双亲二倍体的水平。因此，减数分裂在真核生物世代交替中扮演重要的角色。
近十多年来，人们以酵母作为研究减数分裂的模式生物，鉴定了许多控制减数分裂的基因。此外，人们通过反向或正向遗传学的手段也在植物功能基因研究的模式生物拟南芥中克隆了几十个控制减数分裂的基因(Mercier，R.and Grelon，M.(2008)Meiosis in plants：ten years of gene discovery.Cytogenet Genome Res，120，281-290.Ma，H.(2006)A Molecular Portrait of Arabidopsis Meiosis.In The Arabidopsis Book(Somerville，C.and Meyerowitz，E.eds)，pp.1-39.)。研究表明，减数分裂是一种在真核生物中很保守的机制。
RPA最初是从Hela细胞粗提物中鉴定出来的参与SV40病毒体外复制的必需蛋白之一，人类的RPA是由70kDa(RPA70/RPA1)、32kDa(RPA32/RPA2)、14kDa(RPA13/RPA3)三个亚基组成的异源三聚体。目前，在所有完成测序的真核生物中都鉴定出了RPA(Iftode，等.(1999)Replication protein A(RPA)：theeukaryotic SSB.Crit Rev Biochem Mol Biol，34，141-180.Wold，M.S.(1997)Replication protein A：aheterotrimeric，single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism.Annu RevBiochem，66，61-92.)。研究表明，RPA是真核生物中的单链结合蛋白(single strand DNA binding protein，SSB)，它可以结合在单链DNA上保护它不被体内的DNA酶降解。由于DNA的代谢(包括复制，修复和重组)过程中都会有单链DNA产生，因此，RPA参与了几乎所有的DNA代谢过程。RPA参与这些生化反应是通过与这些反应中的蛋白互作实现的(Zou，等.(2006)Functions of human replication protein A(RPA)：from DNA replication to DNA damage and stress responses.J Cell Physiol，208，267-273.)。除此之外，RPA可能还参与了细胞周期监测和DNA损伤监测(Zou，等.(2006)Functions of human replication protein A(RPA)：from DNA replication to DNA damage and stress responses.J Cell Physiol，208，267-273.)。
与人类、酵母的RPA研究相比，人们对植物中的RPA的功能研究显得相当滞后。虽然对水稻和拟南芥中的RPA基因做过一些研究(见下述)，但是，这些研究仅局限于对其表达的研究，在本发明提出之前，没有有关水稻中OsRPAla的功能的报道。1997年，van der Knaap等(van der Knaap，等.(1997)Expression ofan ortholog of replication protein A1(RPA1)is induced by gibberellin in deepwater rice.Proc Natl Acad Sci USA，94，9979-9983.)利用差异显示的方法从水稻的居间分生组织中鉴定出受水淹迫后上升表达的基因，序列分析表明该基因为水稻的复制蛋白A(OsRPAlb)，来源于OsRPAlb的两个DNA结合结构域(DNA-bandingdomain，DBD)A和B可以替代酵母的相应结构域，说明该基因是水稻中RPA的同源基因。Northern杂交显示，该基因在含有分生组织的区域表达强烈，并且它在GA诱导下在水稻茎节中的表达与细胞周期相一致，说明OsRPAlb参与了水稻DNA的复制。Northern杂交表明，OsRPAla，OsRPAlb和OsRPA2-1的表达都相当广泛，例如，它们在所检测的悬浮培养的细胞，根尖，根，顶端分生组织，幼叶中都有较高的表达，但是，OsRPAla在根尖和顶端分生组织中的表达量要低于OsRPAlb，而在剑叶和叶耳中，OsRPAla的表达量则高于OsRPAlb。在成熟叶片中，上述三个基因都没有表达。在培养的悬浮细胞中，当把糖源去掉后的6天和10天后，上述三个基因的表达都会下降，当重新加入糖源后，它们的表达又会恢复到正常的水平，说明这三个基因可能都参与了水稻的DNA复制过程(van der Knaap，等.(1997)Expression of anortholog of replication protein A1(RPA1)is induced by gibberellin in deepwater rice.Proc Natl Acad Sci USA，94，9979-9983.Ishibashi，等.(2001)Two types of replication protein A 70kDa subunit in rice，Oryza sativa：molecular cloning，characterization，and cellular&tissue distribution.Gene，272，335-343.)。另外一个科研小组对OsRPAlb和OsRPA2-1的研究表明，它们两个在受水淹迫2个小时的水稻的茎节的分生区中的表达比处理前有所上调，并在6小时时达到最大。OsRPA2-1在同样处理下的茎节的伸长区也有同样的表达趋势，但OsRPAla在此区域没有检测到其表达。两个基因在同样处理下的茎节的分化区都没有表达(Marwedel，等.(2003)Plant-specific regulation of replication protein A2(OsRPA2)from rice during the cell cycle and inresponse to ultraviolet light exposure.Planta，217，457-465)。
本发明利用OsRPAla的T-DNA插入突变体详细研究了该基因在减数分裂过程中的作用，为植物育性的控制提供了新的途径，也为我们深入了解减数分裂的机制提供了帮助
发明内容
本发明的目的是分离克隆一种控制水稻减数分裂的基因OsRPAla，利用该基因的失活可能影响水稻的减数分裂进而影响雌雄配子的正常发育并造成水稻植株的完全不育，因此该基因的克隆有利于了解植物减数分裂的过程。
本发明的另一个目的是控制水稻减数分裂基因OsRPAla的转基因植物在植物育种中特别水水稻育性控制上的应用。具体的说就是利用分子设计的方法(将该基因与其它器官或组织特异表达的调控元件组合)抑制该基因在雌配子或/和雄配子的表达从而得到雌性不育或雄性不育或雌雄都不育的植株，创造新的雌性或/和雄性不育系，这些不育系可以用于杂交种的生产，也可以用于控制植物的育性(例如水稻育性的控制)，如使悬铃木、杨树、香樟等不育，减少其种子或果实污染环境；此外，这些不育系还可以用于植物品质的改良，如生产无籽的果实。另外，这些不育系还可以使转基因植物的花粉和胚囊不育，消除转基因植物中外源基因逃逸的风险。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施。
实现本发明的具体技术步骤如下：
1.大田种植T₀代水稻T-DNA插入突变体的种子04Z11IJ74，筛选不育的突变体。(本发明所述的突变体在突变体数据库http://rmd.ncpgr.cn/中的编号为04Z11IJ74，该突变体可向华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室索取，索取流程请参照上述网站提供的说明，该突变体为一种公开对外发放的生物材料)。
2.利用TAIL-PCR分离不育突变体T-DNA插入位点的侧翼序列，序列分析显示其中一个不育突变体的T-DNA插入在OsRPAla基因(LOC_Os02g53680)的内含子中。
3.通过T-DNA与突变性状的共分离验证、RNAi抑制野生型中内源OsRPAla基因的表达及功能互补实验证明本发明获得的候选基因OsRPAla基因是控制水稻育性的基因。
4.利用RT-PCR检测野生型植株中OsRPAla基因的表达模式，结果表明OsRPAla基因在不同发育阶段的穗中都有很高的表达，在叶、叶鞘、茎和根中也有不同程度的表达。
5.本发明利用整体染色透明激光扫描共聚焦显微术方法观察了野生型和osrpala突变体中的胚囊的形成和发育过程，结果表明在osrpala突变体中胚囊的发育在减数分裂过程中出现异常导致内部核结构的降解。
6.本发明利用压片法观察了野生型和osrpala突变体中花粉母细胞的减数分裂过程，结果表明，osrpala突变体不育的最根本原因在于其染色体在后期I时开始出现染色体断裂的片段。
更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。
本发明的优点：
1.本发明提供了一个参与水稻减数分裂的基因OsRPAla及其编码蛋白(即本发明另外一个命名“育性控制基因”。该基因对于水稻减数分裂的研究具有重要的理论和实际应用意义，并为人工控制水稻花粉育性或胚囊育性以生产杂交种子从而满足农民或种子生产者的需要的提供了一条经济、快速、有效的途径。
2.本发明提供的参与水稻减数分裂的基因OsRPAla是真核生物中一个非常保守的基因，因此，将含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或该基因的部分类似功能的DNA片段连接上合适的启动子转入植物体进行异位表达，可以使园林植物(如悬铃木、杨树、香樟又称樟树等)不育，避免其种子或果实污染环境；也可以使瓜果(如柑橘、猕猴桃、西瓜等)无种子，从而提高其产品质量和有用的营养器官部分的产量；还可以使转基因植物的花粉和胚囊不育，消除转基因植物中外源基因逃逸的风险。本发明在农业领域具有广泛的应用前景。
3.本发明提供水稻OsRPAla杂合T-DNA插入转基因植株种子，这些杂合种子可以用于大规模生产OsRPAla纯合T-DNA插入突变体相关材料(包括愈伤组织、原生质体和植株)。
附图说明
图1：是osrpala突变体的表型鉴定。
图1a：是成熟期时不育株与野生型水稻植株形态比较：左为野生型，右为不育突变体：
图1b和图1c：是野生型的小花；图1b和突变体的小图1c在外观上没有差别；
图1d和图1e：是I₂-KI染液中野生型花粉；图1d和突变体花粉(见图1e)的育性检测。(Bar＝200uM)。
图2：是OsRPAla基因的相关分析
图2a：是OsRPAla的基因结构和T-DNA插入位置示意图。黑色线条、黑色方框和白色方框分别代表基因的内含子、开放阅读框(ORF)和3’及5’非翻译区(UTR)；倒黑色三角代表T-DNA；箭头代表(c)中所用的引物O₁，O₂及LBT₃和(b)与(d)中所用的引物RTL及RTR的位置。
图2b是RT-PCR分析OsRPAla在野生型(W)和突变体(M)中的表达，结果表明OsRPAla在突变体中的表达被严重破坏。以Actin做为内标。
图2c：是一个OsRPAla T-DNA插入杂合植株后代的基因型检测。
图2d：是OsRPAla基因的表达谱检测。L，Sh，S，R分别代表孕穗期时的叶、叶鞘、茎和根；P₁-P₉代表不同长度的稻穗：P₁：～0.5cm；P₂：～1.0cm；P₃：～2.0cm；P₄：～3.5cm；P₅：～4.5cm；P₆：～11cm；P₇：～16.5cm；P₈：～19cm；P₉：～22cm。以Actin做为内标。
图3：显示利用RNAi抑制野生型水稻中内源OsRPAla的表达可以使水稻育性降低。图中：
图3a：是65个独立转化单株转基因当代(T₀代，下同)的育性，白色的柱子代表PCR阴性单株，每个单株考察3个穗子的育性，图中数据表示3个穗子育性的平均值，bar代表标准误；
图3b：是57个PCR阳性单株T₀代的育性分布图；
图3c和图3d：是利用RT-PCR(见图3c)或real-time PCR(见图3d)检测部分单株的内源OsRPAla基因的表达量，PCR阴性单株(编号为31)作为对照；
图3e：是一个RNAi单株T₁代的育性结果，图中数据表示3个穗子育性的平均值，bar代表标准误；
图3f：是图3e图中的单株的PCR检测结果，所用引物为RNAi载体特异的引物；
图4：是Osrpala突变体的互补检测情况
在互补实验中，申请人利用农杆菌介导的基因转化方法(将在实施例中具体述及)将来源于“日本晴“(一个报道的水稻品种)BAC文库中包含完整OsRPAla基因和上游2.7kb和下游3.4kb的片段转入osrpala突变体的愈伤。共获得32株独立转化植株(苗)，PCR检测显示有6株为阴性，26株阳性植株17株表现不同程度的育性恢复；6株阴性单株4株转空载体pCAMBIA2301的对照植株仍然不育。用pCAMBIA2301载体上一段特异的片段做探针检测了部分育性恢复单株的拷贝数，并挑选了2个单拷贝单株考察其T₁代的育性。图中数据表示3个穗子育性的平均值，bar代表标准误；
图4a：是17株互补成功单株T₀代的育性；
图4b：是一个单拷贝单株的T₁代的育性；
图4c：是图4b图中单株的基因型检测；
图5：是野生型(图5a-图5j)和突变体(图5k-图5o)的胚囊发育与形成过程；图中：
图5a：是孢原细胞形成期。孢原细胞(箭头所示)在珠心表皮下的一层细胞分化形成；
图5b：为大孢子母细胞形成期。孢原细胞继续发育形成大孢子母细胞(箭头所示)；
图5c：是大孢子母细胞减数分裂期。大孢子母细胞进行减数分裂形成四分体(箭头所示)；
图5d：是功能大孢子形成期。近珠孔端的三个大孢子(箭头所示)相继退化，只留下合点端的一个大孢子；
图5e：是单核胚囊形成期。胚囊中的功能大孢子继续发育形成单核胚囊；
图5f：是图5g，图5h胚囊有丝分裂期；胚囊中的核进行三次有丝分裂，依次形成二核胚囊(见图5f)、四核胚囊(见图5g)和八核胚囊(见图5h)；
图5i：是八核胚囊发育期。胚囊两端各有一个核(原极核)移向囊腔的中央形成极核。
图5j：是胚囊成熟期。细胞壁在原极核、珠孔端和合点端各自剩余的三个核外形成，成熟的胚囊中可见极核(PN)，反足细胞(AN)和助细胞(SY)；
图5k：是大孢子母细胞形成期。osrpala突变体中孢原细胞也能正常形成并发育形成大孢子母细胞。
图5l：是(图5m)大孢子母细胞减数分裂期。在此时期，osrpala突变体中的大孢子母细胞减数分裂形成的四分体的核极其不清晰，而且四分体的核全部开始降解。
图5n：是功能大孢子形成期。四个大孢子全部退化，没有功能大孢子形成。
图5o：是胚囊成熟期。osrpala突变体的成熟胚囊中没有正常的七胞八核结构，取而代之的是一些降解的核的痕迹。
图6：是野生型(a-e，k-o)和osrpala突变体(f-j，p-t)中花粉母细胞的减数分裂过程
图6a和图6f---细线期；图6b和图6g---偶线期；图6c和图6h---粗线期；
图6d和图6i---双线期；图6e和图6j---终变期；图6k和图6p---中期I；
图6l和图6q---中期I/后期I转换期；图6m和图6r---后期I；
图6n和图6s---中期II；图6o)和图6t---新形成的花粉四分体。标尺＝30uM。
具体实施方式
本发明是利用本申请人所在作物遗传改良国家重点实验室构建的水稻T-DNA随机插入的突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)，通过正向遗传学的方法分离并克隆影响水稻减数分裂的基因OsRPAla。突变体库的构建是按照Wu等.所描述的方法构建而成(见Wu等.Development of enhancer trap lines for functionalanalysis of the rice genome.Plant J，2003，35：418-427)。为进一步理解本发明的内容与目的，下面就以实施例详细介绍本发明的具体技术实施步骤。
实施例1：突变体的筛选和性状鉴定
突变体库T₀代植株分别分单株收种后，在正常栽培条件下种植下一代即T₁代，每份材料种2行，每行10株，共20株，按15×24cm的栽种密度进行种植。在水稻整个生育期田间记载突变体的表型，对于同一家系内突变植株的表型一致、符合典型的3∶1分离的家系及时抽提各单株的DNA进行PCR阳性检测，对于一个家系内的所有突变体单株PCR均为阳性的家系作为后续研究的材料。PCR阳性检测的引物位于T-DNA区段上，一对引物分别是GV-F：5-ggc atc ggt aaa cat ctg ct-3，GV-R：5-gcc tca aga agc tca agt gc-3，PCR产物大小为611bp，反应体系的总体积为20μl，DNA1模板1ul(约50ng)、1×rTaq酶反应缓冲液、25mMMgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶(购自Takara公司)。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。
通过本例得到一个突变体，发明人将其命名为osrpala，该突变体从外观上看在营养生长期与野生型对照没有任何区别。在生殖生长时期，该突变体osrpala与对照在抽穗期、穗型、小花的形态及内部结构等方面也没有明显差别(见图1a，b，c)，但在成熟期，突变体表现为完全不育，如图1a右所示，而对照如图1a左所示。取抽穗期的花粉用1％的I₂-KI染色后，显微观察如图1d及图1e所示，其中图1d为对照株的花粉染色结果，所有花粉都着色，且花粉粒呈正常的圆形，图1e为突变体osrpala的花粉染色结果，统计表明在1051个花粉中，有574个花粉不着色，占总数的54.6％，且花粉粒皱褶，形态不正常，表明该突变体的部分雄配子是不育的。
利用整体染色透明激光扫描共聚焦显微术方法(参照郭海滨等，利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体水稻胚囊形成与发育的进一步观察，激光生物学报，2006(15)111-117所示方法和步骤)，观察了成熟胚囊的结构，结果表明，野生型的成熟胚囊中有正常的位于中央的极核，近珠孔端的助细胞和远珠孔端的反足细胞团等显微结构(图5j)。但是，我们观察到的100多个osrpala突变体的囊腔都很小，而且在囊腔内只有一些降解的核的痕迹(图5o)。以上结果表明osrpala突变体的雄性半不育，而雌性完全不育。为证实这个结论，申请人做了野生型和突变体的正反交，结果如表1，证实osrpala突变体的花粉的确有育性，而胚囊则完全不育。
表1野生型和突变体的正反交结果

实施例2：突变体T-DNA侧翼水稻基因组序列的分离
针对实施例1中得到的突变家系，本实施例利用TAIL-PCR方法(参照Zhang等，Non-random distributionof T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flankingsequences from an enhancer-trap mutant library.2007，Plant J，49：947-959所示方法和步骤)分离了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列。
通过本例得到该家系T-DNA的插入位点的侧翼序列，并用Rice Genome Annotation Project网站上提供的balast检索工具(http://rice.plantbiology.msu.edu/blast.shtml)，将分离到的侧翼序定位于水稻第2号染色体的Os02g53680基因的内含子中。如图2a所示，在KOME网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中有一个全长cDNA J033031B02与之对应。OsRPAla基因的结构如图2a所示，由2个外显子和1个内含子组成。该基因编码的蛋白与其它真核生物的RPA蛋白有很高的同源性，表明该基因是水稻中的RPA1基因
TAIL-PCR分离得到osrpala突变体的侧翼序列如下：
AAAACGTGCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATATGGTCACAAACGGTATATGGGGTGGAATCATTGGCCGGAGTGCACTGAGCATGGCCTGCATCACAATACTGGGCGAGCGCTTCCCAAATAATGAATGGGCTGGCATAAGTATTAACGATTCCATAATAGTGGGATATATGGGCTTGGGTAGCCTTTGGTGTTCGCCATTTCTGGCAGTTAACATGTTAAACAATGAAGGAAATTTGGGCAGTTGGACTACTACACACTTTACAGGGTTGTCTGATTTAGTTCACTAATTTAGTTGTGTGCCTTTGTTTCTCCACTACAGTTGAACGGATGGATACTCTGAGTTTTTCCCCTCCTTGCTGTATTCAGGAGAACGGGGTTTGTTTGTTTTAAACCATAGTGCATAAACCGCTTGTAAACTTGTACTACTATAGTATTTAAGTTCTTAAACTTAAAAAACATATTTTTTTTCTTTAAACTCCTTTACGGTACATGACATATCCAAATCGTATTTGACCCGATCAACTCACAAACGTCGTCTGTCAATGTAAAGGGGTGGAGACCTTCC
实施例3：T-DNA与突变性状的共分离验证
根据实施例2得到的突变体Osrpala家系T-DNA定位结果，设计基因组引物O₁(5’-agc gag tac gtc atcaac ga-3’)和O₂(5’-ccg aaa caa gaa ctt cca gg-3’)与T-DNA左边界上引物LBT₃(5’-cca gta cta aaa tcc aga tccccc gaa t-3，)配对扩增验证T1代及T2代各单株的基因型，如图2c所示。并将基因型与表型对应，看是否符合共分离。引物O₁+O₂的产物大小约为1.1kb，引物O₂+LBT₃的产物大小约为0.9kb，由于T-DNA转入基因组的片段约有10kb，所以当T-DNA插入O₁与O₂之间，则由于片段过大而不能扩增。因此，当一个单株分别用引物O₁+O₂及引物O₂+LBT₃扩增后出现三种情况，情况1：O₁+O₂有目标带扩增，而O₂+LBT₃则没有；情况2：O₁+O₂及O₂+LBT₃都有目标带扩增；情况3：O₁+O₂没有目标带扩增，而O₂+LBT₃则有目标带扩增。该三种情况分别对应三种基因型，即情况1为野生型(W)，该位点没有T-DNA的插入；情况2为杂合型(H)；情况3为突变型(M)。基于以上所述，该家系T1代20株单株的基因型如图2c所示。其中属于野生型单株有：13；属于杂合型单株有1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、18、19、20；属于突变型单株有2、16、17。该家系T₁代突变性状为2、16、17完全不育。T-DNA插入水稻基因组，造成内源基因的失活，往往在转化当代T₀代看不到突变表型，而在T₁中出现3∶1的分离，其中约1/4的单株由于突变位点的纯合而可能表现出突变表型。由此可见，该家系T₁分离群体的完全不育的突变表型与基因型完全对应。且该突变属于单基因控制的隐性突变。
由于T₁代家系单株较少，为进一步验证该家系的突变表型与基因型的对应关系，将从T₁代单株收获的种子进行T₂代共分离检测。在T₂代中种植T₁代的第13号野生基因型单株后代及第1、6、9号杂合基因型单株的后代，每株系种40株，种植方式及表型观察同T₁代。结果T₂代的突变表型与T₁代观测到的突变表型完全一致且与基于PCR检测的基因型完全对应，也即是所有野生型单株后代都是野生型基因型，正常表型；所有杂合型单株的后代都有突变分离，且分离后的突变表型与基因型也完全对应。
由此可见，该家系的完全不育的突变性状与T-DNA的插入纯合基因型共分离，证明OsRPAla基因的突变是造成植株不育的根本原因。
实施例4：RT-PCR验证OsRPAla基因的表达模式
申请人用半定量RT-PCR(Reverse-transcript PCR)的方法分析该基因的表达模式，RT-PCR所用引物RTL(5’-gtt gat gac gta ctc gct ga-3’)位于Exon1上，引物RTR(5’-tgg ctg gac tgt tgg ttg ga-3’)位于Exon2上，如图2a所示。其中RTL+RTR扩增反转录产物的产物大小为320bp。由于突变体Osrpala的突变株与对照单株在株高，分蘖数，叶色，叶形等方面没有差别，而在生殖生长时影响花粉的发育，因此样品取于抽穗期的根、茎、叶、叶鞘、稻穗。RT-PCR的程序如下：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 32cycles，72℃延伸5min，RT-PCR的检测结果如图2d所示。由此可见，抽穗期时OsRPAla基因在根、茎、叶、叶鞘和不同发育时期的穗子中都有表达。此外，申请人还检测了突变体中RPAla基因的表达量，如图2b所示，该基因在突变体的穗中的表达量急剧下降，表明T-DNA的插入严重影响了该基因的正常表达。
实施例5：RNAi(RNA干涉)载体转化验证OsRPAla基因功能
根据该基因的结构，在OsRPAla基因的3’末端设计一对RNAi引物RNAi-F(5’GTG act agt ggt accACG CAC TTA AGG AGC GCG AG-3’；)和RNAi-R(5’-GGG gag ctc gga tcc AAG CTG ATA CAT TAA GTGGC GT-3’，下划线表示加的酶切位点)从FL-cDNA克隆J033031B02(Maruyama and Sugano 1994.Oligo-capping：a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides.Gene 138：171-174；Suzuki，等.1997 Construction and characterization of a full length-enriched and a5′-end-enriched eDNA library.Gene 200：149-156)中扩增出该片段，并按照(Chu，等.2006.Promoter mutationsof an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice.Genes Dev 20：1250-1255)描述的方法构建RNAi载体。PCR反应体系的总体积为20μl，FL-cDNA质粒模板0.1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位rTaq酶(购自Takara公司)。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、53℃80s、72℃60s 30cycles，72℃延伸7min。构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，转化水稻粳稻品种中花11号(Hiei等，Efficient transformationof rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)。
农杆菌介导的遗传转化步骤如下：
1.愈伤组织诱导
(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇浸泡1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)浸泡15分钟；
(2)灭菌水洗种子4-5次；
(3)将种子放在诱导培养基上；
(4)置于黑暗处培养4周，温度24-26℃。
2.愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度24-16℃。
3.预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养5天，温度24-26℃。
4.农杆菌培养
(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，温度28℃；
(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
5.农杆菌侵染
(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；
(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；
(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡20分钟；
(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
6.愈伤洗涤和选择培养
(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
(2)浸泡在含500ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；
(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为500ppm，第二次以后为300ppm，潮霉素每次均为250ppm)
7.分化
(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；
(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
8.生根
(1)剪掉分化时产生的根；
(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
9.移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
通过本例申请人得到70株独立转化苗，后来有5株死亡，剩余65株的育性如图3a所示，在这65株中有阳性转化苗55株，其中完全不育的有6株，占总数的10.9％；育性介于0到10％的共有21株，占总数的38.2％；育性大于10％的共有28株，占总数的50.9％(图3b)。申请人选取了部分单株检测其内源RPAla的表达量，如图3c和3d所示，realtimePCR及RT-PCR结果显示在RNAi抑制单株中，内源RPAla的表达量都有不同程度的下降。申请人还考察了部分低育性单柱的后代的育性和RNAi载体的共分离情况，如图3e和f所示，结果表明，在T₁代，它们的低育性是和RNAi载体共分离的。
由此可见，通过RNAi技术抑制野生型水稻中内源OsRPAla基因的表达后造成了水稻植株的育性的明显降低，进一步证明了OsRPAla基因为控制水稻育性的基因，并由此方法可以调控植物的育性，用于实际生产。
实施例6：互补实验验证OsRPAla基因功能
根据OsRPAla基因的序列(NCBI登录号：ref|NC 008395.1|的32851709bp至32854738bp)，在网站(http://www.genome.arizona.edu)上找到包含该基因的“日本晴”BAC克隆OSJNBa0075N09并提取“日本晴”BAC克隆OSJNBa0075N09质粒5μg，使用限制性内切酶Xba I和Kpn I完全酶切质粒后，用透析袋电洗脱法(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，《分子克隆实验指南》.2002，科学出版社，第二版，321-322页)回收包括整个OsRPAla基因的9.7kb长目标片段，然后用Xba I和Kpn I酶切后的载体质粒pCAMBIA2301(空载体质粒来源于国际农业分子生物学应用中心(澳大利亚)http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)连接(所使用的内切酶均购自Takara公司，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本实施例所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加800ulLB复苏45分钟，取200ul涂于含卡那霉素、X-gal及IPTG的LA平板，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考上述《分子克隆实验指南》)。挑单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆(方法同实施例3)、酶切验证及测序验证后，把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(来源于国际农业分子生物学应用中心，澳大利亚)菌株中。转化后的菌株命名为pCAMBIA2301-OsRPAla。
按照实施例5中农杆菌介导的遗传转化步骤(只是选择培养时用新霉素而非潮霉素筛选)，将pCAMBIA2301-OsRPAla菌株导入基于PCR检测的Osrpala突变体基因型背景的愈伤。按照相同的遗传转化方法将空载体质粒pCAMBIA2301导入基于PCR检测的Osrpala突变体基因型背景的愈伤，得到的转基因植株作为对照。
本发明共获得32株的独立转化苗，PCR检测显示有6株为阴性，26株阳性植株17株表现不同程度的育性恢复。此外，4株转空载体质粒pCAMBIA2301的对照植株和6株阴性植株仍然不育。互补实验T₀代转基因植株结实率统计具体情况见图4a。用southern blotting的方法检测了部分育性恢复单株的拷贝数并考察了2个单拷贝植株的后代的育性。结果如图4b和图4c所示，2个单株的育性在T₁代均恢复到中花11野生型的育性水平，且可育植株与不育植株的比例符合3∶1分离。
由此可见，通过互补实验，使osrpala突变体的不育性状得到恢复，直接证明了osrpala突变体的突变性状是由T-DNA插入到RPAla基因中引起的。
实施例7：野生型和osrpala突变体的胚囊形成和发育过程的观察
参照郭海滨等人描述的整体染色透明激光扫描共聚焦显微术方法(郭海滨等，利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体水稻胚囊形成与发育的进一步观察，激光生物学报2006.15(2)：111-117.)，申请人观察了野生型和osrpala的胚囊形成和发育过程。在野生型中，孢原细胞在珠心的一层表皮下细胞形成(孢原细胞形成期，图5a)，然后，在大孢子母细胞形成期(图5b)，孢原细胞伸长长大形成大孢子母细胞。接着，在大孢子母细胞减数分裂期(图5c)，大孢子母细胞进行减数分裂形成四个直线排列的大孢子，然后，在功能大孢子形成期(图5d)，近珠孔端的三个大孢子相继退化最后留下合点端的大孢子，即功能大孢子。在单核胚囊形成期(图5e)，功能大孢子伸长长大，接着在胚囊有丝分裂期，功能大孢子进行三次有丝分裂，依次形成二核胚囊(图5f)、四核胚囊(图5g)和八核胚囊(图5h)。在八核胚囊发育期(图5i)，两边各有一个核移向胚囊中间形成极核，最后在胚囊成熟期(图5j)，胚囊增至最大，里边有反足细胞、极核和助细胞。
osrpala突变体中，在大孢子母细胞形成期(图5k)，突变体能形成正常的大孢子母细胞，但是，大孢子母细胞减数分裂形成的四个大孢子最后都会降解而不能形成正常的功能大孢子(图5l，m，n)。两个突变体的胚囊发育至此基本终止，看不到功能大孢子以后的发育时期，到了成熟胚囊时期，在突变体的胚囊中，只能看到很小的胚囊腔和一些降解的核的痕迹(图5o)。
实施例8：野生型和osrpala突变体的花粉母细胞减数分裂过程的观察
突变体的胚囊形成和发育过程暗示它们的减数分裂过程不正常。为深入揭示减数分裂发生异常的时期，利用压片法(参照《植物细胞减数分裂过程的观察》。见卢龙斗等主编，《遗传学实验技术》，2007，科学出版社，7-12页所示方法和步骤)观察了野生型和osrpala花粉母细胞的减数分裂过程。野生型中，在细线期(图6a)，染色质浓缩为细而长的细线；在偶线期(图6b)，同源染色体靠近并开始联会；到了粗线期(图6c)，染色质进一步缩短变粗，同源染色体完成联会，在光学显微镜下呈较粗的线状结构。形成双价体，双价体的每一染色体含有两条染色单体；进接着，在双线期(图6d)，染色体继续变短变粗，此时，可在染色单体间看到交叉结，交叉结的出现是发生交换的有形结果；到了浓缩期(图6e)，染色体螺旋化程度更高，在光学显微镜下，用卡宝品红染色的浓缩期染色体染色非常深；接着，分裂进入中期。中期I时(图6k)，各个双价体排列在赤道板上；在末期I(图6m)，双价体中的同源染色体彼此分开，移向两极，然后，细胞质分裂，形成二分体。二分体中的每个细胞再进行一次分裂，形成四分体(图6n)，至此，减数分裂过程完成。四分体小孢子继续发育形成花粉粒。
在osrpala中，减数分裂前期I各个时期的染色体行为和野生型没有形态上的区别，它们也同样在细线期时凝缩成细丝状(图6f)，并在偶线期时开始联会(图6g)，在粗线期时联会完毕(图6h)，此时的染色体也呈现明显的粗线状。接着，在双线期(图6i)染色体继续凝缩，并在浓缩期(图6j)时形成二价体，到了中期I(图6p)，二价体排列在赤道板上。但是，在后期I以后的时期都可以看到细胞中许多断裂的染色体片段(图6q-s)。
本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：
(1)试剂和溶液缩写
6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；G-418(新霉素)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)
(2)组织培养的溶液配方
1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]
硝酸钾(KNO₃)           28.3g
磷酸二氢钾(KH₂PO₄)     4.0g
硫酸铵((NH₄)₂SO₄)      4.63g
硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)    1.85g
氯化钙(CaCl₂·2H₂O)    1.66g
逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。
2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]
碘化钾(KI)             0.08g
硼酸(H₃BO₃)            0.16g
硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)    0.44g
硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)    0.15g
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
3)Fe₂EDTA贮存液(100X)
在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g
在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g，将它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)
烟酸(Nicotinic acid)                0.1g
维生素B1(Thiamine HCl)              0.1g
维生素B6(Pyridoxine HCl)            0.1g
甘氨酸(Glycine)                     0.2g
肌醇(Inositol)                      10g
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MSmax母液(10X)
硝酸铵(NH₄NO₃)            16.5g
硝酸钾                    19.0g
磷酸二氢钾                1.7g
硫酸镁                    3.7g
氯化钙                    4.4g
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
6)MSmin母液(100X)
碘化钾                         0.083g
硼酸                           0.62g
硫酸锰                         0.86g
钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)          0.025g
硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)            0.0025g
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液(1mg/ml)
2，4-D  100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃保存。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)
6-BA  100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃保存。
9)NAA贮存液(1mg/ml)
NAA  100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
10)IAA贮存液(1mg/ml)
IAA  100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)
葡萄糖    125g
蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液
AS      0.392g
DMSO    10ml
分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
氢氧化钾    5.6g
蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃保存备用。
(3)培养基配方
1)诱导培养基
N6max母液(10X)          100ml
N6min母液(100X)         10ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    10ml
维生素贮存液(100X)      10ml
2，4-D贮存液            2.5ml
脯氨酸(Proline)         0.3g
CH                      0.6g
蔗糖(Sucrose)           30g
Phytagel                3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
N6max母液(10X)              100ml
N6min母液(100X)             10ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)        10ml
维生素贮存液(100X)          10ml
2，4-D贮存液                2.0ml
脯氨酸                      0.5g
CH                          0.6g
蔗糖                        30g
Phytagel                    3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
N6max母液(10X)             12.5ml
N6min母液(100X)            1.25ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       2.5ml
维生素贮存液(100X)         2.5ml
2，4-D贮存液               0.75ml
CH                         0.15g
蔗糖                       5g
琼脂粉(Agarose)            1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X)             12.5ml
N6min母液(100X)            1.25ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       2.5ml
维生素贮存液(100X)         2.5ml
2，4-D贮存液               0.75ml
CH                         0.2g
蔗糖                       5g
琼脂粉                     1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X)             5ml
N6min母液(100X)            0.5ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       0.5ml
维生素贮存液(100X)         1ml
2，4-D贮存液               0.2ml
CH                         0.08g
蔗糖                       2g
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(10X)            25ml
N6min母液(100X)           2.5ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      2.5ml
维生素贮存液(100X)        2.5ml
2，4-D贮存液              0.625ml
CH                        0.15g
蔗糖                      7.5g
琼脂粉                    1.75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的新霉素(G-418)或潮霉素(Hgromycin)和500ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X)            25ml
N6min母液(100X)           2.5ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)      2.5ml
维生素贮存液(100X)        2.5ml
6-BA贮存液                0.5ml
KT贮存液                  0.5ml
NAA贮存液                 50μl
IAA贮存液                 50μl
CH                        0.15g
蔗糖                      7.5g
琼脂粉                    1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的新霉素(G-418)或潮霉素(Hgromycin)和300ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
N6max母液(10X)              100ml
N6min母液(100X)             10ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)        10ml
维生素贮存液(100X)          10ml
6-BA贮存液            2ml
KT贮存液              2ml
NAA贮存液             0.2ml
IAA贮存液             0.2ml
CH                    1g
蔗糖                  30g
Phytagel              3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(10X)          50ml
MSmin母液(100X)         5ml
Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    5ml
维生素贮存液(100X)      5ml
蔗糖                    30g
Phytagel                3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml管)，封口灭菌。
<110>华中农业大学
<120>水稻OsRPAla基因在育性控制中的应用
<130>
<141>2009-05-26
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3030
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(3030)
<223>
<220>
<221>exon
<222>(1341)..(3027)
<223>
<220>
<221>exon
<222>(1)..(281)
<223>
<400>1
atg gcg atg gcg agg ctg acg ccg aac ggc gtg gcg gcg gcg ctg gcg    48
Met Ala Met Ala Arg Leu Thr Pro Asn Gly Val Ala Ala Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
ggg gac acg aac ctg aag ccg gtg ctg cag atc gtc gag ctg cgg ggc    96
Gly Asp Thr Asn Leu Lys Pro Val Leu Gln Ile Val Glu Leu Arg Gly
            20                  25                  30
gtc cag gtc aac ggc gcg ggc gtc acg cgc ggg gag agg ttc cgg gcg    144
Val Gln Val Asn Gly Ala Gly Val Thr Arg Gly Glu Arg Phe Arg Ala
        35                  40                  45
gtg gtc tcc gac ggc acc gcc gcg tcc tcc gcg ctc ttc gcc gcg cag    192
Val Val Ser Asp Gly Thr Ala Ala Ser Ser Ala Leu Phe Ala Ala Gln
    50                  55                  60
ctc agc gac cac gcc cga tcc ggc gcc ctc cga cgc ggc agc att gtg    240
Leu Ser Asp His Ala Arg Ser Gly Ala Leu Arg Arg Gly Ser Ile Val
65                  70                  75                  80
cag ctc agc gag tac gtc atc aac gaa gtc ggc ccc aga ag             281
Gln Leu Ser Glu Tyr Val Ile Asn Glu Val Gly Pro Arg Arg
                85                  90
gttttgttgc ctcctcctcc actttccccc ccattcccct gcctctgatc gatgtgtgat    341
tgcgtgcgat ttttggcccg tttcgtttta gggttcatgc ttgcccctgg ttttatgtgt    401
gtcagtctgc gtgtggttta gattcccgct ttcagctagt ttgcaattta aattaatact    461
tagtacttgc cattctgttg gtaaattgtc gatgagcttc atgtttccta ctagatacta    521
gtagaggtgc atcaaaattt ttctgacaat ggttttgttt atgacatcat ttgatcggtg    581
cttgttaacc atttgtccaa ttgattttaa ttctgatttg aattattatt gtcagaaaga    641
ggcctcggta ttgcagtact aateagtggt aactaaggct gtcctgtgac acaaattggt    701
gtttgtcgat actcagtagt taattggctg gcattagtat taacgattac aaaatagtgt    761
gatatatgtg cttgggtagc ctttggtgtt cgccatttct ggcaggtagc atgtcaaacg    821
atgaaggtaa tatggtcagt ttgactacta cacactttac agtgttgtct gatttagttc    881
actaatttag ttgtgtgcct ttttttctct agccaacaaa tcgccatgtt tgggtgcatc    941
gatttggcca atgtagttag atattgatca gcattaatgc tgcaactgtc tggtgctgtg    1001
aacagtttgg gtctaagtac taagtatttt ttatctttta gctgtagcca ttcagttcaa    1061
cacaacaccg tactaaatgc atttcttttg tatctggttc ataagtaatt ggaagcatag    1121
ttgtgtccat tcaaatcatg ttggcaaggc gacaaatgca aaagtgaaga taagtttctg    1181
accaaaaggt gttgtaatta aacatagtat tcatgtagca gtgtgaatca tcatattctg    1241
agccttttgc attcttattt tcaactgatc tactggttga tagagcagaa tcaagaattg    1301
ttttttgttg gttgagctga cttgttgcaa tacctgtag g att att gtc att ctg     1356
                                             Ile Ile Val Ile Leu
                                             95
aac ctg gaa gtt ctt gtt tcg gag tgt gag ata att ggg aat cct aca      1404
Asn Leu Glu Val Leu Val Ser Glu Cys Glu Ile Ile Gly Asn Pro Thr
100                 105                 110                 115
gcg ctt tca gaa act gga tct cct atc cca aat ccg aca aga gta gag      1452
Ala Leu Ser Glu Thr Gly Ser Pro Ile Pro Asn Pro Thr Arg Val Glu
                120                 125                 130
caa ttt aac gga gca cct caa tat ggt ttg atg gca ggg aac tca tca      1500
Gln Phe Asn Gly Ala Pro Gln Tyr Gly Leu Met Ala Gly Asn Ser Ser
            135                 140                 145
aat aca acc aca aag cct agt gac aat gtt cca ttg ttc caa aat tcg      1548
Asn Thr Thr Thr Lys Pro Ser Asp Asn Val Pro Leu Phe Gln Asn Ser
        150                 155                 160
atg gca gga aac tcc tct aac ttt gcc act agg ccc agt gac aaa gtt      1596
Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ala Thr Arg Pro Ser Asp Lys Val
    165                 170                 175
ccg gtc ttc caa cca aca gtc cag cca tct tat cgc cct gca cct aat      1644
Pro Val Phe Gln Pro Thr Val Gln Pro Ser Tyr Arg Pro Ala Pro Asn
180                 185                 190                 195
tac aaa aac cat gga gca atc atg aaa aat gaa gcc cct gct aga ata      1692
Tyr Lys Asn His Gly Ala Ile Met Lys Asn Glu Ala Pro Ala Arg Ile
                200                 205                 210
atc ccc ata tct gct tta aat cct tat caa ggc cgc tgg gct atc aag      1740
Ile Pro Ile Ser Ala Leu Asn Pro Tyr Gln Gly Arg Trp Ala Ile Lys
            215                 220                 225
gct aga gtt act gcc aag gga gat atc cgc cga tac cat aat gct aaa      1788
Ala Arg Val Thr Ala Lys Gly Asp Ile Arg Arg Tyr His Asn Ala Lys
        230                 235                 240
ggt gat ggg aaa gta ttc tct ttt gac ttg ctt gat tct gat ggg gga    1836
Gly Asp Gly Lys Val Phe Ser Phe Asp Leu Leu Asp Ser Asp Gly Gly
    245                 250                 255
gag ata cgg gtg aca tgc ttc aat gct ctt ctt gat cga ttc tat gaa    1884
Glu Ile Arg Val Thr Cys Phe Asn Ala Leu Leu Asp Arg Phe Tyr Glu
260                 265                 270                 275
gtt gtg gaa gtt ggt aag gtc tat gtg gta tca aga gga aac ttg aga    1932
Val Val Glu Val Gly Lys Val Tyr Val Val Ser Arg Gly Asn Leu Arg
                280                 285                 290
cct gca cag aag aac tat aac cat ctt aac aat gag tgg gag att tta    1980
Pro Ala Gln Lys Asn Tyr Asn His Leu Asn Asn Glu Trp Glu Ile Leu
            295                 300                 305
ttg gag aat gga tca act gtg gat ctt tgt cct gat gag aac agt tcc    2028
Leu Glu Asn Gly Ser Thr Val Asp Leu Cys Pro Asp Glu Asn Ser Ser
        310                 315                 320
att ccc acc cag cgg ttt gac ttc aga ccg atc aat gaa att gag gat    2076
Ile Pro Thr Gln Arg Phe Asp Phe Arg Pro Ile Asn Glu Ile Glu Asp
    325                 330                 335
gcc cag aac aat gct atc ctt gac atc ata ggt gtt gtt aca tcg gtc    2124
Ala Gln Asn Asn Ala Ile Leu Asp Ile Ile Gly Val Val Thr Ser Val
340                 345                 350                 355
aat cct tgc acc aca ata cag agg aaa aat ggc atg gaa act cag aaa    2172
Asn Pro Cys Thr Thr Ile Gln Arg Lys Asn Gly Met Glu Thr Gln Lys
                360                 365                 370
aga act atg aac ctg aag gat atg tct ggt cga agt gtt gag gta acc    2220
Arg Thr Met Asn Leu Lys Asp Met Ser Gly Arg Ser Val Glu Val Thr
            375                 380                 385
atg tgg ggt gac ttt tgc aac aga gaa ggc tca cag ctt caa gga atg    2268
Met Trp Gly Asp Phe Cys Asn Arg Glu Gly Ser Gln Leu Gln Gly Met
        390                 395                 400
gtt gaa cgt ggg atc ttt cct gtg ctg gct gtc aaa gca gga aaa gtg    2316
Val Glu Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Ala Val Lys Ala Gly Lys Val
    405                 410                 415
agt gat ttc agt ggc aag tct gtc ggc aca att tct tca act cag ctc    2364
Ser Asp Phe Ser Gly Lys Ser Val Gly Thr Ile Ser Ser Thr Gln Leu
420                 425                 430                 435
ttc atc aac cct gat tct gct gaa gct cat agt ctc agg caa tgg ttt    2412
Phe Ile Asn Pro Asp Ser Ala Glu Ala His Ser Leu Arg Gln Trp Phe
                440                 445                 450
gat agt gga gga aga gat gct tct act cag tcc ata tcc aga gat atc    2460
Asp Ser Gly Gly Arg Asp Ala Ser Thr Gln Ser Ile Ser Arg Asp Ile
            455                 460                 465
acg cct gga gca tca agg aat gag atc cga aag aca gta gca cag atc    2508
Thr Pro Gly Ala Ser Arg Asn Glu Ile Arg Lys Thr Val Ala Gln Ile
        470                 475                 480
aag gat gaa ggt ctt gga atg ggg gac aaa cct gac tgg att acg gtg    2556
Lys Asp Glu Gly Leu Gly Met Gly Asp Lys Pro Asp Trp Ile Thr Val
    485                 490                 495
aaa gcc acc gtt ata ttc ttc aag aat gag tcc ttc ttc tac aca gct    2604
Lys Ala Thr Val Ile Phe Phe Lys Asn Glu Ser Phe Phe Tyr Thr Ala
500                 505                 510                 515
tgc cct aac atg att ggc gac agg cag tgc aat aag aag gtg aca aag    2652
Cys Pro Asn Met Ile Gly Asp Arg Gln Cys Asn Lys Lys Val Thr Lys
                520                 525                 530
agt act aat ggc aat tgg acc tgt gac aaa tgc gat agg gag ttt gaa    2700
Ser Thr Asn Gly Asn Trp Thr Cys Asp Lys Cys Asp Arg Glu Phe Glu
            535                 540                 545
gag tgc gac tac agg tat ctc ctg cag ttt cag att caa gat cac tcg    2748
Glu Cys Asp Tyr Arg Tyr Leu Leu Gln Phe Gln Ile Gln Asp His Ser
        550                 555                 560
gga aca gct tgg gtg aca gca ttc cag gag gct ggg cag gag ttg ctt    2796
Gly Thr Ala Trp Val Thr Ala Phe Gln Glu Ala Gly Gln Glu Leu Leu
    565                 570                 575
ggc tgc tcg gca aca gag ctc aac gca ctt aag gag cgc gag gac cct    2844
Gly Cys Ser Ala Thr Glu Leu Asn Ala Leu Lys Glu Arg Glu Asp Pro
5805                 85                 590                 595
cgg ttt gca gac acc atg ctc aat tgc ttg ttt cag gaa tat ctg ctc    2892
Arg Phe Ala Asp Thr Met Leu Asn Cys Leu Phe Gln Glu Tyr Leu Leu
                600                 605                 610
agg ctg aag gtc aaa gaa gaa tca tac ggc gat gag cgc aaa gtg aag    2940
Arg Leu Lys Val Lys Glu Glu Ser Tyr Gly Asp Glu Arg Lys Val Lys
            615                 620                 625
aac acc gcg gtc aaa gtg gag aag gtt gat cct tcg ggt gaa agt aaa    2988
Asn Thr Ala Val Lys Val Glu Lys Val Asp Pro Ser Gly Glu Ser Lys
        630                 635                 640
ttt ctg ctg gat ttg atc tcc aag tcc tcg gcg cta cat tag            3030
Phe Leu Leu Asp Leu Ile Ser Lys Ser Ser Ala Leu His
    645                 650                 655