展示表达甘露聚糖酶的酵母工程菌及其全细胞甘露聚糖酶制剂的生产方法.pdf

本发明提出了一种产甘露聚糖酶的酵母基因工程菌HBYn1和利用HBYn1生产全细胞甘露聚糖酶制剂的方法，它是将来自B.subtilis HB002的甘露聚糖酶基因和来自S.cerevisiae ATCC60715的絮凝蛋白基因，通过在解脂耶氏酵母中融合表达将有活性的甘露聚糖酶展示在解脂耶氏酵母的细胞表面，通过酶学性质分析，在pH6.0，温度为55℃时有最佳的酶活，该基因工程菌酶活可达62IU/g(细胞干重)。利用该菌发酵培养、离心收集菌体，生产全细胞甘露聚糖酶，产品回收成本低，环保无污染，安全，效益好，可用于食品。

1、  一种展示表达甘露聚糖酶的酵母工程菌，保藏号为CCTCC NO：209111。

2、  一种全细胞甘露聚糖酶制剂的生产方法，其特征在于将权利要求一所述的高效表达甘露聚糖酶酵母工程菌HBYn1在YPD固体培养基斜面培养24-36小时后转接至YPD液体培养基中，20-30℃，培养90-120小时，其间每隔12小时取样一次并进行分析，菌体密度达到OD600为40以上，酶活达到60IU/克细胞干重以上，停止培养，离心收集菌体，用0.2摩尔pH 6.0的磷酸盐缓冲液清洗2次后，再次离心收集菌体，所得菌体冷冻干燥即得全细胞甘露聚糖酶制剂。

3、  一种展示表达甘露聚糖酶的酵母工程菌，其特征在于是通过S.cerevisiae絮凝蛋白N端部分基因在解脂耶氏酵母中展示表达的方法和絮凝蛋白N端部分基因与甘露聚糖酶基因融合在解脂耶氏酵母中展示表达的方法完成。

展示表达甘露聚糖酶的酵母工程菌及其全细胞甘露聚糖酶制剂的生产方法
技术领域
本发明涉及的是酵母基因工程菌，特别是一种展示表达甘露聚糖酶的酵母及其全细胞甘露聚糖酶制剂的生产方法，是甘露聚糖酶的一种新剂型。
背景技术
甘露聚糖酶在造纸制浆、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景。在食品行业，β-甘露聚糖酶能水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖生成甘露低聚糖，低聚糖作为双歧杆菌的增殖因子，可有效使体内有益菌自然增殖，改善肠道菌群结构并调节肠道消化系统功能。因此，甘露低聚糖具有保肝，抗肿瘤，增强免疫力，加强肠道蠕动，降低胆固醇及抗衰老等生理活性。在制浆造纸工业，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同作用，用于纸浆漂白和废纸脱墨，达到良好的效果，能明显改善纸质，而且可以减少氯的用量，从而降低生产成本，减轻对环境的污染。在饲料行业中，β-甘露聚糖酶被用来分解豆类、谷类及其副产品中普遍存在的一种抗营养因子β-D-甘露聚糖，降低消化道内容物黏度，破坏细胞壁的结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高动物内源酶(如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等)的活性，改善肠道微生物菌群及提高肠黏膜的完整性等功能。Dvorak试验证实，甘露寡糖能提高仔猪日增质量和饲料转化率(J Anim Sci 2002.80：2887-2894)。在纺织印染方面，能有效去除产品上黏附的多余染料，降低能耗和环境污染。同时，在能源工业也有不错的表现，作为油井石油压裂液的优质生物破胶剂，中科院微生物所、辽河油田井下公司和山东沂水酶制剂厂联合开发，将此酶制剂用于低温油井破胶，为国内外首创，该项目为国家“八五”攻关计划(蔡发国等，新型酶制剂-β-甘露聚糖酶研究进展，饲料添加剂，2007，11：15-22)。
目前，国内有关科研单位广泛进行了甘露聚糖酶及其相关内容的研究。如中国农业科学院饲料研究所的乔宇等人从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中克隆的甘露聚糖酶在巴斯德毕氏酵母Pichia pastoris中表达，获得酶活高达1102IU/ml(见中国生物工程杂志，2006，26(7)：52-56)，该酶最适pH为6.0，最适反应温度为55℃。国外W.H.van Zyl等(J Ind Microbiol Biotechnol(2009)36：611-617)报道了在黑曲霉中生产甘露聚糖酶，最高酶活达到了16，596nkat/ml。
发明内容
本发明是通过基因工程的手段构建能高效展示表达甘露聚糖酶的酵母基因工程菌，并通过从培养基中离心分离展示表达甘露聚糖酶活性的工程菌，从而能高效、经济的制备可反复利用的固定化的甘露聚糖酶。
使用的微生物：本发明涉及的酵母基因工程菌(解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaHBYn1)，具有高效展示表达甘露聚糖酶的特性。
该菌株于2009年5月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M209111，名称为解脂耶氏酵母HBYn1(Yarrowia lipolytica HBYn1)(以下简称HBYn1)。
HBYn1菌株的菌学特性：
a、形态特征：解脂耶氏酵母是一种半子囊的异宗交配型酵母，属于双态性真菌，依据生长条件的不同可以形成酵母或菌丝和假菌丝。
b、生理生化特征：解脂耶氏酵母能利用许多有机物质为原料生长，如n-石蜡，烷烃类，脂肪酸等。而且，解脂耶氏酵母还被美国食品药品管理局(FDA)批准为GRAS(Generally Regarded As Safe)。HBYn1菌株除具有解脂耶氏酵母的生理生化特征，同时因插入了甘露聚糖酶基因，具有高效展示表达甘露聚糖酶的特性。
本发明实现过程：将啤酒酵母(S.cerevisiae ATCC60715)来源的絮凝蛋白GenBank Accession No.NC_001133)的N端部分基因序列与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis HB002)的甘露聚糖酶基因(GenBank Accession No.AF324506)连接，再将该融合基因插入到解脂耶氏酵母整合表达载体pINA1296(Journal of Biotechnology109(2004)63-81)中，构建过程如图1所示。再将重组质粒pINA1296-FHM转化解脂耶氏酵母，从中筛选出高效表达甘露聚糖酶的重组菌株HBYn1。该工程菌产生的甘露聚糖酶展示于菌体表面，利用摇瓶发酵至菌液OD₆₀₀达40以上，其间以粗魔芋粉为底物，菌体作为酶液，测定酶活变化曲线，菌体密度和酶活变化曲线如图2所示，所得最高酶活性为62.3IU/克细胞干重。测定菌体产甘露聚糖酶的最适反应pH为5.5-6.5之间，最适反应温度为50-60℃之间。由于该工程菌受体菌株为GRAS，被认为是安全菌株，所以该工程菌生产的酶制剂不用除菌体，可直接用于食品，医药。
具体做法：通过PCR的方法，用S.cerevisiae ATCC60715的总基因组作为模板扩增絮凝蛋白(Flocculation)的N端部分基因，并在其反向引物引入EcoR I酶切，用B.subtilis HB002的总基因组作为模板扩增甘露聚糖酶基因，并在其正向引物引入EcoRI酶切，通过EcoRI酶切，再用T4DNA连接酶将絮凝蛋白的3‘端与甘露聚糖酶的5’端连接，然后插入到解脂耶氏酵母po1g整合表达载体pINA1296的多克隆位点，再用Not I把载体线性化后，通过醋酸锂化学转化法导入解脂耶氏酵母po1g中，再将酵母转化子点种在含魔芋粉的底物平板上(2％glucose，0.132％yeast extract，0.132％ ammonium chloride，0.032％ potassium dihydrogen phosphate，0.024％magnesium sulphate heptahydrate，0.033％vitamine B₁，20mM sodium phosphatedibasid-citric acid buffer，1％Konjac flour，pH6.0)，筛选出最大水解圈的一株产甘露聚糖酶的重组菌株HBYn1。
将高效表达的甘露聚糖酶的酵母基因工程菌经固体培养基YPD(1.0％(w/v)yeast extract，2.0％(w/v)peptone，2.0％(w/v)glucose，pH 6.0，2.0％(w/v)agar)斜面培养24-36小时后转接至YPD液体培养基(1.0％(w/v)yeast extract，2.0％(w/v)peptone，2.0％(w/v)glucose，pH 6.0)中，20-30℃，经90--120小时培养，每隔12小时取样一次并进行分析，酶活达到60IU/克细胞干重以上，菌体密度达到OD600为40以上，停止培养，离心收集菌体，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)清洗2次，再次离心收集菌体，所得菌体冷冻干燥即得甘露聚糖酶制剂产品。该法生产的甘露聚糖酶制剂回收率接近100％，且操作简单，不需复杂的设备，大大减少了甘露聚糖酶的回收工序和成本。
絮凝蛋白(Flo)用于在毕氏酵母中展示表达有报道(Zhengbing Jiang等，Efficientdisplay of active lipase LipB52 with a Pichiapastoris cell surface display system andcomparison with the LipB52 displayed on Saccharomyces cerevisiae cell surface，BMCBiotechnol.2008；8：4.)，但是用于解脂耶氏酵母尚未见报道。解脂耶氏酵母展示表达目前用的是haemolysin展示表达(Zhenming Chi等，The Surface Display of the AlginateLyase on the Cells of Yarrowia lipolytica for Hydrolysis of Alginate，Marine Biotechnology，10.1007/s10126-009-9178-1)。
本发明率先采用了絮凝蛋白(Flo)用于解脂耶氏酵母的展示表达，达到了本发明的目的。
本发明生产的甘露聚糖酶能明显的降低产品的回收成本，酶经过细胞固定化能反复利用，具有更高的市场价值。具体体现如下：1)该工程菌能高密度发酵，摇瓶OD₆₀₀达40以上；2)发酵过程不需添加诱导物，且能严格地在对数末期高效表达；3)酶学性质好，通过细胞固定化后酶解产物容易分离。在60℃的半衰期达65分钟，另有很宽的pH值范围4)后处理简单，只需将发酵液离心或过滤即得到固定化的甘露聚糖酶。其它甘露聚糖酶后处理精制成本高，相应的价格要高，利用酵母基因工程菌HBYn1生产的活细胞可直接用于酶的催化，生产成本相对较低。5)该工程菌受体菌株为GRAS，可用于食品和药品的生产。
附图及说明
图1是本发明解脂耶氏酵母甘露聚糖酶展示表达，
图2是本发明重组菌株HBYn1发酵生长和酶活变化曲线。
体实施方式
实施例1
通过GeneBank上公布的序列设计引物，分别以S.cerevisiae ATCC60715的总基因组作为模板扩增絮凝蛋白N端部分基因和以B.subtilis HB002的总基因组作为模板扩增甘露聚糖酶基因，采用酶切连接的方式将以上两个基因连接，插入解脂耶氏酵母整合型载体上，化学法转化解脂耶氏酵母，再将转化子点种在含魔芋粉的底物平板上，筛选出最大水解圈的一种产甘露聚糖酶的重组菌株HBYn1。
实施例2
将实施例1得到的重组菌株HBYn1经30℃斜面培养24小时后，转接至50ml的YPD液体培养基中，30℃培养90小时，其间每隔12小时取样一次并进行分析，菌体密度达到OD600为40以上，酶活达到60IU/克细胞干重以上，停止培养，收集菌体，用0.2摩尔的磷酸盐缓冲液洗2次，再次离心收集菌体，所得菌体冷冻干燥即得甘露聚糖酶制剂。将上述菌体用0.2摩尔的磷酸盐缓冲液配制浓度1％的粗魔芋粉作为底物，测得甘露聚糖酶的最适反应pH为6.0，最适反应温度为55℃，60℃的半衰期为65分钟。在55℃反应15分钟，测得甘露聚糖酶酶活为62.3IU/克细胞干重，细胞的回收率约为100％。
实施例3：
将实施例1得到的重组菌株HBYn1经25℃斜面培养36小时后，转接至100ml的YPD液体培养基中，20℃培养120小时，其间每隔12小时取样一次并进行分析，菌体密度达到OD600为40以上，酶活达到60IU/克细胞干重以上，停止培养，收集菌体，用0.2摩尔的磷酸盐缓冲液洗2次，再次离心收集菌体，所得菌体冷冻干燥即得甘露聚糖酶制剂。将上述菌体用0.2摩尔的磷酸盐缓冲液配制1％的粗魔芋粉作为底物，测得甘露聚糖酶的最适反应pH为6.0，最适反应温度为55℃，60℃的半衰期为65分钟。在55℃反应15分钟，测得甘露聚糖酶酶活为62.IU/克细胞干重，细胞的回收率约为100％。