一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法.pdf

本发明公开了一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，依次包括以下步骤：1)将能与靶分子发生特异性反应的特异性DNA与其cDNA充分杂交形成双链捕获探针，所述的靶分子是蛋白质类物质或离子；2)加入靶分子溶液，充分反应；3)加入摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液，反应后溶液颜色呈红色；4)加入终浓度在1～100mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。本发明的检测方法具有通用性，检测对象可以是任何蛋白质类物质或任何离子，应用范围广。并且本发明特异性好、灵敏度高，无需DNA标记，无需昂贵仪器，可廉价、快速的实现检测。

1、  一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将能与靶分子发生特异性反应的特异性DNA与其cDNA充分杂交形成双链捕获探针，所述的靶分子是蛋白质类物质或离子；
2)加入靶分子溶液，充分反应；
3)加入摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液，反应后溶液颜色呈红色；
4)加入终浓度在1～100mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。

2、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的蛋白质类物质为酶：凝血酶或溶菌酶。

3、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的离子为汞离子或氢离子。

4、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的能与靶分子特异性结合的特异性DNA为核酸适体、特异性结合离子的寡核苷酸或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。

5、  根据权利要求4所述的靶分子检测方法，其特征在于，所述的特异性结合离子的寡核苷酸为特异性结合汞离子的寡核苷酸。

6、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的能与靶分子特异性结合的DNA与其cDNA溶液的浓度各为1～50μM。

7、  根据权利要求6所述的靶分子检测方法，其特征在于，所述的能与靶分子特异性结合的DNA与其cDNA溶液的摩尔量相等。

8、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)所述的纳米金溶液的终浓度为1～100nM，纳米金粒径10～20nm。

9、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤4)所述的高盐溶液为含有盐的缓冲溶液；其中，所述的盐为：MX/M’X₂，M＝Na⁺/K⁺，M’＝Mg²⁺/Ca²⁺，X＝Cl^-/Br^-/I^-/NO₃^-/ClO₄^-；所述的缓冲体系为常规的Tris、PBS或胂酸盐体系。

10、  根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤4)所述观察溶液颜色变化的方法为目视比色法或分光光度法。

一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法
技术领域
本发明特别涉及一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法。
背景技术
核酸适体(aptamer)是指利用上个世纪末建立而发展起来的SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选技术，从随机寡核苷酸文库中筛选获得的短单链寡核苷酸配基，它能够与靶分子特异结合，从而本身发生构象变化。
通过体外筛选技术，理论上可筛选到任意物质的核酸适体，再加上高通量筛选的技术特点与核酸适体精确识别、易体外合成与修饰等特性，使得核酸适体在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景。例如，核酸适体在生物传感器的设计中具有重要作用，被应用于生物学、环境、安全等领域的检测，包括蛋白质(凝血酶、生长因子、HIV相关多肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金属离子(K⁺、Hg²⁺、Pb²⁺等)，其他新的令人兴奋的应用包括基于核酸适体的蛋白质芯片，和在蛋白质组学中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的逻辑DNA分子计算机等。
除此之外，还有一些其他的DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化。核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。
这种核酸结构在遇到相应的靶分子进行结合时通常会伴有明显的构象变化。这种结构的差异形成了基于核酸结构传感器的理论基础。一个典型的基于核酸结构的传感器包括一个双标记的寡核苷酸序列(电子传递或能量传递的受体和供体)，因此，靶分子结合导致的结构变化可以直接影响到受体和供体之间的距离，从而可以高灵敏度的检测到电信号或光信号的产生。在此基础上，核酸结构在分析化学方面的应用逐渐成为人们关注的焦点，例如，Tan等将核酸适体应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法-分子aptamer信标(MAB)，并进一步用于凝血酶和血小板源生长因子(PDGF)的检测。另外，由于核酸适体与抗体具有类似的特异结合性质，因此在ELISA、免疫学分析、Western印迹法和生物传感器等许多应用中具有更大的发展潜力，并取得初步结果。
纳米金颗粒在生物学中的应用非常广泛，目前，核酸结构-纳米复合物在分析检测中的应用也受到了关注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作组分别报道了纳米金-DNA复合物的重要应用，并将其发展为基于纳米结构的新型检测平台。通过深入了解金胶独特的光学和电学性质，Mirkin等人随后发展了一系列方法对DNA和蛋白质进行超微量检测。他们的方法依赖于巯基DNA探针在金胶表面的修饰，当加入靶时，可以引起金胶的团聚或解聚，从而引起宏观上颜色的红-蓝变化。
基于纳米金和核酸结构的分析检测方法也已受到关注。Huang等用纳米金颗粒(GNPs)与核酸适体5’端的-SH直接作用形成的结合物(即Apt-AuNPs)来检测PDGF及其受体(PDGFR)，发现由于Apt-AuNPs具有简易性和专一性，所以非常适合于蛋白质分析和癌症诊断。Parlor等还将Apt-AuNPs用于光学检测凝血酶。Dwarakanath等将荧光性能优异的半导体纳米晶粒-量子点用于标记核酸适体，开辟了量子点技术与SELEX技术联合使用的先河。Korgd等通过生物素和抗生物素的作用将前列腺专一性膜抗原(PSMA)的核酸适体连接到具有近红外发光性能的CdTe量子点上来检测前列腺癌细胞，取得了较好的结果，这给核酸适体量子点标记在活细胞及生物体内的分析检测提供了新思路。但是这些方法主要是基于纳米金和HS-DNA的组装来进行的，由于DNA需要标记，而且组装的过程较为繁琐，耗时长、成本高，不利于推广应用。
最近，Rothberg等人报道了一种利用未经过修饰的金胶检测靶DNA的比色法(H.Li，L.Rothberg，PNAS 101，14036，September 28，2004)。该法基本原理是纳米金颗粒可以和单链DNA，通过静电作用发生瞬时的吸附结合，从而可以在高离子强度条件下有效地稳定纳米金，而双链DNA则不具有这种作用。通常地，溶液中单独存在的核酸结构呈无规卷曲状态，可以吸附在纳米金表面并提高其稳定性。但是当有靶分子存在时，核酸分子会形成刚性的二级结构，不能吸附在纳米金表面。由于对靶分子进行特异性识别的DNA分子不同，形成的二级结构也有差异，例如可以形成四分体、茎环、三叶草、凸起、假结等结构。这些结构与纳米金的作用类似但是又有一定的差异，因此在具体操作过程中需要一对一的进行设计，不利于其应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是克服现有的纳米金检测靶分子的比色法中对不同的靶分子，需要对检测方案进行不同设计的缺陷，提供一种通用的纳米金检测靶分子的比色法，可以很方便地实现对任何蛋白质或离子的检测。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，可包括以下步骤：
1)将能与靶分子发生特异性反应的特异性DNA与其cDNA充分杂交形成双链捕获探针，所述的靶分子是蛋白质类物质或离子；
2)加入靶分子溶液，充分反应；
3)加入摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液，反应后溶液颜色呈红色；
4)加入终浓度在1～100mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。
本发明所述的“蛋白质类物质”是指包含氨基酸或氨基酸残基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸、糖蛋白、脂蛋白、酶、甚至整个病毒颗粒等。本发明可实现对任意蛋白质类物质和任意离子的检测。其中，所述的蛋白质类物质较佳的可为凝血酶(thrombin)或溶菌酶(lysozyme)等酶。本发明所述的离子是指带正电荷或负电荷的原子或原子团，较佳的离子为金属离子或氢离子。其中，金属离子较佳的可为汞离子。当靶分子为氢离子时，检测的是氢离子的浓度，即pH值。
较佳的，步骤1)所述的能与靶分子特异性结合的DNA可为核酸适体、特异性结合离子的寡核苷酸或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。其中，所述的特异性结合离子的寡核苷酸较佳的可为特异性结合汞离子的寡核苷酸(mercury-specific Oligonuclide，MSO)。
较佳的，步骤1)所述的能与靶分子特异性结合的DNA与其cDNA溶液的浓度各可为10～500μM。更佳的，所述的能与靶分子特异性结合的DNA与其cDNA溶液的摩尔量可以相等。
更佳的，可以对双链探针中互补序列进行适当的修饰，提高不同双链探针中cDNA结构的一致性，即使cDNA在溶液中游离时，与纳米金的结合力也保持一致，从而使得检测的准确度、重复性以及通用程度都有很大提高。
同常规，步骤1)所述的杂交形成双链捕获探针时的反应体系中可加入杂交缓冲溶液。
较佳的，步骤3)所述的纳米金溶液的终浓度可为1～100nM，纳米金粒径10～20nm。
较佳的，步骤4)所述的高盐溶液为含有盐的缓冲溶液；其中，所述的盐可为：MX和/或M’X₂，其中M为Na或K离子，M’为Mg或Ca离子，X为Cl^-、Br^-、I^-、NO₃^-或ClO₄^-；所述的缓冲体系可为常规的Tris、PBS或胂酸盐体系。
同常规，本发明可以采用水或靶分子类似物替换步骤2)中所加的靶分子溶液作为对照组。所述的靶分子类似物可以是靶分子的结构类似物或性质类似物。
较佳的，步骤4)所述观察溶液颜色变化的方法可为目视比色法或分光光度法。目视比色法可为肉眼观察：溶液颜色保持红色的，靶分子呈阳性；溶液颜色由红变蓝的，靶分子呈阴性。分光光度法可为仪器检测溶液的紫外可见光谱的变化：光谱保持不变的，靶分子呈阳性；光谱520nm处吸收降低、长波处吸收升高的，靶分子呈阴性。
本发明较佳的靶分子的检测浓度为100nM～10mM，最低检测浓度可达1pmol。
本发明整个反应的体系可控制在微升级别，较佳的反应体系的体积为5～500微升。
本发明技术方案的优化实施可表述如下，分别取2μL所述特异性DNA溶液与2μL同等浓度的cDNA溶液，并控制DNA和cDNA的终浓度为1-50μM，加入18μL的杂交缓冲溶液，室温条件下使其充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL靶分子溶液，选择合适的条件(合适的条件通常包含了合适强度的离子浓度，合适的pH等，每种靶物质的条件都不完全一致，要根据核酸结构与靶分子的条件来定)进行充分反应。同时以不加靶分子溶液一组、以及加入靶分子类似物的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入5～500μL所述的纳米金溶液，室温反应5min后，加入所述高盐缓冲溶液。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。
本发明的基本原理可总结为：利用纳米金对不同结构DNA的吸附作用不同来实现对DNA结构的区分。设计任意靶的特异性DNA-cDNA双链作为捕获探针，加入靶后释放出的cDNA以单链形式存在，靶与特异性DNA形成二级结构。由于单链DNA可以通过表面氨基吸附到纳米金颗粒表面，从而有效地保护纳米金不受外界高电解质的影响，当加入高浓度盐时，纳米金仍然呈分散状态，宏观上保持红色，而双链DNA和其它刚性的二级结构均不能吸附到纳米金表面，因此在遇到高盐时，纳米金发生聚集，宏观上呈现由红到蓝的颜色变化。本发明的检测原理图可参见图1。
相比于现有技术，本发明的优点如下：
本发明的检测方法具有通用性，应用范围广。本发明的检测对象可以是任意蛋白质类物质或任何离子，如蛋白质、多肽、氨基酸、糖蛋白、脂蛋白、酶、病毒颗粒、Hg²⁺和H⁺等。因为在理论上任何靶物质都可以通过SELEX技术寻找到特异性的核酸适体，而且自然界中还存在大量可以发生构象变化的DNA片段是基于某一特定环境和特定物质的。
本发明的检测方法具有高度特异性。因为核酸结构通常都具有非常高的亲和力，而高亲和力使得可以很方便地检测到极微量的靶分子，并将反应信号直接传输到检测元件进行读取，同时又不受其他非靶物质的干扰，实现对靶分子的特异性检测。
本发明的检测方法廉价、快速、灵敏度高。本发明利用纳米金进行比色检测，DNA无需标记，无需昂贵仪器，甚至只需通过肉眼观察溶液的颜色变化就可以判断靶分子的存在。整个反应的体系控制在微升级别，检测的灵敏度高。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和优点。
图1是本发明纳米金-核酸结构探针对靶物质的检测原理示意图。
图2是本发明纳米金反应液的紫外可见光谱图。1，凝血酶组；2，BSA组；3，空白组。
具体实施方式
下面用本发明对凝血酶、溶菌酶、汞离子和pH值(氢离子)检测的实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
紫外可见光谱检测：Hitachi UV-3010 spectrophotometer，波长范围300～800nm，用50μL石英比色皿，取50μL样品进行测量。
本发明实施例中所用纳米金颗粒参考文献(S.Dwarakanath et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications 325，739，2004)制备。具体步骤如下，将100mL 0.01％(w/w)的氯金酸溶液加热到沸腾后，在剧烈搅拌下快速加入2～5mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)并继续加热15～30min，溶液变成酒红色。停止加热继续搅拌30min后，静置过夜。然后用0.22μm滤膜进行过滤，并放置在冰箱4℃保存。根据本方法得到粒径为10～20nm，浓度为8～1nM的纳米金溶液。在制备纳米金时，使用的是同一浓度的氯金酸溶液，生成的颗粒越大，对应的浓度就越低。此处，10nm金的浓度为8nM左右，而20nm的金的浓度为1nM左右。
本发明实施例中所用的各种DNA序列如表1所示，均按照已公布的序列由上海生物工程技术有限公司合成。其中，检测凝血酶和溶菌酶所用的特异性DNA为核酸适体，检测汞离子、pH值所用的特异性DNA分别为MSO和具有i-motif结构的DNA。其中，凝血酶、溶菌酶和pH值的cDNA进行了修饰，修饰前的序列见括号中序列，不同的碱基用下划线标出。
表1寡聚核苷酸序列