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生产醇的工艺
    技术领域 本发明一般性地涉及提高通过气体和 / 或溶解气和 / 或糖类的微生物发酵来生产 产品的工艺效率的方法，具体地但不限于涉及通过包含一氧化碳的气体物质的微生物发 酵来生产乙醇的工艺。
     背景技术
     乙醇正迅速成为全球主要的富氢液体运输燃料。 2005 年全球乙醇消费量约为 122 亿加仑。预计燃料乙醇工业的全球市场在未来会继续急剧增长，因为欧洲、日本、美 国和多个发展中国家对乙醇的需求增长。
     例如，在美国，乙醇用于生产 E10，一种汽油中的 10％乙醇混合物。 在 E10 混 合物中，乙醇成分作为补氧剂，以提高燃烧效率并降低空气污染。 在巴西，乙醇作为汽 油中混合的补氧剂或单独作为纯燃料满足了约 30％的运输燃料需求。 此外，在欧洲，温 室气体 (GHG) 排放后果的环境问题已促使欧盟 (EU) 为成员国制订了消费可持续运输燃 料例如生物乙醇的任务目标。 绝大多数燃料乙醇通过传统的基于酵母的发酵工艺生产，所述工艺使用作物来 源的糖类，例如甘蔗中提取的蔗糖或谷物中提取的淀粉，作为主要碳源。 然而，这些糖 类原料的成本受其作为人类粮食或动物饲料的价格影响，并且用于乙醇生产的产淀粉或 蔗糖作物的种植不能在所有地形上经济地持续。 因此，需要开发将低成本和 / 或更充足 碳源转化成燃料乙醇的技术。
     CO 是有机材料例如煤炭或石油或石油衍生产品不完全燃烧产生的主要的免费 的富含能源的副产品。 例如，据报道澳大利亚钢铁工业每年产生并向空气中释放超过 500,000 吨 CO。
     催化工艺可用于将主要包含 CO 和 / 或 CO 和氢气 (H2) 的气体转化为多种燃料 和化学品。 微生物也可用于将这些气体转化为燃料和化学品。 这些生物进程虽然通常比 化学反应慢，但与催化工艺相比具有多个优势，包括更高的特异性、更高的产量、更低 的能量消耗和更大的耐毒性。
     微生物以 CO 作为唯一碳源生长的能力于 1903 年首次发现。 这后来被确定为采 用自养生长的乙酰辅酶 A( 乙酰 CoA) 生化路径 ( 也称为 Woods-Ljungdahl 路径和一氧化 碳脱氢酶 / 乙酰辅酶 A 合成酶 (CODH/ACS) 路径 ) 的生物的一种特性。 已经表明，很 多厌氧生物包括一氧化碳营养生物、光合作用生物、产甲烷生物和产乙酸生物均将 CO 代 谢成多种最终产物，即 CO2、 H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。 当使用 CO 作为唯一 碳源时，所有此类生物生产这些最终产物中的至少两种。
     厌氧细菌，例如梭菌属的细菌，已证实通过乙酰 CoA 生化路径从 CO、 CO2、 和 H2 生产乙醇。 例如，从气体生产乙醇的 Clostridium ljungdahlii 的多个菌株在 WO 00/68407，EP 117309，美国专利 5,173,429、5,593,886 和 6,368,819，WO 98/00558 和 WO 02/08438 中有描述。 细菌菌种 Clostridiumautoethanogenum 也已知从气体生产乙醇 (Abrini
     等， Archives ofMicrobiology161， pp 345-351(1994))。
     然而，微生物通过气体发酵生产乙醇通常伴随乙酸盐和 / 或乙酸的副产品产 生。 由于部分可用碳转化为乙酸盐和 / 或乙酸而不是乙醇，因此使用此类发酵工艺生产 乙醇的效率可能低于所需。
     此外，除非所述乙酸盐和 / 或乙酸副产品可用于某种其它用途，否则其可能会 产生废物处理问题。 乙酸盐和 / 或乙酸通过微生物转化为甲烷，并因此有可能导致 GHG 排放。
     WO2007/117157 描述了一种通过包含一氧化碳的气体的厌氧发酵来生产醇尤其 是乙醇的工艺。 作为所述发酵工艺副产品生成的乙酸盐被转化为氢气和二氧化碳气体， 该氢气和 / 或二氧化碳可用于该厌氧发酵工艺。 美国专利 7,078,201 和 WO 02/08438 也 描述了生产乙醇的发酵工艺，其改变了进行发酵的液体营养培养基的多种条件 ( 例如 pH 和氧化还原电位 )。
     可能考虑需要提供改进的方法以控制或调节生产醇的发酵反应的条件。
     本发明的一个目标是满足这种需要和 / 或为通过微生物发酵生产醇提供改进的 方法，或至少为公众提供一种有用的选择。 发明内容
     在第一方面，本发明提供了一种通过包含 CO 的底物的厌氧细菌发酵来生产一种 或多种醇的工艺，所述工艺包括 ：
     (a) 在生物反应器中在液体营养培养基中培养一种或多种菌株，并向该生物反应 器供应所述底物 ；
     (b) 监测所述液体营养培养基的氧化还原电位 ；和
     (c) 控制所述氧化还原电位以使其基本保持在醇生产的最佳范围之内。
     在某些实施方案中，所述工艺进一步包括 ：
     (a) 监测所述液体营养培养基的 pH ；和
     (b) 控制 pH 以使其基本保持在最佳生长 pH 之上。
     在第二方面，本发明提供了一种通过包含 CO 的底物的厌氧细菌发酵来生产一种 或多种醇的工艺，所述工艺包括 ：
     (a) 在生物反应器中在最佳生长 pH 下在液体营养培养基中培养一种或多种菌 株，和向该生物反应器供应所述底物以使微生物生长 ；
     (b)i) 在需要的时间点调节所述液体营养培养基的 pH 到最佳生长 pH 之上的水平 或范围，或 ii) 在需要的时间点调节所述液体营养培养基的氧化还原电位到最佳水平或范 围；
     (c) 监测所述液体营养培养基的 pH 和 / 或氧化还原电位 ；和
     (d) 控制 pH 以使其基本保持在最佳生长 pH 之上，和 / 或控制氧化还原电位以使 其基本保持在最佳水平或范围。
     在第三方面，本发明提供了一种通过乙酸盐和包含 CO 的底物的厌氧细菌发酵来 生产一种或多种醇的工艺，其中所述工艺包括 ：
     (a) 在第一生物反应器中，发酵包含碳和能量源的底物以生产乙酸盐 ；(b) 在第二生物反应器中，在生物反应器中在液体营养培养基中培养一种或多种 厌氧细菌菌株，并向所述生物反应器供应由所述发酵 (a) 所生产的乙酸盐和所述底物，其 中所述液体营养培养基的 pH 和 / 或氧化还原电位保持在允许乙酸盐和所述包含 CO 的底 物通过所述细菌发酵生产一种或多种醇的水平。
     在 每 个 所 述 方 面 的 实 施 方 案 中， 所 述 最 佳 氧 化 还 原 电 位 范 围 约 为 -450 到 -550mV。
     在每个所述方面的实施方案中， pH 保持在约 5.7 到约 7.0。
     在每个所述方面的实施方案中，氧化还原电位通过下述方法中的一种或多种进 行控制 ：
     (a) 加入一种或多种氧化剂，
     (b) 加入一种或多种还原剂，
     (c) 调节 pH。
     在每个所述方面的实施方案中，所述还原剂为甲基紫精或半胱氨酸。
     在每个所述方面的实施方案中， pH 通过加入酸和 / 或碱进行控制或调节。
     在第四方面，本发明提供了一种提高发酵工艺效率的方法，所述方法包括 ： (a) 检测所述发酵工艺中使用的微生物的细胞内氧化还原电位的变化 ；和
     (b) 基于在步骤 (a) 中是否检测到变化，控制所述发酵工艺的至少一个参数。
     在具体实施方案中，所述检测变化的步骤 (a) 包括从生物反应器中提取所述微生 物的样品，其中所述发酵工艺是，至少部分是，在所述生物反应器中进行的。 在某些实 施方案中，所述检测变化的步骤 (a) 重复一次或多次以获得多个测量数据，优选地，在预 定间隔时间之后重复。 需要注意的是，所述间隔时间对于具体工艺可以相同或不同，并 且对于不同工艺可以变化，这根据本公开对于本领域技术人员来说是显而易见的。
     所控制的参数可包括下列参数中的任何一个或多个 ：压力、温度、气体流速、 液体流速、培养基 pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率、接种水平、最大气体底物浓 度、最大产物浓度和产物回收的起始点。
     本领域已知的任何方法都可用于检测细胞内氧化还原电位的变化。 然而，在某 些实施方案中，提供了流式细胞术方法，其中将一种是细菌还原酶活性指示剂的试剂加 入到所述样品中并然后渗入到所述细菌中。 还原之后，所述试剂产生荧光信号，该荧光 信号根据细胞内氧化还原电位变化并可用流式细胞仪分析。
     在具体实施方案中，所述步骤 (b) 的控制包括，基于在步骤 (a) 中是否检测到细 胞内氧化还原电位的变化，确定是否改变所述发酵工艺的至少一个参数、和 / 或保持至 少一个参数在其当前值、和 / 或基于步骤 (a) 的结果不采取行动改变参数。
     需要注意的是，当基于步骤 (a) 的结果不采取行动时，根据本公开技术人员应该 知道仍可进行常规形式的控制和调节，例如保持 pH 在预定范围内。
     在具体实施方案中，所述发酵工艺通过一种或多种厌氧细菌菌株厌氧发酵包含 CO 的底物生产乙酸盐和 / 或一种或多种醇。
     在某些实施方案中，步骤 (a) 包含在生物反应器中在液体营养培养基中培养一种 或多种厌氧细菌菌株，和向该生物反应器供应包含 CO 的气体底物，并保持所述液体营养 培养基的 pH 和氧化还原电位在允许所述细菌生长并生产乙酸盐的水平。
     在某些实施方案中，所述确定步骤基于是否检测到细胞内氧化还原电位升高。 另外地或替代性地，所述确定步骤可基于是否检测到细胞内氧化还原电位降低。 在检测 到细胞内氧化还原电位降低的情况下，所述步骤 (b) 的控制可包括停止所述发酵工艺， 和 / 或向所述发酵罐的内容物中加入微生物，和 / 或去除一部分所述发酵罐的所述内容 物，和 / 或改变所述发酵工艺的一个或多个参数 ( 参见上文所列 )。
     在具体实施方案中，本发明的方法适合用于通过气体尤其是包含一氧化碳的气 体的厌氧发酵来生产醇尤其是乙醇和 / 或丁醇和 / 或异丙醇的工艺。 然而，本发明不限 于此并可应用于其它用途，包括需氧发酵，以及不含 CO 或只含少量 CO( 例如 6％ CO) 的 底物的发酵，尤其是当所述底物包含 CO2 和 / 或 H2 时。 本发明的实施方案包括例如且不 限于糖类发酵，以及另外地或替代性地，生产酸 ( 和 / 或其盐 ) 和 / 或 H2。
     根据第五方面，本发明提供了进行发酵工艺的发酵系统，所述系统包括 ：
     (a) 用于检测所述发酵工艺中所使用的微生物的细胞内氧化还原电位变化的装 置 ；和
     (b) 用于基于是否通过所述检测装置检测到变化来控制所述发酵工艺的至少一个 参数的装置。 所述系统可配置为进行厌氧和 / 或需氧发酵工艺。 在一种实施方案中，本发明 涉及厌氧发酵。
     每个不同方面的实施方案在发酵包含 CO 的底物来生产酸和 / 或醇中具有具体应 用。在具体实施方案中，所述包含 CO 的底物为气体。所述气体底物可包含作为工业工艺 的副产品获得的气体。 在某些实施方案中，所述工业工艺选自 ：黑色金属产品制造、有 色产品制造、石油精炼工艺、生物质气化、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、 甲醇生产和焦炭生产。 优选地，所述气体底物包含从钢厂获得的气体。
     在每个不同方面的某些实施方案中，所述气体底物包含以体积计 15 ％ CO 到 100％ CO，例如以体积计 20％到 95％，例如以体积计 75％ CO 到 95％ CO，例如以体积计 80％到 90％ CO。 可以使用更低的 CO 水平，例如 6％，只要该底物也包含 CO2 和 H2。 在每个不同方面的实施方案中，所述发酵工艺生产的醇为乙醇。 所述发酵反应还可生产 乙酸盐和 / 或丁醇和 / 或异丙醇。
     在每个不同方面的具体实施方案中，所述发酵反应通过一种或多种产乙酸 细菌的菌株进行。 在每个不同方面的实施方案中，所述厌氧的产乙酸细菌选自 ：梭 菌 (Clostridium)、 穆 尔 氏 菌 (Moorella)、 氧 化 碳 嗜 热 菌 (Carboxydothermus)、 产 醋 菌 (Acetogenium)、 醋 酸 杆 菌 (Acetobacterium)、 厌 氧 醋 菌 (Acetoanaerobium)、 丁 酸 杆 菌 (Butyribacterium) 和 Peptostreptococcus。 在 具 体 实 施 方 案 中， 所 述 产 乙 酸 细 菌 为 Clostridium autoethanogenum 或 Clostridium carboxydivorans。
     虽然本发明如上面概括定义，本发明不限于此并还包括下面描述提供实施例的 实施方案。
     附图说明
     本发明将详细描述，并参考附图，其中 ： 图 1 为显示 Clostridium autoethanogenum 典型生命周期的图表 ；图 2 为显示以甲基紫精处理的培养物与未处理的培养物相比较其中 RS 阳性细胞 比例的变化对时间的作图 ；
     图 3 为显示在最佳生长 pH 及升高的 pH 下 Clostridium autoethanogenum 的乙酸盐 和乙醇产生对时间的作图。
     发明的详细描述
     以下为本发明的概括描述，包括本发明的多个实施方案。 本发明在本文下述 标题 “实施例” 之下的公开中进一步说明，所述公开提供了关于产生、使用、和实施本 发明的实验数据，本发明的方面和实施方案的特定实施例，以及实施本发明的说明性方 法。
     定义
     除非另有定义，本说明书中使用的下列术语如下定义 ：
     术语 “提高所述效率”、 “提高效率” 等等，当与发酵过程相关时，包括但不 限于，提高下列各项中的一个或多个 ：催化所述发酵的微生物的生长率、消耗单位体积 底物 ( 例如一氧化碳 ) 产生的所需产品 ( 例如醇 ) 体积、所需产品的生产率或生产水平、 以及生产的所需产品与所述发酵的其它副产品相比较的相对比例。 术语 “包含一氧化碳的底物” 包括可存在于或引入发酵生物反应器的任何包含 CO 的固体、液体、或气体材料。
     术语 “共底物” 系指不必然作为产物合成的主要能量和材料来源，但当另外加 入另一种底物例如主要底物时可用于产物合成的底物。
     术语 “乙酸盐” 既包括单独的乙酸盐，也包括分子或游离乙酸和乙酸盐的混合 物，例如存在于本文所述的发酵液中的乙酸盐和游离乙酸的混合物。 所述发酵液中乙酸 与乙酸盐的分子比例取决于所述系统的 pH。
     术语 “生物反应器” 包括任何由一个或多个容器和 / 或塔或管系组成的发酵 装置，包括连续搅拌釜式反应器 (CSTR)、固定化细胞反应器 (ICR)、滴流床反应器 (TBR)、鼓泡塔、气举发酵罐、静止混合器、或适合气 - 液接触的其它容器或其它装置。
     术语 “最佳生长 pH”等等包括促进和 / 或支持细菌生长的液体营养培养基的 pH 水平或 pH 范围。 应理解最佳生长 pH 可以根据所使用的微生物和 / 或其它发酵条件而变 化。
     术语 “最佳氧化还原电位” 或 “最佳 ORP” 等等包括促进和 / 或支持醇生产的 液体营养培养基的 ORP 水平或 ORP 范围。 应理解最佳 ORP 可以根据所使用的微生物和 / 或其它发酵条件而变化。
     术语 “极限浓度” 意为微生物发酵培养基中某种特定成分的初浓度，其足够低 以确保其在所述发酵的某个阶段耗尽。
     术语 “碳捕获” 用于本文时系指从包含 CO2 和 / 或 CO 的流中吸集碳化合物包 括 CO2 和 / 或 CO，以及 ：
     (a) 将所述 CO2 和 / 或 CO 转化成产品 ；或者
     (b) 将所述 CO2 和 / 或 CO 转化成适合长期储存的物质 ；或者
     (c) 将所述 CO2 和 / 或 CO 捕获进适合长期储存的物质 ；
     或者这些过程的组合。
     除非上下文另有需要，短语 “发酵”、 “发酵工艺”、或 “发酵反应” 等等用 于本文时，倾向于包括涉及微生物生长和 / 或由微生物生物合成产物的工艺的生长期和 产物生物合成期。
     本发明总体涉及通过包含一氧化碳 (CO) 的气体底物发酵生产醇的工艺。 本发 明的方法还总体涉及碳捕获的改进，其中 CO 和任选的 CO2 被转化成有用的产品，即醇。
     本领域已知通过作为碳和能量源的包含 CO 的气体底物的厌氧细菌发酵生产醇的 工艺。 这些发酵工艺除生产所需醇产物外，还可生产乙酸盐作为副产品。 因此，从 CO 中可用碳转化为所需醇产物的效率小于最佳。
     不受理论限制，在发酵工艺中通常有两个代谢阶段，产酸阶段，其中所述 细菌生长并生产酸，和产溶剂阶段，其中生产溶剂例如醇。 举例来说，在使用梭菌 (Clostridium) 菌种生产溶剂的发酵工艺中，两个代谢阶段已知并如图 1 所示。 所述产乙 酸阶段与细菌生长相关，在该阶段梭菌 (Clostridium) 菌种生产例如 H2、 CO2 和 / 或有机 酸，例如丁酸盐和乙酸盐。 虽然溶剂例如醇可任选地在产乙酸阶段生产，但其产量通常 微不足道。
     产乙酸阶段之后是产溶剂阶段，在该阶段所述细胞的新陈代谢转换为有利于溶 剂产生。 典型地，在此阶段有机酸产生和微生物生长减少或停止。 对于所述细菌，优选 的不同环境参数 ( 例如所述培养基的 pH、氧化还原电位等 ) 取决于该细菌所处的阶段。
     发明者惊人地发现，提高厌氧产乙酸细菌培养物的 pH 到最佳生长 pH 之上，同 时保持所述培养物的氧化还原电位在低水平 ( 约 -450mV 或以下 )，所述细菌生产醇和任 选的乙酸盐。 在此条件下，醇和任选的乙酸盐以至少约 1 ∶ 1 的摩尔比，优选地以有利 于醇的摩尔比产生。 在一具体实施方案中，醇与乙酸盐的摩尔比约为 1.4 ∶ 1。 另外， 所述细菌将至少一部分作为所述发酵副产品产生的乙酸盐以比通常在该种发酵工艺中所 使用的低 pH 条件更高的比率转化为乙醇。
     另外，还惊人地发现，在发酵工艺中，当从产乙酸阶段转到产溶剂阶段时，微 生物尤其是 Clostridium autoethanogenum 的细胞内氧化还原电位显著降低。 因此，广义来 讲，本发明的某些方面涉及使用所述微生物的细胞内氧化还原电位的一种或多种指征检 测发酵工艺中微生物的状态或状态变化。
     虽然以下描述集中于本发明的某些实施方案，即使用 CO 作为主要底物生产乙 醇，但是应理解，与本发明相关领域的技术人员考虑到本公开可知道，本发明可应用于 生产其它醇和使用其它底物。 同样地，虽然具体提到使用产乙酸细菌例如 Clostridium autoethanogenum 和 Clostridium carboxydivorans 进行发酵，但本发明也适用于在相同或不 同工艺中可用的其它微生物，包括可用于生产有用产品，包括但不限于丁醇的其它梭菌 (Clostridia) 菌种。 因此，在一方面，本发明涉及通过作为碳和能量源的包含 CO 气体底 物的厌氧细菌发酵来生产醇例如丁醇，例如正丁醇的工艺。
     本发明的工艺典型地涉及在包含液体营养培养基的生物反应器中培养一种或多 种可从包含 CO 的气体底物生产醇和任选的乙酸盐的厌氧细菌菌株，以及向所述生物反应 器供应所述气体底物。 所述发酵生产一种或多种所需醇，通常也生产乙酸盐。
     在一具体实施方案中，所述工艺包括控制所述液体营养培养基的氧化还原电位 以使其保持在最佳水平或范围，具体为约 -450mV 或更低，例如 -450mV 到约 -550mV。在一具体实施方案中，所述工艺还包括控制所述液体营养培养基的 pH 的步骤以使其保持 在升高的水平 ( 即高于最佳生长 pH)，具体为约 5.7 到约 7.0，或约 5.8 到约 6.5。 在一具 体实施方案中，所述液体营养培养基保持在适宜的氧化还原条件下，或适宜的 pH 和氧化 还原条件下，持续至少一段时间足以允许所述细菌以至少为 1 ∶ 1 的摩尔比或有利于醇的 更高比例生产一种或多种醇和任选的乙酸盐。 所述条件进一步促进所述液体营养培养基 中存在的任何乙酸盐发酵成所需醇，例如乙醇或正丁醇。 所述乙酸盐向醇的转化提高了 所述发酵工艺的乙醇产量，由此进一步改进了乙醇与乙酸盐的比例。
     根据需要，所述液体营养培养基的氧化还原电位可通过加入一种或多种适合的 还原剂或氧化剂进行调节。 本领域技术人员知道适于降低 ORP 的还原剂。 然而，举例 来说，亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、二氧化硫、氨、肼或还原气体例如氢气或甚至 CO 均可用 于降低 ORP。 在本发明的具体实施方案中，适合用于本发明工艺的还原剂包括甲基紫精 和半胱氨酸。 本领域技术人员知道适于升高 ORP 的氧化剂，但是举例来说，包括过氧化 氢、臭氧、二卤化物 ( 氯、溴或碘 )、二氧化氯、高锰酸钾、空气或氧气。 本领域技术人 员还理解，还可通过分别升高或降低所述液体营养培养基的 pH 来降低或升高 ORP。 例 如，理论水性体系的 pH 每升高 1pH 单位， ORP 将降低 59mV。 所述液体营养培养基的 pH 可根据需要通过加入一种或多种合适的 pH 调节剂或 缓冲液进行调节。 例如，根据需要，碱例如 NaOH 和酸例如硫酸可用于分别升高或降低 pH。 本领域技术人员知道可用于调节所述液体营养培养基 pH 的酸和 / 或碱。
     本领域技术人员还理解，本发明的方法因而典型地涉及一个或多个测量所述发 酵培养基的 pH 和 / 或氧化还原电位的步骤。
     在本发明的具体实施方案中，所述生物反应器包括用于连续地或间断地测定液 体营养培养基 pH 和 / 或 ORP 的装置。 本领域技术人员了解用于监测这些参数的合适装 置或传感器，但是举例来说，通过将 ORP 探针浸入所述液体营养培养基可连续地或间断 地监测 ORP。 相似地，通过将 pH 探针浸入所述液体营养培养基可监测 pH。
     所述 pH 和 / 或 ORP 测定装置提供的反馈允许监测所述生物反应器中的条件。 所述反应器中的条件可根据所述反馈或其它的结果通过改变特定的参数或加入特定的试 剂控制。
     可通过向所述液体营养培养基加入还原剂或氧化剂控制 ORP。 例如，如果 ORP 升高或降低高于或低于最佳 ORP，可向所述液体营养培养基加入还原剂或氧化剂以保持 所述培养基在最佳 ORP 范围内。 或者，可通过向所述液体营养培养基插入电极控制 ORP 以保持或达到所需 ORP。
     相似地，也可控制 pH。 例如，如果 pH 升高高于或降低低于所需 pH 范围，可 向所述液体营养培养基加入酸或碱以保持所述培养基在所需 pH 范围内。
     本领域技术人员理解，所述氧化或还原剂或者酸或碱可根据与最佳条件的差异 人工加入。 例如，可激活一种或多种警报以提醒操作员需要加入某种试剂。 然而，在某 些实施方案中，连续地或间断地监测 pH 和 / 或 ORP，并且根据与最佳条件的差异自动加 入合适的试剂。 例如，pH 和 / 或 ORP 探针向监测所述生物反应器条件的中央处理器提供 反馈。 如果 ORP 升高高于预定阈值，所述处理器将启动导入还原剂直到保持所需 ORP。 可替换地或另外地，如果 pH 降低低于预定阈值，则所述处理器启动导入碱直到保持所需
     pH。 在本发明的一种实施方案中，连续地监测并随后保持 pH 和 ORP 在所需范围已可 连续生产乙醇超过 9 天。 预计以这种方式监测并保持液体营养培养基条件将会连续生产 醇数周或数月。
     在另一方面，本发明涉及使用微生物的细胞内氧化还原电位的一种或多种指征 检测发酵工艺中微生物的状态或状态变化。 细胞内氧化还原电位很大程度上与所述液体 营养培养基的 ORP 无关，并可用作生物反应器中的微生物群的生存力和 / 或状态的间接 量度。 基于所检测的状态，可控制容纳所述微生物的生物反应器的条件以根据所检测的 状态优化所述条件，由此提高所述工艺的效率。 例如，就产乙酸微生物来说，如果检测 到所述微生物在生长或产乙酸阶段，可控制参数以利于最佳生长。 或者，如果微生物在 产醇或产溶剂阶段，则可为醇生产优化条件。 例如，在产醇阶段，可保持 pH 和 / 或 ORP 在最佳范围内以促进醇生产。
     在 此 类 工 艺 中 非 常 需 要 优 化 生 物 反 应 器 条 件。 具 体 地， 在 商 业 工 艺， 例 如 从 包 含 CO 的 气 体 生 产 乙 醇 中， 非 常 需 要 更 快 速 地 积 累 细 菌 细 胞 生 物 量， 例 如 C.autoethanogenum。 这是因为细菌生物量积累的提高可以缩短发酵工艺中细菌浓度达到 一定细菌细胞密度所需的时间，这使单位体积输入气体、单位体积反应器培养基的工艺 生产率最大化。 该时间缩短关系到运营成本的降低和非生产停机时间的减少。
     或者，或除上述之外，生物反应器条件的优化包含基于是否检测到细胞内氧化 还原电位的变化，确定是否改变所述发酵工艺的至少一个参数、和 / 或保持至少一个参 数在其当前值、和 / 或基于步骤 (a) 的结果不采取行动改变参数。
     所控制的参数可包含下列参数中的任何一个或多个 ：压力、温度、气体流速、 液体流速、培养基 pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率、接种水平、最大气体底物浓 度、最大产物浓度、和产物回收的开始或停止。
     因此，根据本发明的一些实施方案，从生物反应器中提取微生物样品并检测其 细胞内氧化还原电位是否有变化。 可使用任何已知方法检测所述微生物的细胞内氧化还 原电位，包括涉及使用分光光度计的方法。 优选地每隔一定间隔取样，尽管所述间隔可 根据具体反应的已知特性有所变化。 例如，如果已知某种微生物具有最短生长期，则在 起始阶段少取样或不取样，随后阶段定期取样直到检测到变化。 当细胞内氧化还原电位 出现显著变化时，就有可能得出其状态，并使用这一信息优化所述微生物的条件。
     可通过测定氧化还原对的浓度来分析细胞内氧化还原状态，所述氧化还原对例 如 NAD+/NADH、 NADP+/NADPH、和胱氨酸 / 半胱氨酸、以及谷胱甘肽和金属酶的氧 化和还原形式。 用于完成此类测定的工具包括使用荧光 ( 流式细胞术、显微术和荧光测 定 )、色度学测定、放射性同位素标记、和磁共振成像。
     在本发明的一种特定的实施方案中，流式细胞术用于检测从所述生物反应器提 取的细菌样品的还原酶活性。 可使用任何已知的细菌还原酶活性指征。 然而，举例来 说，RedoxSensorTM Green 试剂 (RS) 是用于本发明的某些实施方案的合适的细菌还原酶活 性指征。 因而，还原酶活性是电子传递链功能变化的可靠标记。 还原之后，RS 将在 10 分钟内产生稳定的绿色荧光信号。 当细胞用打断电子传递的试剂例如叠氮化钠、或羰基 氰化氯苯腙处理时，染色强度会变化。
     发酵
     本发明具体地适用于改进从包含 CO 的底物生产乙醇和 / 或其它醇例如丁醇和 / 或异丙醇。 在具体实施方案中，所述包含 CO 的底物为气体。 所述气体底物可以是作为 工业工艺副产品获得的包含 CO 的废气。 本发明的方面也适用于生产多种类型的酸和 / 或醇的反应。 例如，通过梭菌 (Clostridia) 菌种例如丙酮丁醇梭菌 (C.acetobutylicum)、 C.bejerenkii、和 C.saccarolyticum 生产丁酸盐、乙酸盐、丁醇、丙酮、乙醇或异丙醇，包 括在纤维素、水解纤维素、淀粉、水解淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、 甘油和乳糖上发酵来生产。
     已知从气体底物 ( 例如上述气体底物 ) 生产乙醇和其它醇的工艺。 示范性工艺 包括例如 WO2007/117157 和 US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722、 和 US 5,821,111 所述的工艺。
     已知很多厌氧细菌可进行从 CO 生产醇包括正丁醇和乙醇、以及乙酸的发酵，并 适用于本发明的工艺。
     适用于本发明的此类细菌的示例包括梭菌属的细菌，例如 Clostridiumljungdahlii 菌株，包括 WO 00/68407， EP 117309，美国专利 5,173,429、5,593,886、和 6,368,819， WO 98/00558 和 WO 02/08438 所 述 的 细 菌 ；Clostridiumautoethanogehum(Abrini 等， Archives of Microbiology 161 ：pp 345-351)、醋酸梭菌 (Clostridium aceticum)、丙酮丁醇 梭菌 (Clostridiumacetobutylicum) 和热醋梭菌 (Clostridium thermoaceticum)。 其它有用的 细菌包括凯伍产醋菌 (Acetogenium kivui)、伍氏醋酸杆菌 (Acetobacterium woodii)、潮湿 厌氧醋菌 (Acetoanaerobium noterae)、食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum) 和 Peptostreptococcus productus。 其它合适的细菌包括穆尔氏菌 (Moorella) 属的细菌，包 括 Moorella 菌种 HUC22-1，(Sakai 等，Biotechnology Letters 29 ：pp1607-1612)，以及氧 化碳嗜热菌 (Carboxydothermus) 属的细菌 (Svetlichny，V.A.，Sokolova，T.G. 等 (1991)， Systematic and Applied Microbiology 14 ：254-260)。 另外，其它厌氧细菌，尤其是产乙酸 细菌，可由本领域技术人员选择用于本发明的工艺。 应该理解，两种或多种细菌的混合 培养物可用于本发明的工艺。
     适用于本发明的一种示例性微生物为 Clostridium autoethanogenum。 在一种实施 方案中，所述 Clostridium autoethanogenum 为具有以鉴别保存编号 19630 存放于德国生物 材料资源中心 (DSMZ) 的菌株的鉴别特征的 Clostridiumautoethanogenum。 在另一种实施 方案中，所述 Clostridium autoethanogenum 为具有 DSMZ 保存编号 DSMZ 10061 的鉴别特 征的 Clostridiumautoethanogenum。 另一种合适的微生物为 Clostridium carboxydivorans， 可购自 DSMZ 并具有 15243 的鉴别特征。
     培养本发明的方法中使用的细菌可使用任何本领域已知的用于用厌氧细菌培养 和发酵底物的任何工艺进行。 示例性技术在下面实施例章节中提供。 进一步举例说明， 可使用下述使用气体底物发酵的文章中一般描述的工艺 ：K.T.Klasson， M.D.Ackerson， E.C.Clausen 和 J.L Gaddy (1991) .Bioreactorsfor synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling，5 ；145-165 ；K.T.Klasson， M.D.Ackerson， E.C.Clausen 和 J.L Gaddy(1991).Bioreactordesign for synthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614 ； K.T.Klasson ， M.D.Ackerson ， E.C.Clausen 和 J.L Gaddy (1992) .Bioconversionof synthesis gas intoliquid or gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology. 14 ； 602-608 ；J.L Vega， G.M.Antorrena， E.C.Clausen 和 J.L Gaddy(1989).Study ofGaseous SubstrateFermentation ：Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2 .Continuous Culture. Biotech.Bioeng.34.6.785-793 ；J.L Vega， E.C.Clausen 和 J.L.Gaddy(1989).Study of gaseous substrate fermentations ：Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784 ； 以 及 J.LVega， E.C.Clausen 和 J.L Gaddy(1990). Design of Bioreactors for CoalSynthesis Gas Fermentations.Resources， Conservation and Recycling.3.149-160。 所述发酵可在任何合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌釜式反 应器 (CSTR)、固定化细胞反应器、气举反应器、鼓泡塔反应器 (BCR) 或滴流床反应器 (TBR)。
     如上所述，所述发酵反应的碳源为包含 CO 的底物。 在具体实施方案中，所述 包含 CO 的底物为气体。 所述气体底物可以是作为工业工艺副产品获得的包含 CO 的废 气，或来自某种其它来源，例如来自汽车排出的废气。 在某些实施方案中，所述工业工 艺选自 ：黑色金属产品制造例如钢厂、有色产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、电力 生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产、甲醇裂化和焦炭生产。 在这些实施方案中，所述 包含 CO 的气体可使用任何方便的方法在其排放到空气中之前从所述工业工艺中捕获。取 决于所述包含 CO 的气体底物的成分，可能还需要在将其引入所述发酵之前进行处理以去 除任何不需要的杂质，例如灰尘颗粒。 例如，可使用已知的方法过滤或净化所述气体底 物。
     或者，所述包含 CO 的气体底物可来源于生物质气化。 所述气化工艺涉及在有 限供应的空气或氧气中不完全燃烧生物质。 所得气体典型地主要包含 CO 和 H2，以及极 少量的 CO2、甲烷、乙烯和乙烷。 例如，可气化在食品提取和加工中获得的生物质副产 品，例如来自甘蔗的糖、或者来自玉米或谷物的淀粉、或者通过森林工业产生的非食物 生物质废料，以生产适合用于本发明的包含 CO 的气体。
     所述包含 CO 的气体底物理想地包含显著比例的 CO，例如以体积计至少约 70％ 到约 95％ CO。 然而，CO 比例可以以体积计为约 15％到约 100％ CO、以体积计约 20％ 到约 95％ CO、以体积计约 40％到约 95％ CO、以体积计约 60％到约 90％ CO 和以体积计 约 70％到约 90％ CO。 在一实施方案中，所述气体底物包含以体积计约 80％ CO。 如果 H2 和 CO2 也存在，所述含量可能低于 15％，例如 6％。 例如，涉及使用生物质合成气的 本发明的应用可以包含约 20％或更少的 CO。 虽然所述气体底物不必然包含任何氢气， 但根据本发明的方法，氢气的存在一般对产品形成无害。 然而，在本发明的某些实施方 案中，所述气体底物基本不含氢气 ( 少于 1％ )。 所述气体底物也可包含一些 CO2，例如 以体积计约 1％到约 30％，例如约 5％到约 10％ CO2。
     在本发明的某些实施方案中，所述包含 CO 的底物源于含碳废料，例如工业废 气，或源于其它废料的气化。 在这种情况下，本发明的方法代表了捕获会以各种方式排 放到环境中的碳的有效工艺。 在某些实施方案中，所述方法提供了通过转化为有用产品 例如醇的捕获 CO 和任选的 CO2 的改进工艺。
     典型地，一氧化碳将以气体形态加入到所述发酵反应中。 然而，本发明的方法 不限于以这种形态加入底物。 例如，一氧化碳可以以液体形式提供。 例如，液体可用包含一氧化碳的气体饱和，并将该液体加入到所述生物反应器中。 这可使用标准方法实 现。 例如，微泡分布发生器 (Hensirisak 等， Scale-upof microbubble dispersion generator for aerobic fermentation ；AppliedBiochemistry and BiotechnoloRv Volume 101， Number 3/ October，2002) 可用于该目的。 考虑到本公开应理解，为了使所述细菌生长并使 CO 到 乙醇的发酵发生，除所述包含 CO 的底物气体以外，还需要向所述生物反应器供应合适的 液体营养培养基。 营养培养基包含足以允许使用的微生物生长的维生素和矿物质。 本领 域已知适合使用 CO 作为唯一碳源的乙醇发酵的厌氧培养基。 例如，上文所述的美国专 利 5,173,429 和 5,593,886 以及 WO 02/08438 所述的合适培养基。
     所述发酵应在适合 CO 到乙醇发酵发生的条件下进行。 除保持 pH 和氧化还原电 位在上文所述的范围内足够时间以生产醇和 / 或允许乙酸盐副产品转化为乙醇发生外， 其它应考虑并可监测和控制的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、搅拌速 率 ( 如果使用连续搅拌釜式反应器 )、和接种水平、以及最大产物浓度 ( 例如，为了防止 产物抑制 )。
     最佳反应条件部分取决于使用的具体微生物。 然而，一般来说，在高于环境压 力的压力下进行所述发酵可能是有利的。 在升高的压力下进行可显著增加 CO 从气相转 化为液相的比率，在液相中 CO 可被所述微生物作为碳源吸收用于生产乙醇。 因而，这 意味着当生物反应器保持在升高的压力下而不是大气压下时可缩短保持时间 ( 定义为生 物反应器中的液体体积除以输入气体流速 )。
     此外，因为给定的 CO 到乙醇转化率部分上是底物保持时间的函数，并且达到所 需保持时间决定了需要的生物反应器容积，使用耐压系统可大大减少需要的生物反应器 容积，并因而减少发酵设备的资本成本。 根据美国专利 5,593,886 提供的实施例，反应器 容积减少与反应器运行压力增加呈线性比例，即在 10 个大气压下运行的生物反应器只需 要在 1 个大气压下运行的生物反应器容积的十分之一。
     其它文章也描述了在升高的压力下进行气体到乙醇发酵的益处。 例如， WO 02/08438 描述了在 30psig 和 75psig 压力下进行气体到乙醇发酵，所得乙醇产率分别为 150g/l/ 日和 369g/l/ 日。 然而，使用相同培养基和输入气体成分在大气压下进行的示例 发酵发现每升每天生产的乙醇少 10 到 20 倍。 还需要包含 CO 的底物的引入速率可确保 液体营养培养基中 CO 的浓度不产生限制。 这是因为 CO 受限条件的后果可能是醇产品被 培养物消耗。
     醇回收
     在某些实施方案中，根据本发明上述的发酵工艺可在液体营养培养基中产生包 含一种或多种醇例如乙醇以及细菌细胞的发酵液。 在本发明的一种实施方案中，乙醇 是所述发酵的优选的所需终产物。 所述乙醇可通过本领域已知的方法从所述发酵液中回 收，例如分馏或蒸发，以及萃取发酵。
     从发酵液蒸馏乙醇可产生乙醇和水的共沸混合物 ( 即 95％乙醇和 5％水 )。 然后 可通过使用本领域熟知的分子筛乙醇脱水技术获得无水乙醇。
     萃取发酵过程涉及使用对发酵微生物具有低毒性风险的水溶性溶剂以从稀释的 发酵液中回收乙醇。 例如，油醇可在此类萃取工艺中用作溶剂。 不断地将油醇加入到发 酵罐，然后该溶剂上升到所述发酵罐顶部形成一层，不断萃取该层并输出通过离心机。然后水和细胞很容易地与所述油醇分离并将其返回所述发酵罐，而将包含乙醇的溶剂输 出到闪蒸单元。 大部分所述乙醇被蒸发并浓缩，而所述油醇是不挥发的，将其回收用于 所述发酵的再次使用。
     培养基条件调节
     在具体实施方案中，本发明的工艺在单个生物反应器中进行，并且调节液体营 养培养基的 pH 和 / 或氧化还原电位以允许使用包含 CO 的气体的细菌培养物的代谢活动 在多种状态之间转换。 如上所述，连续地或间断地监测并保持 pH 和 / 或 ORP 在所需范 围内会促进醇生产。 因此，在某些实施方案中，所述工艺涉及使所述细菌培养物在生长 期和醇生产期之间转换，在生长期微生物生长和 / 或乙酸盐生产得到促进，在醇生产期 从乙酸盐和 / 或包含 CO 的底物生产醇。 在具体实施方案中，所述培养物在下列状态之 间转换 ：
     (1) 生长和乙酸盐生产。 在一种实施方案中，所述液体营养培养基的 pH 保持 在约 5.0 到约 5.7 范围内，并且氧化还原电位为约 -450mV 或更高，例如约 -400mV 到 约 -250mV。
     (2) 从乙酸盐和 / 或包含 CO 的气体生产乙醇。 在一种实施方案中，所述液体营 养培养基的 pH 保持在约 5.8 到约 6.5 范围内，并且氧化还原电位为约 -450mV 或更低。 所 述培养基保持在这些条件下足够时间以允许所述细菌以至少约 1 ∶ 1 的有利于乙醇的比例 生产乙醇和任选的乙酸盐，和 / 或将第一种状态 (1) 中生产的待转化乙酸盐转化为乙醇。 如上所述，可使用 pH 调节剂、氧化剂和还原剂根据需要调节所述液体营养培养 基的 pH 和 / 或氧化还原电位，以使所述细菌培养物的代谢活动在上述状态之间转换。
     二阶段发酵
     在另一方面，本发明涉及通过乙酸盐和包含 CO 的气体底物的厌氧细菌发酵来生 产一种或多种醇例如乙醇的工艺。 所述工艺涉及在生物反应器中以液体营养培养基培养 一种或多种厌氧细菌菌株，和向所述生物反应器中提供外源乙酸盐和所述气体底物。
     所述液体营养培养基的 pH 和氧化还原电位保持在允许加入的乙酸盐和所述气体 底物均通过所述细菌发酵生产一种或多种醇的水平。 在多种实施方案中，pH 和氧化还原 电位分别保持在约 5.0 到约 7.0 和等于或低于约 -450mV 范围内，以允许所述细菌将加入 的乙酸盐 ( 以及在所述 CO 到醇发酵中生产的任何乙酸盐 ) 转化为醇。
     此工艺可方便地涉及在分开的生物反应器中进行的两个发酵。 在此类实施方案 中，所述工艺包括用于从合适的碳和能量源生产乙酸的第一阶段发酵。 在多种实施方案 中，所述第一阶段发酵涉及将包含 CO 的气体底物转化为乙酸盐，其使用的厌氧产乙酸细 菌选自例如上文所述的适合所述 CO 到醇发酵的细菌。 所述第一阶段发酵的培养基条件 对于细菌生长和乙酸生产应该是最优的。 在此实施方案中，所述液体营养培养基的 pH 保 持在约 5.0 到约 5.7 范围内，并且氧化还原电位为约 -450mV 或更高，例如约 -400mV 到 约 -250mV。 所述乙酸盐产物从所述第一阶段发酵中回收并与包含 CO 的气体共同引入到 第二生物反应器，该反应器的条件对于通过一种或多种适于将乙酸盐转化为醇的微生物 从乙酸盐和 / 或包含 CO 的气体生产乙醇是最优的。 所述第二个发酵罐中液体的 pH 保持 在最佳生长 pH 之上，并且 ORP 保持在约 -450mV 以下。 在一具体实施方案中，所述液 体营养培养基的 pH 保持在约 5.8 到约 6.5 范围内，并且氧化还原电位在约 -450mV 或更
     低。 乙酸盐回收
     可使用本领域已知的方法从第一阶段发酵生物反应器中连续回收乙酸盐。 这些 方法包括但不限于，蒸馏、使用可渗透酸和 / 或乙酸盐选择性膜、和 / 或使用吸附柱。
     例如，可使用包括活性炭过滤器的吸附系统。 在本发明的此实施方案中，首先 使用合适的分离装置从发酵液中去除细菌细胞。 本领域已知多种基于过滤的用于产品回 收的产生无细胞发酵液的方法。 然后将所述无细胞包含乙酸盐的渗透液通过包含活性炭 的柱以吸附所述乙酸盐。 乙酸盐的酸形式 ( 乙酸 ) 比盐 ( 乙酸盐 ) 形式更容易被活性炭 吸附。 因此在通过所述活性炭柱之前所述发酵液 ( 培养基 ) 的 pH 通常地降低到约 3 以 下，以将大部分所述乙酸盐转化为乙酸形式。
     吸附到所述活性炭的乙酸可使用本领域已知的方法通过洗脱回收。 例如，可使 用乙醇洗脱结合的乙酸盐。 因为乙醇的沸点为 78.8℃，乙酸的沸点为 107℃，乙醇和乙酸 盐可使用基于挥发性的方法例如蒸馏容易地相互分离。
     在本发明的某些实施方案中，通过如下步骤从所述发酵液中回收乙酸盐 ：不断 地从所述发酵生物反应器中移出一部分发酵液，从该发酵液中分离微生物细胞 ( 方便地 通过过滤 )，和从该发酵液中回收乙酸盐。可使用上述方法通过活性炭吸附回收所述乙酸 盐。 然后所述分离的微生物细胞可返回到所述发酵生物反应器。 去除乙酸盐后剩余的无 细胞渗透液也通常地返回到所述发酵生物反应器。 在返回到所述生物反应器之前，所述 无细胞渗透液中可加入另外的营养物 ( 例如维生素 B) 以补充所述培养基。 此外，如果所 述发酵液的 pH 如上文所述被调节以增强乙酸的活性炭吸附，在返回到所述生物反应器之 前，重新调节 pH 到与所述发酵生物反应器中发酵液 pH 相近的 pH。 本发明现将参考下 述非限制性实验章节详细说明。
     实施例
     材料与方法 培养基 ： * 在 H2O(1L) 中混合 NaH2PO4(13.2g) 和 Na2HPO2 · 7H2O(1.1g)。每 1.0L 培养基 (LM23) 含量 0.5g 0.2g 0.2g 160ml 2.04g 每 1.0L 培养基 (LM33) 含量 0.5g 0.2g 0.2g培养基成分 MgCl2 · 6H2O NaCl CaCl2 100mM 磷酸钠缓冲液 (pH6.0)* NaH2PO416CN 102016052 A CN 102016062 A说0.6g 0.05ml 0.15g 10mL 10mL 1mL 0.0025g 0.75g 15g 补足至 1 升明书2.5g 0.15g 10mL 10mL 2mL 0.01g 0.5g 15g 补足至 1 升14/22 页NH4Cl 85％ H3PO4 KCl 复合痕量金属溶液 (LS06) 复合维生素 B 溶液 (LS03) 刃天青 (1000mg/L 母液 ) FeCl3 一水盐酸半胱氨酸 琼脂糖 ( 可选 ) 蒸馏水
     培养基在 pH 5.5 下如下配制。 除盐酸半胱氨酸外所有成分在 400ml 或 800ml 蒸 馏水中混合。 将该溶液通过在 95％ CO、5％ CO2 气体恒流下加热到沸腾再冷却到室温达 到无氧。 一旦冷却，加入盐酸半胱氨酸，并在体积补足至 1000ml 之前调节该溶液 pH 到 5.5 ；在整个实验过程中保持无氧。
     细菌 ：
     Clostridium autoethanogenum 来自德国生物材料资源中心 (DSMZ)。 所述细菌 的登记号为 DSMZ 10061。 可替代地，所使用的 Clostridium autoethanogenum 为以登记 号 19630 存放于德国生物材料资源中心 (DSMZ) 的 Clostridiumautoethanogenum。 登记号 15243 的 Clostridium carboxydivorans 也来自 DSMZ。
     CSTR 批量反应器中的发酵
     用于 CSTR 反应器实验的培养基如上文所述配制。 将所述培养基溶液导入所述 发酵罐，并任选地使用各种包含 CO 的气体从实验开始时或间隔预定时间后喷射。 在这 些实验期间，通过控制器自动加入缓冲液 (0.5MNaOH 或 2NH2SO4) 调节和 / 或保持 pH。 将活跃生长的 Clostridium autoethanogenum 培养物以 5％或 7.5％ (v/v) 水平接种到所述反 应器。 所述反应器的温度保持在 37℃，搅拌速率为 400rpm。
     取样和分析程序 ：
     在长达 20 天时间内间隔地从所述 CSTR 反应器中提取培养基样品。 每次对培养 基取样时，小心确保没有气体进入或逸出所述反应器。
     细胞密度 ：
     为确定这些实验中的细胞密度，在 600nm 测定所述样品的吸光度 ( 分光光度 计 )，并根据已公开的程序计算确定干重。 使用高效液相色谱 (HPLC)，在某些情况下使 用气相色谱 (GC) 分析代谢物水平。
     HPLC
     HPLC 系统 Agilent 1100 系列。 流动相 ：0.0025N 硫酸。 流量与压力 ：0.800mL/ min。 色谱柱 ：Alltech IOA ；目录号 9648，150×6.5mm，粒度 5μm。 色谱柱温度 ： 60℃。 检测器 ：折射率。 检测器温度 ：45℃。
     样品制备方法
     将 400μL 样品和 50μL 0.15M ZnSO4 以及 50μL0.15M Ba(OH)2 装入微量离心 管。 所述离心管在 4℃以 12,000rpm 离心 10 分钟。 将 200μL 上清液转入 HPLC 小瓶， 5μL 注入所述 HPLC 仪器。
     气相色谱
     气 相 色 谱 仪 HP 5890series II， 使 用 火 焰 电 离 检 测 器。 毛 细 GC 色 谱 柱 ： EC1000-Alltech EC100030m×0.25mm×0.25μm。 所述气相色谱仪以分流模式运行，氢 气总流量为 50mL/min，其中 5mL 为吹扫流量 (1 ∶ 10 分流 )，10PIS 柱头压力产生 45cm/ sec 线速度。 温度程序起始于 60℃，保持 1 分钟，然后以每分钟 30℃升高至 215℃，然后 保持 2 分钟。 注射器温度为 210℃，检测器温度为 225℃。
     样品制备方法
     500μL 样品在 4℃以 12,000rpm 离心 10 分钟。 将 100μL 上清液转入包含 200μL 水和 100μL 内标峰值溶液 (10g/L 丙醇，5g/L 异丁酸，135mM 盐酸 ) 的 GC 小瓶。 将 1μL 所述溶液注入所述 GC 仪器。
     细菌细胞内氧化还原电位
     使用 RedoxSensor green 测量细胞内还原酶活性，以提供细胞内氧化还原电位的 量度。 根据制造商说明使用 BacLightTM RedoxSensorTM Green VitalityKit(Invitrogen，目录号 349554)。
     氧化还原染色程序 ：
     1. 进行细胞计数，样品在培养基中稀释到约 1×106 细胞 /mL，每个离心管中放 入 500μL。
     2. 每个离心管中加入 0.5μL 每种染料 (RedoxSensorTM Green 和 PI( 碘化丙啶 ))， 混合并在流式细胞仪分析之前室温避光保温 10 分钟。
     流式细胞术 ：
     RedoxSensor green 和 PI 染 色 的 细 菌 悬 浮 液 的 流 式 细 胞 分 析 使 用 装 配 单 相 2201-20SLE 空气冷却的 588nm 氩激光器的 Coulter Epics Elite 流式细胞仪 (Epics Division of Coulter Corporation， Hialeah， FL， USA) 进行。 RedoxSensorgreen 荧光在 PMT2(525nm 带通滤波器 ) 上测定， PI 荧光在 PMT3(610nm 带通滤波器 ) 上测定。 补偿设置包含从 PMT3 信号中扣除 22 ％ PMT2 信号，以及从 PMT2 信号中扣除 2 ％ PMT3 信号。 使用 Expo32v1.2B 细胞仪软件 (AppliedCytometry Systems， Sacramento， CA， USA) 获得在所 述流式细胞仪上运行的样品产生的列表模式文件。 使用 FlowJo v8.5.1(Macintosh OSX) 软 件 (Tree StarIncorporated， Ashland， OR， USA) 进行模式文件分析。
     实施例 1 ：pH 和氧化还原电位 (ORP) 水平对使用包含 CO 的气体生产乙醇的影 响：
     本实施例描述的试验显示了在发酵罐中，在不同 pH 值和 ORP 水平下，连续输入 CO 作为唯一碳和能量源通过 Clostridium autoethanogenum 培养物生产乙醇的动力学。
     步骤
     1. 活跃生长的 Clostridium autoethanogenum 培养物 (DSMZ 10061) 以 7.5％ (v/v) 水平接种到 2L 厌氧 LM23 发酵培养基。 95％ CO 和 5％ CO2 的连续气流通过扩散喷射器 以 5ml/ 分钟的体积流速导入到所述发酵罐容器底部。 所述发酵罐的起始 pH 设定为 5.5。
     2. 使所述培养物生长到细菌细胞密度为每升培养基 0.1g 干细胞质量，在此时调 节所述培养物的 pH 和 ORP 并监测乙醇生产。
     3. 向所述发酵培养基加入甲基紫精至终浓度 10mg/L，以使所述培养基的 ORP 一 直保持在低水平。
     4. 在所述发酵培养基保持在 3 个不同的 pH 值 (6.5、5.8、和 4.5) 并且 ORP 水平 等于或低于 -450mV 时，随时监测所述培养基中乙醇和乙酸盐的水平。
     5. 将每个 pH 值保持并监测至少 72 小时。
     结果
     在每个 pH 值下所述培养物获得的乙醇生产率结果见下表。 在 pH 值 6.5 和 5.8 时，发现所述乙醇生产率与乙酸盐降解率相符合。 在 pH 4.5 生产乙醇时，观察到乙酸盐 降解很少或没有降解。
     pH具体乙醇生产率 (g/g/ 天 )具体乙酸盐降解率 (g/g/ 天 )19CN 102016052 A CN 102016062 A说6.5 5.8 4.5 16.0 18.0 5.0明书21.3 5.5 0.017/22 页发明者的其它试验显示微生物生长和乙酸盐生产的最佳 pH 为 5-5.7。 上述结 果说明使用包含 CO 的气体作为唯一碳和能量源的 C.autoethanogenum 培养物可在升高的 pH(pH 5.8 到 6.5) 下在 ORP 低于 -450mV 的包含乙酸盐的培养基中生产乙醇。 通过升高 pH，所述细菌与乙酸盐降解相关地生产乙醇，具体乙醇生产率为～ 15g/g/ 天。 同时乙酸 盐具体降解率为～ 20g/g/ 天。
     然而，在低 pH(pH 4.5) 下在包含乙酸盐的培养物中，所述细菌生产乙醇没有在 升高的 pH 水平下观察到的相关的乙酸盐降解。 在这些条件下，具体乙醇生产率为～ 5g/ g/ 天。
     实施例 2 ：监测微生物培养物的细胞内氧化还原电位
     实施例 2A ：监测批量微生物培养物的细胞内氧化还原电位和细胞活力步骤
     1. 如上所述配制 pH 5.5 的 LM23 发酵培养基。
     2. 在 95％ CO 和 5％ CO2 的连续气流下，向 250ml 血清瓶中注入 50mlLM23 培养 基。 所有瓶子用不透气的丁基橡胶隔片塞住并卷曲密封，然后在 121℃灭菌 20 分钟。
     3. 一旦冷却，将血清瓶分为两组。 在一组中，向培养基中加入甲基紫精至终浓 度 40μg/ml。 检查所有瓶子的 pH，如有必要调节至 5.5。 所有瓶子接种 1ml 在 95％ CO 和 5％ CO2 中活跃生长的 Clostridiumautoethanogenum 培养物。 顶部空间气体用 95％ CO 和 5％ CO2 加压到 35psig。 从每个瓶子中无菌提取起始培养基样品。 将瓶子放置在 37℃ 摇床上。
     4. 在 15 天时间内以规律性间隔提取培养基样品。 每次所述培养基取样时，每个 瓶子的顶部空间用 95％ CO 和 5％ CO2 冲洗 3 次，然后用所述气体加压到 35psig。
     5. 从每个血清瓶制备样品并分析 ：光密度 (150μL 在 620nm)、乙醇水平、乙酸 盐水平、用于流式细胞术的氧化还原染色、和用于流式细胞术的活 / 死染色。
     在血清瓶中生长 Clostridium autoethanogenum(DSMZ 10061)- 对照与甲基紫精 (40μg/mL)。 每天取样，用 RS 染色并通过流式细胞术分析。 基于 RS 阳性 ( 绿色染色， 高还原酶活性 )、 RS 阴性 ( 红色染色，低还原酶活性 )、或两者都不是 ( 未知还原酶活 性 ) 进行细胞分类。 然后计量高氧化还原电位的细胞与低氧化还原电位的细胞的比例。
     结果
     参考图 2， RS 阳性细胞比例随培养进行而增加，在第 4 天到第 8 天之间达到峰 值。 从第 9 天开始， RS 阳性细胞比例减少，到第 14 天，剩余极少 RS 阳性细胞。 在甲 基紫精处理的培养物中， RS 阳性细胞比例在第 4 天达到峰值，并比在对照中减少更快。
     这些结果表明还原酶活性的增加与活跃生长的 C.autoethanogenum 培养物有关， 在进行产溶剂的衰老培养物中观察到还原酶活性降低。 因此，对于图 2 所示数据，可确 定所述培养基的环境参数优选地应该在第 4 天左右或之后的某个时间从适合产乙酸阶段
     的参数转换为适合产溶剂阶段的参数。 第 8 天之后， RS 阳性细胞百分比开始下降，这 表明细胞正在死亡。 根据本发明的方法，这种表现可在工业工艺中用作信号，用于采取 行动以恢复适合产乙酸阶段的条件，和 / 或向所述发酵罐中加入更多细胞和 / 或加入更多 营养物。 这种行动可与去除部分内容物共同进行。 可替代地，细胞死亡的这种表现 ( 或 细胞死亡的其它表现 ) 可根据本发明的方法用作更换发酵罐内容物的信号，这特别适用 于批量处理。 当加入细胞时，所述细胞可与所述发酵罐中原来存在的微生物同种或不同 种，而不偏离本发明的范围。 例如，在单个发酵罐中进行的二阶段工艺中，在多个实施 方案中可能需要不同的细胞系。
     所述 RS green 试剂提供了微生物群体的细胞内氧化还原电位的量度，并因而提 供了生物反应器中微生物群的状态或活力的指征。 当检测到细胞内氧化还原电位变化 时，可改变所述生物反应器中的发酵参数或条件以改进醇生产条件。
     实施例 2B ：监测微生物的细胞内氧化还原电位和群体活力，所述微生物取自配 置来稳定地生长和生产乙酸盐的连续培养物
     步骤
     1. 通过在血清瓶培养中物接种 5L 厌氧 LM33 培养基 (pH 5.5，温度 37℃ ) 起始 C.autoethanogenum(DSMZ 10061) 的连续培养物，所述血清瓶培养物接着与甘油储存母液 共培育。 70％ CO、15％ CO2、1％ H2、和 14％ N2 的混合气体以 64mL/min 速率喷射到 所述培养物的基质。
     2. 然后使培养物作为批量培养物生长并增加生物质 5 天，然后起始连续培养方 式。
     3. 然后将新鲜厌氧 LM33 培养基以 3mL/min 速率连续导入到所述反应器，基于 设定为 5L 容量的液位探针间歇地移除所述培养物。
     结果
     一旦稳定，所述 C.autoethanogenum 的连续培养物在 15 天过程中保持干重生物质 在 0.6-0.8g/L 范围内，剩余乙酸盐水平在 6-8g/L 范围内。 没有观察到醇生产，或者观察 到水平极低。 在所述连续培养物中活细胞与总细胞的比例一直在 80％ -90％范围内 ( 使 用 RedoxSensor green 和碘化丙啶染料荧光的流式细胞分析测定 )。
     在活跃生长期间，如在所述连续培养物中所见， C.autoethanogenum 生产高水平 的乙酸，伴随着极低水平的乙醇。 生物质生产看来与刺激乙醇生产不相容。 RedoxSensor green 和碘化丙啶染色的 C.autoethanogenum 细胞的流式细胞观察对所述连续培养物提供 了群体动力学的有用视点。 除测定活 (RedoxSensor green 阳性，碘化丙啶阴性 ) 与非活 (RedoxSensor green 阴性，碘化丙啶阳性 ) 细胞比例外，还明确了中间群体。 所述双阳性 染色细胞群体在连续培养物中很少 ( 在总培养物 3-9％范围内 )，但是却在进行溶剂生产 的培养物中构成更重要的部分 ( 例如，参见实施例 4)。
     在所述活跃生长期，可改变或保持发酵参数和 / 或生物反应器条件以促进微生 物生长和 / 或乙酸盐生产。
     实施例 2C ：监测 pH 5.5 的批量微生物培养物的细胞内氧化还原电位和细胞活力
     步骤
     1. 通过在活跃生长的连续培养物中接种 1L 厌氧 LM33 培养基 (pH5.5，温度37℃ ) 起始 C.autoethanogenum(DSMZ 10061) 的批量培养物。 用 70％ CO、15％ CO2、 1％ H2、和 14％ N2 的混合气体以 64mL/min 速率喷射到所述培养物的基质。
     2. 然后使所述培养物生长并增加生物质，定期取样，但不加入更多营养物。
     在 C.autoethanogenum 批量培养物 ( 在 pH 5.5 及 70 ％ CO、15 ％ CO2、1 ％ H2、 和 14％ N2 的混合气体中生长 ) 中，24 小时期间乙醇与乙酸生产比约为 1 ∶ 6。 在所述生 产期间，所述培养物的氧化还原电位在 -446 到 -430mV 范围内。 使用 RedoxSensor green 试剂随时追踪的细胞内部氧化还原电位显示所述培养物的 90％ ( 第 3 天 ) 到 77％ ( 第 7 天 ) 具有活力。 该比例到第 10 天急剧下降到仅 18％，这表明由于所述批量培养物的封闭 状态，环境不适合持续培养物生长。
     此外，在所述活跃生长期，可改变或保持发酵参数和 / 或生物反应器条件以促 进微生物生长和 / 或乙酸盐生产。
     实施例 3 ：氧化还原电位 (ORP) 水平对使用包含 CO 的气体生产乙醇的影响
     本实施例描述了在不同 ORP 水平和限定 pH(pH 6.2) 下的乙醇生产。
     步骤
     1. 用活跃生长的 Clostridium autoethanogenum 培养物 (DSMZ 19630) 以 5％ (v/v) 水平接种 1 升 CSTR 中的 1L 厌氧 LM33 发酵培养基。 95％ CO 和 5％ CO2 的连续气流通 过扩散喷射器以 19ml/ 分钟的体积流速导入到所述发酵罐容器底部。 将所述发酵罐的起 始 pH 调节到 5.5。
     2. 使所述培养物生长到细菌细胞密度为每升培养基 0.35g 干细胞质量，在此时调 节所述培养物的 pH 到 6.2。
     3. 如上制备另一培养物。 使该培养物生长到细菌细胞密度为每升培养基 0.3g 干 细胞质量，在此时调节所述培养物的 pH 到 6.2。
     4. 向第一个培养物中加入 0.5g/L L- 半胱氨酸 · H2O，向第二个培养物中加入 10mg/L 甲基紫精，以使每个培养物达到所需 ORP 水平。
     5. 通过细菌氧化还原活性监测培养物的活力。 使用购自 Invitrogen 的用于流式细 胞术试剂盒的 Baclight redoxsensor green 活力显示细胞内氧化还原电位和由此得出的细胞 活力。
     结果
     向 第 一 个 培 养 物 中 加 入 L- 半 胱 氨 酸 · HCl 保 持 所 述 发 酵 培 养 基 的 ORP 为 -500mV。 向第二个培养物中加入甲基紫精保持所述发酵培养基的 ORP 为 -600mV。 每个培养物达到的乙酸盐降解率和乙醇生产率结果见下表。
     ORP(mV)乙酸盐降解 (mM/ 天 ) 16.7 0乙醇生产 (mM/ 天 ) 34 0-500 -600
     加入半胱氨酸或甲基紫精补充剂之前，微生物细胞活力约为 72％。 加入半胱氨酸后， ORP 降低到约 -500mV，培养物活力降低到约 32％。 加入半胱氨酸后，中间细胞 的比例从约 6％升高到 16％。
     向所述培养物加入甲基紫精后，约 5％群体被认为是活的。
     所得结果表明使用 CO 气体作为唯一碳和能量源的 Clostridiumautoethanogenum 培养物在 -600mV 水平变得基本失活。 在 -500mV 和 pH 6.2 水平，乙酸盐被消耗，而乙 醇水平升高，这表明至少一部分乙酸盐转化为乙醇。
     细胞内氧化还原电位检测显示当 ORP 降低到 -500mV 且生产乙醇时，活细胞和 中间细胞的比例显著降低。 因此，根据本发明的方法，活细胞和 / 或中间细胞的变化显 示了所述培养物在乙醇是否生产和 / 或乙酸盐是否消耗方面的总体状态。
     实施例 4 ：pH 对使用包含 CO 的气体生产乙醇的影响
     本实施例描述了不加入还原剂在不同 pH 值下的乙醇生产。 图 3 提供了在 2 周时 间内乙酸盐、乙醇、和生物质浓度的总结。 实施例 4A 概述了所述发酵的前 4 天，其中 pH 保持为 5.6，然后升高到 pH 5.9 保持 1 天。 实施例 4B 概述了后 9 天，其中 pH 保持为 6-6.1。
     步骤
     1. 用活跃生长的 Clostridium autoethanogenum 培养物 (DSMZ 19630) 以 5 ％ (v/ v) 水平接种 1 升 CSTR 中的 1L 厌氧 LM33 发酵培养基。 用 70 ％ CO 和 15 ％ CO2、1 ％ H2、14％ N2 的连续气流通过扩散喷射器以 19ml/ 分钟的体积流速导入到所述发酵罐容器 底部。 将所述发酵罐的起始 pH 调节到 5.5。
     2. 对所述实验的大部分，通过细胞循环和培养基交换系统将所述培养物的乙酸 浓度保持在 4g/L 以下。 使所述细胞流过横向流动膜 Viva 200，收集滤液，将所述细胞返 回所述反应器。 用新鲜培养基替换滤液以确保所述反应器中的培养基体积保持不变。
     3. 将所述培养连续进行至少 14 天。 所述细胞循环系统每 1-2 天从所述生物反应 器移除 1-1.5L 液体营养培养基，而不移除细菌。 用新鲜培养基替换移除的培养基以保持 体积不变。
     实施例 4A
     pH 保持在约 5.6 持续 3 天，在此期间 ORP 在 -400 到 -430mV 之间波动。 3 天 之后，将 pH 调节到约 5.9， ORP 降低到约 -470mV。
     pH 5.6(3 天 ) 5.9(1 天 )
     乙酸盐 (mM/ 天 ) 15.3 -5.17乙醇 (mM/ 天 ) 9.8 31.3乙酸盐 ：乙醇比例 1.56 ∶ 1这些结果显示，在 pH 5.6，乙酸盐和乙醇同时生产，乙酸盐过量。 参考图 3，所 述发酵阶段也与微生物生长期相关。 当 pH 升高且 ORP 降低到约 -470mV 时，乙醇生产 率升高，而部分乙酸盐被消耗。 实施例 4B23
     CN 102016052 A CN 102016062 A
     说明书21/22 页同样的培养物通过加入缓冲液 ( 碱和酸 ) 调节并保持 pH 6 到 6.1。 在 pH 6 到 6.1，所述培养物保持 ORP 为 -480 到 -487mV。 所述培养物在不同的 pH 值下达到的乙酸 盐和乙醇生产率结果如下表所示。 pH 6-6.1(9 天 ) 乙酸盐 (mM/ 天 ) 19.75 乙醇 (mM/ 天 ) 28.9 乙酸盐∶乙醇比例 1 ∶ 1.46
     这些结果显示，在升高的 pH(6-6.1) 和 ORP(-480 到 -487mV) 下，乙醇与乙酸 盐的摩尔比可保持高于 1 ∶ 1( 有利于乙醇 ) 更长的时间。 虽然乙酸盐总体增长，但乙醇 生产率显著提高，这表明至少一部分所述发酵中产生的乙酸盐转化为乙醇。 在共同监测 pH 和 ORP 并使其保持在所需范围内的这一方法中，醇产品生产超过次要的酸副产品。
     也监测细胞内氧化还原电位。 在 pH 5.6( 参见实施例 4A)，活群体为 79％，中 间群体为 10.6％。 然而，当 pH 升高，活群体为 44％ ( 平均值 )，中间群体为 20％ ( 平 均值 )。 在这些条件下，醇是主要产物，并且可改变或保持发酵参数和 / 或生物反应器条 件以促进醇生产更长的时间。
     实施例 5 ：pH 对在批量培养物中使用包含 CO 的气体生产乙醇的影响
     本实施例描述了在批量培养物中不加入还原剂在不同 pH 值下的乙醇生产。
     步骤
     1. 用活跃生长的 Clostridium autoethanogenum 培养物以 5％ (v/v) 水平接种 1 升 CSTR 中的 10L 厌氧 LM33 发酵培养基 ( 培养基配方如上所述 )。发酵罐温度设定为 37℃， 搅拌速率为 400rpm。 用 95％ CO 和 5％ CO2 的连续气流通过扩散喷射器以 19ml/ 分钟的 体积流速导入到所述发酵罐容器底部。 将所述发酵罐的起始 pH 设定为 5.5。
     2. 然后通过加入缓冲液调节培养基 pH 到 7，之后每两天通过加入缓冲液使其降 低到 6.5、6 和 5.7。
     结果
     当培养基 pH 从 5.5 调节到 7 时，所述培养物在乙醇生产方面变得不活跃，并且 ORP 在 -550 到 -600mV 范围内。 当 pH 从 7 降低到 6.5 时，以 26mmol 每克细胞干重每天 生产乙醇，且乙酸盐降解速率为 13mmol 每克细胞干重每天。 当 pH 从 6.5 下降到 6 时， 继续以相同速率生产乙醇。 ORP 在 -510 到 -550mV 之间。
     低 ORP(-550 到 -600mV) 与相对高 pH(pH 7) 的组合似乎基本上抑制了所述培 养物中的乙醇生产。 然而，当 pH 降低 ( 到 pH 6 到 6.5 之间 ) 时， ORP 升高 (-510mV 到 -550mV)，并且乙酸转化为乙醇，导致增加的乙醇生产。
     实施例 6 ：升高 pH 对不同微生物使用包含 CO 的气体生产乙醇的影响材料
     1. 使用气体作为唯一碳和能量源 (70％ CO 1％ H215％ CO214％ N2 气流 ) 培养并 保持的活跃生长的 Clostridium carboxidivorans 培养物。
     步骤
     1. 用活跃生长的 Clostridium carboxidivorans 培养物以 5 ％ (v/v) 水平接种 2 升 CSTR 中的 1.5L 厌氧 LM33 发酵培养基。 发酵罐温度设定为 37℃，搅拌速率为 400rpm。
     用 70％ CO 和 15％ CO21％ H214％ N2 的连续气流通过扩散喷射器以 19ml/ 分钟的体积流 速导入到所述发酵罐容器底部。 将所述发酵罐的起始 pH 调节为 6。
     2. 使所述培养物生长到在 600nm 光密度 0.9，然后调节 pH 到 6.5 和 7。
     3. 使用 HPLC 和气相色谱分析所述样品。
     结果
     培养物的乙酸和乙醇生产结果见下表。
     pHORP (mV) -480 -528 -571乙酸生产 (mM/ 天 ) 12.5 16.7 -1乙醇生产 (mM/ 天 ) 0 4 3.36 6.5 7
     Clostridium carboxidivorans 培养物的生长和相关的乙酸盐生产的最佳 pH 一般为 6-6.5。 上述结果显示，在 pH 6，生产乙酸盐而不同时生产乙醇。 在 pH6.5，生产乙酸 和乙醇。 在 pH 7，消耗乙酸盐而生产乙醇。 这表明在升高的 pH(pH7)，至少一部分发 酵液中的乙酸盐转化为乙醇。 已知 Clostridiumcarboxidivorans 生产乙酸、丁酸、乙醇和丁 醇。
     本文所述的特定方法和组合物代表优选的实施方案，用于示例且无意限制本发 明的范围。 通过考虑本说明，本领域技术人员可想到其它对象、方面、和实施方案，这 些其它对象、方面、和实施方案都包含在本发明的范围和精神内。 对本领域技术人员显 而易见的是，可对本文公开的发明进行变化的替代和修改，而不偏离本发明的范围和精 神。 本文说明性描述的发明可在缺少本文未作为要素特别公开的任何因素或限制的情况 下适当实施。 因此，例如，在本文每个实例中，在本发明的实施方案或实施例中，术语 “包含”、 “包括” 等等应扩展阅读并不具有限制性。
     题目、标题等等系为加强读者对本文的理解而提供，不应视为对本发明范围的 限制。
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