具有改善的表达和稳定性的 DNA 质粒 引入作为参考
本申请参考于 2006 年 4 月 27 日提交的美国临时申请 60/795,324。 本文引用或 参考的所有文件 ( “本文引用文件”)，以及本文引用文件中引用或参考的所有文件，连 同关于本文或引入本文作为参考的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明书、 描述、产品规格说明和产品清单，在此引入本文作为参考，并且可以在本发明的实践中 使用。
发明领域
总的来说，本发明涉及 DNA 疫苗和使用其的方法。 更具体而言，本发明涉及可 用于 DNA 疫苗的具有改善的表达和稳定性的 DNA 质粒。
发明背景
DNA 疫苗也称为基因、质粒或多核苷酸疫苗，代表利用基因转移用于针对抗原 免疫接种的相对简单和经济的方法。 与 DNA 疫苗相关的低毒性有利于它的进一步开发， 但如果要将它成功地整合到临床环境内，那么需要改善这种方法的效力的另外策略 ( 由 Shaw 和 Strong， Front Biosci.2006 Jan 1 ；11 ：1189-98 综述 )。 DNA 疫苗接种可以克服 常规疫苗策略的大多数缺点，并且具有用于未来疫苗的潜力。 然而，商业产品仍未到达 市场。 一个可能的解释可以是该技术无法在人中诱导有效的免疫应答，但安全性也可能 是基本问题 ( 由 Glenting 和 Wessels， Microb Cell Fact.2005 Sep 6 ；4 ：26 综述 )。
pVR1020 或 1012 质 粒 (VICAL Inc. ；Luke C. 等 人， Journal ofInfectious Diseases，1997，175，91-97 ；Hartikka J. 等 人， HumanGene Therapy，1996，7， 1205-1217，参见例如，美国专利号 5,846,946 ；6,451,769 ；6,586,409 和 6,875,748) 是利 用多核苷酸序列插入的 DNA 质粒载体。 pVR1020 质粒衍生自 pVR1012，并且包含人 tPA 信号序列。 另外的 DNA 质粒在例如美国专利号 6,852,705 ；6,818,628 ；6,586,412 ； 6,576,243 ；6,558,674 ；6,464,984 ；6,451,770 ；6,376,473 和 6,221,362 中发现。 然而，关 于基于 pVR1012 的质粒用于 DNA 疫苗接种存在缺点，例如质粒不稳定性和拷贝数异质 性。
因此，需要有效的 DNA 疫苗，特别是就目的靶抗原、表位、免疫原、肽或多肽 以足以引发保护应答的量表达而言。
本申请中任何文件的引用或鉴定并非承认此种文件可用作本发明的现有技术。
发明概述
本发明部分基于下述实验观察 ：如预期的，在卡那霉素抗性基因启动子和翻 译起始之间插入转座子取消卡那霉素抗性，并且出乎意料地，使得能够高速率的质粒复 制。 换言之，突变型 ( 包含转座子 ) 的质粒产率比亲本质粒产率高 3 倍。 因此，假设卡 那霉素抗性 ( “KanaR”) 基因的表达效率对细菌中的质粒复制有影响，即减少的卡那霉 素抗性表达导致增加的质粒复制率。 特别地，高 KanaR 表达率可能代表强代谢负荷，这 干扰最佳质粒复制率和 / 或 KanaR 基因转录干扰复制起点 (ORI)。本发明涉及可以包含卡那霉素抗性 ( “KanaR” ) 基因的 DNA 质粒，其中卡那 霉素抗性基因包含对于 KanaR 表达较不有效的启动子和 / 或较不有效的起始密码子。 在 一个有利的实施方案中，KanaR 启动子是 P1 启动子。 所得到的 DNA 质粒导致更高的质 粒产率和更高的质粒稳定性，推测是由于减少的 KanaR 表达。 有利地，DNA 质粒可以是 pLL10 或 pLL14。
本发明还涉及可以包含卡那霉素抗性基因的 DNA 质粒，其中将转座子插入在 KanaR 启动子和翻译起始之间，从而导致减少的 KanaR 表达。 所得到的 DNA 质粒导致 更高的质粒产率和更高的质粒稳定性，推测是由于减少的 KanaR 表达。
本发明包含用于递送和表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的制剂，其中 制剂可以包含本文公开的任何 DNA 质粒和药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形 剂。在一个有利的实施方案中，载体、媒介物或赋形剂可以促进载体或蛋白质的转染和 / 或改善载体或蛋白质的保存。 有利地，目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽可以衍生自 禽类、牛、犬、马、猫或猪病毒或病原体。
本发明进一步提供了在动物中刺激免疫应答的方法，其可以包括给动物的细胞 施用有效量的本文公开的制剂，并且在细胞中表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多 肽。 本发明还提供了在动物中引发免疫应答的方法，其可以包括给动物的细胞施用有效 量的本文公开的制剂，并且在细胞中表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。 有利 地，动物可以是禽类、牛、犬、马、猫或猪。 本发明还包含用于执行上文描述的任何一种方法的试剂盒，其可以包含本文公 开的 DNA 质粒或制剂加上用于执行在动物中刺激或引发免疫应答的方法的说明书。
应当指出在本公开内容且特别是权利要求和 / 或段落中，术语例如 “包含” 等 可以具有在美国专利法中已归于其的含义 ；例如，它们可以意指 “包括” 等 ；并且术语 例如 “基本上由 ...... 组成” 具有在美国专利法中已归于其的含义，例如，它们允许未明 确描述的元件，但排除在现有技术中发现或影响本发明的基本或新型特征的元件。
这些和其他实施方案在下述详述中公开或由于下述详述是显而易见的，并且由 下述详述包含。
附图简述
给出作为例子但不意欲使本发明仅限制于所述具体实施方案的下述详述与附图 结合可以最好地理解，其中 ：
图 1 描述了如实施例 1 中鉴定的 KanaR 表达盒的 3 种潜在启动子 ：P1(SEQ ID NO ：1)、 P2(SEQ ID NO ：2) 和 P3(SEQ ID NO ：3)。 P2 和 P3 部分重叠 ；
图 2 描述了 pVR1012 的示意图，举例说明了 KanaR 转录方向和复制起点 ORI 的 位置 ；
图 3 举例说明了实施例 1 中的质粒 pVR1012 的 KanaR 盒如何被克隆到诱变载体 pALTER-1 内 ；
图 4 描述了实施例 1 中的 PacI 限制位点如何被引入 KanaR ORF 下游，产生质粒 pLL2， SwaI 限制位点被引入上游， RsrII 限制位点被引入下游，产生 pLL4，并且最后使 翻译起始密码子 ATG 突变成 TTG，产生 pLL6 ；
图 5 描述了实施例 1 中的 pLL4 的经突变的 KanaR 盒如何被克隆到质粒 pVR1012
内，产生 pLL7 ；
图 6 描述了实施例 1 中鉴定的 rmB 终止序列如何通过 PCR 从 pSB062 被克隆到 质粒 pLL7 内，和后续 PacI RsrII 消化，以形成 pLL9 ；
图 7 描述了实施例 1 中鉴定的 speA 终止序列通过合成寡核苷酸的退火被克隆到 质粒 pLL7 内，和 PacI RsrII 消化，以形成 pLL11 ；
图 8 描述了质粒 pLL6 的经突变的翻译起始序列如何通过 MscIPacI 消化被克隆到 pLL9 内，以形成 pLL10 ；
图 9 举 例 说 明 了 实 施 例 1 中 鉴 定 的 启 动 子 序 列 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 与 P1(SEQ ID NO ：1)、 P1(SEQ ID NO ：1) 和 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 如 何 分 别 通 过 URS11-URS12 PCR、 URS13-URS12 PCR 和 URS11-URS14 PCR 被克隆 ；
图 10 描述了启动子序列 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 与 P1(SEQ IDNO ：1) 如何被 克隆到质粒 pLL9 内，以形成 pLL13 ；
图 11 描述了启动子序列 P1(SEQ ID NO ：1) 如何被克隆到质粒 pLL9 内，以形 成 pLL14 ；
图 12 描述了启动子序列 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 如何被克隆到质粒 pLL9 内， 以形成 pLL15 ；
图 13 描述了启动子序列 P1(SEQ ID NO ：1) 如何被克隆到质粒 pLL7 内，以形 成 pLL16 ；
图 14 描 述 了 用 实 施 例 1 中 鉴 定 的 各 种 合 适 的 启 动 子 和 终 止 子 产 生 的 几 种 pVR1012 衍生物。 pLL13、 pLL14、 pLL15 和 pLL16 构建体具有在 CMV 启动子和 Kana P1(SEQ ID NO ：1) 启动子之间的 192 碱基对缺失 ；
图 15 描述了 pVR1012 衍生物的示意图，举例说明了实施例 1 的 pLL13 至 pLL16 构建体中缺失的 192 碱基对区 ；
图 16 描述了根据实施例 1，分别在 50μl 和 100μl 细菌悬浮液稀释物下，细菌 菌落抵抗渐增的卡那霉素浓度能力的 2 个曲线图 ；
图 17 描述了在实验室生长条件下获得的质粒产率的曲线图。 实施例 1 的细菌菌 落在具有 Kana 100μg/ml 的液体 LB 培养基中生长 ；
图 18 描述了表示为与 pLL14 质粒产率的比的质粒产率 ( 基线＝ 100)。 实验 1 描述了 8-15 个克隆 / 构建体，实验 2 描述了关于 pVR1012 的 6 个克隆，关于 pLL14 的 2 个克隆和关于 pLL16 的 25 个克隆，以及实验 3( 关于 pVR1012、 pPB662 和 pLL14 的 25 个克隆，和关于 pLL19 的 20 个克隆 ) ；
图 19 描述了在实验室生长条件下获得的质粒产率的曲线图。 细菌菌落在 EGLI 培养基中生长。 质粒产率表示为与 pVR1012 亲本质粒产率的比 ( 基线＝ 100) ；和
图 20 描述了显示克隆异质性的个别质粒产率 ( 对 pVR1012 构建体平均值的指 数 )(* ：突变质粒 )，并且描述了根据实施例 1 的 3 个不同构建体 EGLI 适应克隆中的质 粒产率的曲线图。 变异性表示为指数，其中第一个克隆视为 100％参照。
详述
本发明部分基于下述实验观察 ：如预期的，在卡那霉素抗性基因启动子和翻 译起始之间插入转座子取消卡那霉素抗性，并且出乎意料地，使得能够高速率的质粒复制。 换言之，突变型 ( 包含转座子 ) 的质粒产率比亲本质粒产率高 3 倍。 因此，假设卡 那霉素抗性 ( “KanaR”) 基因的表达效率对细菌中的质粒复制有影响，即减少的卡那霉 素抗性表达导致增加的质粒复制率。 特别地，在营养限制的背景下，高 KanaR 表达率可 能代表强代谢负荷，这干扰最佳质粒复制率和 / 或 KanaR 基因转录干扰复制起点 (ORI)。
本发明包含任何预期的 DNA 质粒，其中与例如无减少的 KanaR 表达的 pVR1012 质粒或其衍生物比较， KanaR 表达减少，从而导致增加的质粒产率和更高的质粒稳定 性。
本发明涉及可以包含 KanaR 的 DNA 质粒，其中卡那霉素抗性基因包含对于 KanaR 表达较不有效的启动子和 / 或较不有效的起始密码子。在一个有利的实施方案中， KanaR 启动子是 P1 启动子，并且起始密码子是 ATG。 推测是由于减少的 KanaR 表达， 所得到的 DNA 质粒导致更高的质粒产率和更高的质粒稳定性。 有利地， DNA 质粒可以 是 pLL10 或 pLL14。
本发明还涉及可以包含卡那霉素抗性基因的 DNA 质粒，其中将转座子插入在 KanaR 启动子和翻译起始之间，从而导致减少的 KanaR 表达。 所得到的 DNA 质粒导致 更高的质粒产率和更高的质粒稳定性，推测是由于减少的 KanaR 表达。 表达载体是质粒载体或 DNA 质粒载体，特别是体内表达载体。 在一个具体的 非限制性例子中， DNA 质粒载体包含 pVR1020 或 1012 质粒 (VICAL Inc. ；Luke C. 等 人， Journal of Infectious Diseases，1997，175，91-97 ；Hartikka J. 等 人， Human Gene Therapy，1996，7，1205-1217，参见例如，美国专利号 5,846,946 ；6,451,769 ；6,586,409 和 6,875,748) 的元件。 pVR1020 质粒衍生自 pVR1012，并且包含人 tPA 信号序列。 在一 个实施方案中，人 tPA 信号包含在 Genbank 中在登记号 HUMTPA14 下的氨基酸 M(1) 到 氨基酸 S(23)。在另一个具体的非限制性例子中，用作载体用于插入多核苷酸序列的质粒 可以包含在 Genbank 中在登记号 U28070 下的氨基酸 M(24) 到氨基酸 A(48)。 关于在实 践中可以参考或采用的 DNA 质粒的另外信息见于例如美国专利号 6,852,705 ；6,818,628 ； 6,586,412 ；6,576,243 ；6,558,674 ；6,464,984 ；6,451,770 ；6,376,473 和 6,221,362。
在 另 一 个 实 施 方 案 中， 质 粒 可 以 是 具 有 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 的 任 何 质 粒， 包 括 但 不 限 于 Clontech 载 体 Living Colors pAcGFP1、 LivingColors pAcGFP1-C1、 Living Colors pAcGFP 1- N 1 、 pAmCyan 1- C 1 、 pAmCyan 1- N 1 、 pAsRed 2- C 1 、 pAsRed 2- N 1 、 pCMV - DsRed - Express 、 pDsRed 2-1 、 pDsRed 2- C 1 、 pDsRed 2- N 1 、 pDsRed-Express-1、 pDsRed-Express-C1、 pDsRed-Express-N1、 pDsRed-Monomer-C1、 pDsRed-Monomer-N1、 pHcRed1-1、 pHcRed1-C1、 pHcRed1-N1/1、 pIRES2-DsRed2、 pIRES2-DsRed-Express、 pLPS-AcGFP1-N Acceptor、 Proteasome Sensor、 pTimer、 pZsGreen1-1、pZsGreen1-C1、pZsGreen1-N1、pZsYellow1-C1 和 pZsYellow1-N1 Vector ； Invitrogen 载 体 pCR3、 pCR3.1-Uni、 pCR1000 和 pZEr0-2.1 和 StratagenepCMV-3Tag、 pBK-CMV Phagemid、ZAP Express、pCMV-Script、pCMV-Tag、PCR-Script pMC1neo 和 pMC1neo Poly A 载体。 还参考美国专利号 6,942,975、6,887,702、6,849,442、6,846,970、 6 , 825 , 012 、 6 , 806 , 399 、 6 , 803 , 230 、 6 , 790 , 607 、 6 , 696 , 278 、 6 , 667 , 150 、 6 , 624 , 344 、 6 , 620 , 990 、 6 , 610 , 909 、 6 , 585 , 976 、 6 , 573 , 437 、 6 , 570 , 067 、 6 , 562 , 584 、 6 , 528 , 703 、 6 , 503 , 748 、 6 , 475 , 731 、 6 , 410 , 317 、 6 , 410 , 314 、 6 , 387 , 654 、 6 , 376 , 744 、 6 , 3 50 , 934 、
6 , 303 , 383 、 6 , 297 , 054 、 6 , 284 , 541 、 6 , 258 , 999 、 6 , 255 , 560 、 6 , 248 , 937 、 6 , 235 , 518 、 6 , 174 , 708 、 6 , 127 , 171 、 6 , 121 , 511 、 6 , 117 , 651 、 6 , 054 , 635 、 6 , 037 , 524 、 6 , 018 , 103 、 5 , 994 , 625 、 5 , 981 , 191 、 5 , 981 , 182 、 5 , 977 , 439 、 5 , 925 , 544 、 5 , 910 , 488 、 5 , 866 , 404 、 5 , 851 , 808 、 5 , 851 , 804 、 5 , 830 , 727 、 5 , 824 , 877 、 5 , 792 , 935 、 5 , 783 , 394 、 5 , 750 , 871 、 5 , 733 , 753 、 5 , 733 , 744 、 5 , 731 , 179 、 5 , 723 , 746 、 5 , 716 , 803 、 5 , 712 , 112 、 5 , 705 , 361 、 5 , 654 , 180 、 5 , 599 , 670 、 5 , 591 , 577 、 5 , 589 , 623 、 5 , 569 , 834 、 5 , 567 , 599 、 5 , 565 , 347 、 5 , 504 , 005 、 5 , 463 , 174 、 5 , 460 , 952 、 5 , 436 , 138 、 5 , 416 , 250 、 5 , 416 , 011 、 5 , 378 , 618 、 5 , 256 , 568 、 5 , 169 , 755 、 5 , 137 , 829 、 5 , 053 , 335 、 5 , 004 , 863 、 4 , 935 , 340 、 4 , 920 , 054 、 4,795,855、4,782,022、4,771,002、4,626,510 和 4,567,146。
本发明还包含具有除卡那霉素抗性外的其他抗生素抗性基因的质粒，例如但不 限于氨苄青霉素、氯霉素、新霉素和四环素抗性。
在 一 个 实 施 方 案 中， 质 粒 可 以 是 具 有 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 的 任 何 质 粒， 包 括 但 不 限 于， Clontech 载 体 Living Colors pAcGFP1、 pAmCyan、 pAsRed2、 pbetagal - Basic、 pbetagal - Control 、 pBI Tet 、 pBI - G Tet 、 pBI - L Tet 、 pCMVbeta 、 pCMV-Myc & pCMV-HA、 pDsRed2、 pDsRed-Express、 pDsRed-Monomer Vector、 pGFP 、 pGFPuv 、 pHcRed 1 、 pIRES 、 pIRESbleo 3 、、 pIRESneo 3 、 pIRESpuro 3 、 pLP - IRESneo Acceptor 、 pLP - LNCX Acceptor 、 pLP - TRE 2 Acceptor 、、 pPUR 、 pRevTet - Off 、 pRevTet - Off - IN 、 pRevTet - On 、 pSEAP 2- Basic 、 pSEAP 2- Control 、 pTet-Off、 pTet-On、 pTet-tTS、 pTimer、 pTimer-1、 pTK-Hyg、 pTRE2、 pTRE2hyg、 pTRE2hyg2-6xHN、 pTRE2hyg2-HA、 pTRE2hyg2-Myc、 pTRE2pur、 pTRE2pur-6xHN、 pTRE2pur-HA、 pTRE2pur-Myc、 pTRE-6xHN、 pTRE-HA、 pTRE-Myc、 pTRE-Tight、 pTRE-Tight-DsRed2、 pZsGreen 和 pZs Yellow ；Invitrogen 载 体 p2Bac、 p2Bac/CAT/ CAT、 pAc5.1/V5-His、 pAc5.1/V5-His/LacZ、 pBAD-TOPO、 pBlueBac、 pBlueBac/ His 、 pBlueBac / His / CAT 、 pBlueBac 2 、 pBlueBac 3 、 pBlueBac 4 、 pBlueBac 4/ CAT 、 pcDNA 1/ Amp 、 pcDNA 3/ CAT 、 pcDNAII 、 pCMVSport 1 、 pCMVSport 2 、 pCMVSport2.2、 pCMVSport 4、 pCR3 、 pCR3 . 1-Uni、 pCRBac、 pCRT7/ CT-LacZ、 pCRT7/CT-TOPO、 pCRT7/NT-E3、 pCRT7/NT-TOPO、 pDW232、 pFastBacl、 pMEP4、 pMT/LacZ、 pMT/V5-His-TOPO、 pPIC3、 pPIC3K、 pRBK、 pSL301、 pSPORT1-CAT、 pYesTrp2-RalGDS 和 pYesTrp2-RalGDS 和 Stratagene PCR-Script、 pBC Phagemid、 pMC1neo 和 pMC1neo Poly A、 pBlueScript II Phagemid 和 SuperCos I 载体。 还参考美国 专 利 号 6,987,006、6,972,322、6,916,611、6,887,702、6,803,230、6,790,607、6,706,524、 6 , 696 , 278 、 6 , 667 , 150 、 6 , 569 , 678 、 6 , 562 , 584 、 6 , 544 , 782 、 6 , 521 , 449 、 6 , 503 , 748 、 6 , 486 , 134 、 6 , 410 , 317 、 6 , 410 , 314 、 6 , 387 , 654 、 6 , 376 , 192 、 6 , 291 , 238 、 6 , 255 , 071 、 6 , 221 , 630 、 6 , 140 , 087 、 6 , 127 , 171 、 6 , 025 , 193 、 6 , 025 , 192 、 6 , 010 , 875 、 5 , 981 , 279 、 5 , 981 , 182 、 5 , 955 , 363 、 5 , 925 , 544 、 5 , 919 , 676 、 5 , 912 , 153 、 5 , 894 , 060 、 5 , 877 , 400 、 5 , 866 , 404 、 5 , 851 , 808 、 5 , 834 , 191 、 5 , 830 , 727 、 5 , 830 , 690 、 5 , 786 , 162 、 5 , 776 , 773 、 5 , 773 , 697 、 5 , 766 , 940 、 5 , 733 , 753 、 5 , 731 , 193 、 5 , 716 , 803 、 5 , 705 , 361 、 5 , 691 , 155 、 5 , 602 , 300 、 5 , 527 , 691 、 5 , 504 , 005 、 5 , 470 , 729 、 5 , 436 , 138 、 5 , 434 , 065 、 5 , 432 , 082 、 5 , 378 , 618 、 5 , 290 , 691 、 5 , 264 , 354 、 5 , 256 , 568 、 5 , 256 , 546 、 5 , 160 , 489 、 5 , 151 , 364 、5 , 147 , 789 、 5 , 143 , 836 、 5 , 126 , 252 、 5 , 093 , 251 、 5 , 081 , 022 、 4 , 997 , 767 、 4 , 988 , 622 、 4 , 935 , 364 、 4 , 920 , 054 、 4 , 889 , 806 、 4 , 879 , 230 、 4 , 876 , 202 、 4 , 845 , 031 、 4 , 808 , 519 、 4,766,072、4,752,574、4,703,012、4,634,678、487,835、4,349,629 和 4,340,674。
在另一个实施方案中，质粒可以是具有氯霉素抗性基因的任何质粒，包括但 不 限 于， Clontech 载 体 pDNR-LacZ Donor Reporter、 pDNR-SEAP Donor Reporter、 pLP-AcGFP1-C Acceptor、 pLP-BacPAK9Acceptor、 pLP-BacPAK9-6xHN Acceptor、 pLP - CMV - HA Acceptor 、 pLP - CMV - Myc Acceptor 、 pLP - CMVneo Acceptor 、 pLP - GADT 7 ADAcceptor 、 pLP - GBKT 7 DNA - Acceptor 、 pLP - IRESneo Acceptor 、 pLP - LNCX Acceptor 、 pLP - PROTet -6 xHN Acceptor 、 pLP - RevTREAcceptor 、 pLPS-AcGFP1-N Acceptor 和 pLP-TRE2 Acceptor ；Invitrogen 载体 pLysS 和 pSPORT1-CAT 和 Stratagene pBC Phagemid 和 PCR-Script 载 体。 还 参 考 美 国 专 利 号 6,916,611、 6 , 900 , 010 、 6 , 887 , 702 、 6 , 884 , 576 、 6 , 846 , 671 、 6 , 803 , 230 、 6 , 696 , 278 、 6 , 673 , 537 、 6 , 667 , 150 、 6 , 562 , 584 、 6 , 548 , 246 、 6 , 503 , 748 、 6 , 436 , 694 、 6 , 420 , 110 、 6 , 410 , 317 、 6 , 410 , 314 、 6 , 391 , 640 、 6 , 387 , 654 、 6 , 376 , 192 、 6 , 331 , 527 、 6 , 309 , 883 、 6 , 309 , 830 、 6 , 291 , 211 、 6 , 255 , 071 、 6 , 252 , 140 、 6 , 221 , 630 、 6 , 146 , 871 、 6 , 127 , 171 、 6 , 107 , 093 、 6 , 083 , 750 、 6 , 031 , 151 、 6 , 025 , 192 、 6 , 001 , 564 、 5 , 994 , 132 、 5 , 994 , 066 、 5 , 981 , 182 、 5 , 955 , 363 、 5 , 932 , 479 、 5 , 928 , 891 、 5 , 925 , 544 、 5 , 925 , 523 、 5 , 908 , 747 、 5 , 866 , 404 、 5 , 851 , 808 、 5 , 821 , 093 、 5 , 766 , 940 、 5 , 733 , 753 、 5 , 728 , 571 、 5 , 716 , 803 、 5 , 707 , 830 、 5 , 639 , 644 、 5 , 591 , 577 、 5 , 470 , 729 、 5 , 437 , 988 、 5 , 434 , 065 、 5 , 256 , 568 、 5 , 256 , 546 、 5,053,335、5,004,863、4,868,111、4,839,284、4,752,574 和 4,711,849。
在另一个实施方案中，质粒可以是具有新霉素抗性基因的任何质粒，包括 但 不 限 于， Clontech 载 体 pRevTet-Off Vector、 pRevTet-Off-IN Vector、 pIRES 载 体、 pIRESbleo3 Vector、 pIREShyg3Vector、 pIRESneo3 Vector、 pIRESpuro3 Vector、 pLP-IRESneoAcceptor Vector、 pTet-Off Vector、 pTet-On Vector、 pIRES2-DsRed-Express Vector、 pLXIN Retroviral Vector、 pIRES2-DsRed2 Vector、 Proteasome Sensor Vector、 pLXSNRetroviral Vector 、 pCMV - DsRed - Express Vector 、 Living ColorspAcGFP 1- C 1 Vector 、 pAmCyan 1- C 1 Vector 、 pAsRed 2- C 1 Vector 、 pDsRed 2- C 1 Vector 、 pDsRed - Express - C 1 Vector 、 pDsRed - Monomer - C 1 Vector 、 pHcRed 1- C 1 Vector 、 pZsGreen 1- C 1 Vector 、 pZsYellow 1- C 1 Vector 、 Living Colors pAcGFP 1 Vector 、 pDsRed2-1 Vector、 pDsRed -Express -1 Vector 、 pHcRed 1-1 Vector 、 pTimer Vector 、 pZsGreen1-1 Vector、 pQCXIX Retroviral Vector、 LRCX RetroviralVector Set、 pLNCX2 Retroviral Vector、 pLP-LNCX Acceptor Vector、 pQCXIN Retroviral Vector、 Living Colors pAcGFP1-N1 Vector、 pAmCyan1-N1 Vector、 pAsRed2-N1 Vector、 pDsRed2-N1 Vector、 pDsRed - Express - N1 Vector、 pDsRed - Monomer -N 1 Vector 、 pHcRed 1- N 1/1 Vector 、 pLPS-AcGFP1-N Acceptor Vector、 pZsGreen1-N1 Vector、 pZsYellow1-N1 Vector 和 VP16 Minimal DomainVector Set ；Invitrogen 载 体 pcDNA1/Neo、 pcDNA3/CAT( 替 换 为 pcDNA3.1/CAT)、 pCR3( 替 换 为 pCR3.1)、 pCR3.1-Uni 和 pRc/CMV 和 Stratagene pCMV-3Tag Vectors、 pCMV-Script Vector、 SuperCos IVector、 ZAP Express Vector、 pCMV-Tag Vectors、pMClneo 和 pMClneoPoly A Vectors、PCR-Script Cloning Kits、VitalityhrGFPMammalian Expression Vectors、 pBK-CMV Phagemid Vector 和 LambdaZAP-CMV Vector。 还 参 考 美 国 专 利 号 7,026,525、6,942,995、6,905,818、6,815,185、6,806,399、 6 , 787 , 687 、 6 , 747 , 189 、 6 , 673 , 602 、 6 , 673 , 537 、 6 , 667 , 150 、 6 , 624 , 344 、 6 , 620 , 990 、 6 , 440 , 444 、 6 , 429 , 357 、 6 , 391 , 633 、 6 , 376 , 192 、 6 , 316 , 253 、 6 , 294 , 187 、 6 , 291 , 211 、 6 , 255 , 560 、 6 , 252 , 140 、 6 , 248 , 937 、 6 , 232 , 526 、 6 , 221 , 630 、 6 , 210 , 930 、 6 , 207 , 879 、 6 , 194 , 636 、 6 , 114 , 146 、 6 , 096 , 717 、 6 , 0 71 , 512 、 5 , 998 , 144 、 5 , 985 , 560 、 5 , 969 , 211 、 5 , 955 , 363 、 5 , 955 , 319 、 5 , 939 , 288 、 5 , 902 , 577 、 5 , 894 , 060 、 5 , 891 , 634 、 5 , 830 , 698 、 5 , 807 , 742 、 5 , 750 , 871 、 5 , 733 , 779 、 5 , 665 , 565 、 5 , 639 , 663 、 5 , 614 , 381 、 5 , 583 , 278 、 5 , 470 , 726 、 5 , 463 , 174 、 5 , 416 , 011 、 5 , 352 , 605 、 5 , 278 , 056 、 5 , 256 , 568 、 5 , 149 , 636 、 5 , 017 , 478 、 4 , 957 , 865 、 4 , 935 , 340 、 4 , 839 , 284 、 4 , 792 , 520 、 4 , 766 , 066 、 4 , 752 , 574 、 4 , 740 , 463 、 4 , 663 , 285 、 4 , 536 , 475 、 4 , 513 , 086 、 4 , 513 , 085 、 4 , 503 , 155 、 4 , 468 , 462 、 4,460,688、4,430,434 和 4,416,994。
在另一个实施方案中，质粒可以是具有四环素抗性基因的任何质粒，包括但不 限 于， Clontech 载 体 pRevTet-Off Vector、 pRevTet-OnVector、 pRevTet-Off-IN Vector、 Creator-Compatible PROTet 6xHNBacterial Expression System、 PROTet 6xHN Bacterial ExpressionSystem、 pTRE-Tight Vector、 pTet-Off Vector、 pTet-On Vector、 Tet-Off Gene Expression System、 Tet-On Gene Expression System、 Adeno-X Tet-Off Expression System 1、Adeno-X Tet-On ExpressionSystem 1、Adeno-X Viral DNA(PI-Sce I/I-Ceu I 消化的 )、 Creator-Compatible RevTet-Off Retroviral Gene ExpressionSystem、 Creator-Compatible RevTet-On Retroviral GeneExpression System、 pLP-RevTRE Acceptor Vector、 pRevTRE Vector、 RevTet-Off System、 RevTet-On System、 pBI Tet Vector、 pBI-G TetVector、 pBI-L Tet Vector、 pTet-tTS Vector、 pLP-TRE2 AcceptorVector、 pTRE2 Vector、 pTRE2hyg Vector、 pTRE2pur Vector、 TetSystem Approved FBS、 US-Sourced(γ 照 射 的 )、 pTRE-Tight-DsRed2Vector 和 VP16Minimal Domain Vector Set 和 Invitrogen 载体 pTet-tTak 和 pTet-Splice。 还 参 考 美 国 专 利 号 6,924,101、6,905,836、6,777,229、6,759,236、 6 , 699 , 702 、 6 , 699 , 692 、 6 , 696 , 278 、 6 , 680 , 301 、 6 , 673 , 537 、 6 , 667 , 150 、 6 , 642 , 052 、 6 , 620 , 618 、 6 , 613 , 528 、 6 , 544 , 782 、 6 , 541 , 003 、 6 , 503 , 748 、 6 , 482 , 636 、 6 , 440 , 741 、 6 , 436 , 694 、 6 , 410 , 317 、 6 , 392 , 121 、 6 , 376 , 192 、 6 , 309 , 883 、 6 , 303 , 383 、 6 , 265 , 562 、 6 , 261 , 807 、 6 , 221 , 630 、 6 , 218 , 181 、 6 , 13 6 , 536 、 6 , 127 , 171 、 6 , 080 , 575 、 6 , 033 , 856 、 6 , 022 , 731 、 6 , 010 , 875 、 5 , 958 , 680 、 5 , 955 , 363 、 5 , 891 , 718 、 5 , 869 , 035 、 5 , 866 , 410 、 5 , 858 , 762 、 5 , 851 , 796 、 5 , 849 , 576 、 5 , 840 , 521 、 5 , 830 , 727 、 5 , 830 , 690 、 5 , 786 , 162 、 5 , 766 , 940 、 5 , 637 , 503 、 5 , 593 , 860 、 5 , 585 , 254 、 5 , 527 , 691 、 5 , 516 , 669 、 5 , 508 , 176 、 5 , 384 , 259 、 5 , 378 , 618 、 5 , 348 , 886 、 5 , 290 , 691 、 5 , 256 , 568 、 5 , 256 , 546 、 5 , 166 , 070 、 5 , 158 , 891 、 5 , 151 , 364 、 5 , 147 , 789 、 5 , 053 , 335 、 4 , 983 , 522 、 4 , 879 , 230 、 4 , 876 , 202 、 4 , 874 , 703 、 4 , 77 8 , 761 、 4 , 752 , 574 、 4 , 703 , 012 、 4 , 680 , 260 、 4 , 663 , 285 、 4 , 634 , 677 、 4,631,259、4,581,335、4,374,200 和 4,349,629。
术语质粒包含任何 DNA 转录单位，其包含根据本发明的多核苷酸及其在所需 宿主或靶的一个或多个细胞中体内表达所需的元件 ；并且在这点上，应当指出超螺旋或 非超螺旋的、环状质粒以及线性形式预期在本发明的范围内。 每个质粒包括下述或包含下述或基本上由下述组成 ：除编码抗原、表位或免疫原的多核苷酸外，任选地与异 源肽序列、变体、类似物或片段融合，与启动子可操作地连接或处于启动子的控制下或 依赖于启动子。 一般而言，采用在真核细胞中起作用的强启动子是有利的。 优选的强 启动子是人或鼠来源的，任选其他来源的例如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子 (CMV-IE)。 CMV-IE 启动子可以包含实际启动子部分，这可以与增强子部分结合或不 结合。 可以参考 EP-A-260 148、 EP-A-323 597，美国专利号 5,168,062、5,385,839 和 4,968,615，以及 PCT 申请号 WO87/03905。 CMV-IE 启动子有利地是人 CMV-IE(Boshart M. 等人， Cell.，1985，41，521-530) 或鼠 CMV-IE。
在更一般的术语中，启动子为病毒或细胞来源的。 除可以有利地用于本发明的 实践中的 CMV-IE 外的强病毒启动子是 SV40 病毒的早 / 晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的 LTR 启动子。 可以有利地用于本发明的实践中的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动 子，例如结蛋白启动子 (Kwissa M. 等人， Vaccine，2000，18，2337-2344)、或肌动蛋白 启动子 (Miyazaki J. 等人， Gene，1989，79，269-277)。
这些启动子的功能亚片段，即维持足够启动活性的这些启动子的部分，包括在 本发明内，例如根据 PCT 申请号 WO98/00166 或美国专利号 6,156,567 的截短的 CMV-IE 启动子可以用于本发明的实践中。 在本发明的实践中的启动子因此包括全长启动子的衍 生物和亚片段，其维持足够启动活性且因此充当启动子，优选与衍生有衍生物或亚片段 的实际或全长启动子的启动活性基本上类似的启动活性，例如美国专利号 6,156,567 的截 短的 CMV-IE 启动子的活性类似于 CMV-IE 全长启动子的活性。 因此，在本发明的实践 中的 CMV-IE 启动子可以包含下述或基本上由下述组成或由下述组成 ：全长启动子的启 动子部分和 / 或全长启动子的增强子部分，以及衍生物和亚片段。
优选地，质粒包含其他表达控制元件或基本上由其他表达控制元件组成。 掺入 稳定序列是特别有利的，例如内含子序列，优选地 hCMV-IE 的第一个内含子 (PCT 申请 号 WO89/01036)，兔 β- 珠蛋白基因的内含子 II(van Ooyen 等人，Science，1979，206， 337-344)。
关于除痘病毒外的质粒和病毒载体的多腺苷酸化信号 ( 多聚 A)，还可以使用牛 生长激素 (bGH) 基因的多聚 (A) 信号 ( 参见美国专利号 5,122,458)、或兔 β- 珠蛋白基 因的多聚 (A) 信号或 SV40 病毒的多聚 (A) 信号。
本发明提供了任何靶肽或多肽，有利地目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽通 过本发明的 DNA 质粒的表达。 本发明考虑了任何目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽在 本文公开的 DNA 质粒中的表达。 DNA 质粒可以表达一种或多种目的抗原、表位或免疫 原。
在一个有利的实施方案中，抗原、表位、免疫原、肽或多肽衍生自禽类、牛、 犬、马、猫或猪病毒或病原体。 在另一个实施方案中，抗原、表位、免疫原、肽或多肽 可以衍生自西尼罗河病毒。 在另一个实施方案中，抗原、表位、免疫原、肽或多肽可以 衍生自人病毒或病原体。
根据本发明的禽类抗原、表位或免疫原可以衍生自马雷克病病毒 (MDV)( 例 如血清型 1 和 2，优选 1)、新城疫病毒 (NDV)、禽肾病病毒或传染性法氏囊病病毒 (IBDV)、传染性支气管炎病毒 (IBV)、传染性贫血病毒或鸡贫血病毒 (CAV)、传染性喉气管炎病毒 (ILTV)、脑脊髓炎病毒或禽脑脊髓炎病毒 (AEV 或禽造白细胞组织增 生病毒 ALV)、火鸡出血性肠炎病毒 (HEV)、 pneumovirosis 病毒 (TRTV)、鸡瘟病毒 ( 禽流感 )、鸡积水性心包炎病毒、禽呼肠孤病毒、大肠埃希杆菌 (Escherichiacoli)、 鸡 支 原 体 (Mycoplasma gallinarum)、 鸡 败 血 支 原 体 (Mycoplasma gallisepticum)、 嗜 血 杆 菌 (Haemophilus avium)、 鸡 巴 氏 杆 菌 (Pasteurella gallinarum)、 禽 多 杀 性 巴 氏 杆 菌 (Pasteurella multocida gallicida) 及其混合物。 优选地，对于 MDV，免疫原有利地是 gB 和 / 或 gD，例如 gB 和 gD，对于 NDV，免疫原有利地是 HN 和 / 或 F，例如 HN 和 F ；对于 IBDV，免疫原有利地是 VP2 ；对于 IBV，免疫原有利地是 S( 更有利地 S1) 和 / 或 M 和 / 或 N，例如 S( 或 S1) 和 M 和 / 或 N ；对于 CAV，免疫原有利地是 VP1 和 / 或 VP2 ； 对于 ILTV，免疫原有利地是 gB 和 / 或 gD ；对于 AEV，免疫原有利地是 env 和 / 或 gag/ pro，例如 env 和 gag/pro 或 gag/pro ；对于 HEV，免疫原有利地是 100K 蛋白质和 / 或六 联体 ；对于 TRTV，免疫原有利地是 F 和 / 或 G，并且对于鸡瘟，免疫原有利地是 HA 和 / 或 N 和 / 或 NP，例如 HA 和 / 或 N 和 / 或 NP。
根据本发明的牛抗原、表位或免疫原可以衍生自 BHV-1、 BRV、 bPI-3 和 / 或 BCV 病毒或选自包括但不限于下述的牛病原体 ：牛呼吸道合胞病毒和牛病毒性腹泻病 毒。 BRSV 免疫原可以是 BRSV F 或 G 或 N，例如 BRSV F 和 / 或 G 或 N 和 / 或 G。 BHV-1 免疫原可以是 gB 和 / 或 gC 和 / 或 gD。 BVDV 免疫原可以是 E0 蛋白质 (gp48) 和 / 或 E2 蛋白质 (gp53)。 BVDV 可以是 1 型和 / 或 2 型。 bPI-3 免疫原可以是 bPI-3F 和 / 或 HN。 关于牛病原体的免疫原以及编码其的核酸分子和表达其的构建体，还参见美 国专利号 6,451,770、6,376,473、6,224,878。
根据本发明的犬抗原、表位或免疫原可以衍生自麻疹病病毒、犬瘟热病毒 (CDV)、犬副流感 2 型病毒 (CPI-2)、犬疱疹病毒 1 型 (CHV-1)、狂犬病病毒 ( 弹状 病毒 )、犬细小病毒 (CPV)、犬冠状病毒 (CCV)、犬腺病毒、伯氏疏螺旋体 (Borrelia burgdorferi)、钩端螺旋体属 (Leptospira) 及其混合物。优选地，对于 CDV，免疫原有利地 是 F 和 / 或 HA( 关于 CDV 免疫原和构建体，还参见美国专利号 6,309,647、5,756,102) ； 对 于 CPV， 免 疫 原 有 利 地 是 VP2 ；对 于 CCV， 免 疫 原 有 利 地 是 S 和 / 或 M ；对 于 CHV-1，免疫原有利地是 gB 和 / 或 gC 和 / 或 gD( 关于 CHV 免疫原和构建体，还参见美 国专利号 5,688,920、5,529,780) ；对于狂犬病病毒，免疫原有利地是 G( 关于狂犬病联合 组合物，还参见美国专利号 5,843,456) ；对于伯氏疏螺旋体，免疫原有利地是 OspA( 关 于 OspA 联合组合物，还参见美国专利号 6,368,603)
根据本发明的马抗原、表位或免疫原可以衍生自 EHV-1 和 / 或 EHV-4 病毒 或选自包括但不限于下述的另一种马病原体 ：马流感病毒 (EIV)、东方脑脊髓炎病毒 (EEV)、西方脑脊髓炎病毒 (WEV)、委内瑞拉脑脊髓炎病毒 (VEV)、莱姆病因子、伯氏 疏螺旋体、破伤风梭菌 (Clostridium tetani)、马动脉炎病毒 (EAV) 和狂犬病病毒。 抗原、 表位或免疫原可以是 EHV 糖蛋白例如 gB、gD、gB+gD、gC 和 gE，对于 EIV，免疫原有 利地是 HA、 NP 和 / 或 N ；对于脑炎病毒，免疫原有利地是 C 和 / 或 E1 和 / 或 E2 ；并 且对于破伤风梭菌，免疫原是破伤风毒素的亚单位 C 的全部或部分。 关于马病原体的免 疫原以及编码其的核酸分子和表达其的构建体，参考美国专利号 6,395,283、6,248,333、 5,338,683、6,183,750。根据本发明的猫抗原、表位或免疫原可以衍生自猫疱疹病毒 1(FHV-1)、猫杯 状病毒 (FCV)、狂犬病病毒 ( 弹状病毒 )、猫细小病毒 (FPV)、猫传染性腹膜炎病毒 (FIPV)、猫白血病病毒 (FeLV)、猫免疫缺陷病毒 (FIV)、衣原体属 (Chlamydia) 及其混 合物。 优选地，对于 FeLV，免疫原有利地是 env 和 / 或 gag 和 / 或 pol，例如 gag/pol ； 对于 FPV，免疫原有利地是 VP2 ；对于 FIPV，免疫原有利地是 S 和 / 或 M 和 / 或 N，例 如 S 和 M 和 / 或 N( 还参见美国专利号 6,348,196 和 5,858,373 以及免疫原及其构建体 ) ； 对于 FHV，免疫原有利地是 gB 和 / 或 gC 和 / 或 gD，例如 gB 和 gC 和 / 或 gD( 关于疱疹 病毒免疫原和表达其的构建体 ；还参见美国专利号 5,338,683、6,183,750) ；对于 FCV， 免疫原有利地是 C ；对于 FIV，免疫原有利地是 env 和 / 或 gag 和 / 或 pro，例如 gag/pro、 env 或 env 和 gag/pro( 还参见 Tartaglia 等人在 1996 年 11 月 14 日提交的美国申请序列号 08/746,668 中讨论的免疫原和构建体 ) ；对于狂犬病病毒，免疫原有利地是 G。
根据本发明的猪抗原、表位或免疫原可以衍生自 PRRS 病毒和 / 或选自包括但 不限于下述的猪病原体 ：假性狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎 病毒 ( 冠状病毒 )、猪环状病毒例如猪环状病毒 2 型、轮状病毒、猪腺病毒 3 型、大肠 埃希杆菌、红斑丹毒丝菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管炎博得特菌 (Bordetella bronchiseptica)、梭菌属属种 (Clostridium spp.)、沙门氏菌属属种 (Salmonella spp.)、副 猪嗜血杆菌 (Haemophilusparasuis)、多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella multocida)、猪链球菌 (Streptococcus suis)、猪肺炎支原体 (Mycoplasmahyopneumoniae) 和胸膜炎肺炎放线杆 菌 (Actinobacilluspleuropneumoniae)。 猪病原体的抗原、表位或免疫原可以包括假性狂 犬病病毒 gB、假性狂犬病病毒 gC、假性狂犬病病毒 gD、猪流感 HA、猪流感 NA、猪流 感 NP、猪繁殖和呼吸综合征病毒的 ORF4、猪繁殖和呼吸综合征病毒的 ORF7、 PRRSV 的 ORF5、 PRRSV ORF3、 PRRSV ORF6、 PRRSV 开放读码框 5(ORF5) 和 6(ORF6)、 PRRSV 开 放 读 码 框 5(ORF5) 和 3(ORF3) 和 6(ORF6)、 猪 霍 乱 病 毒 E1、 猪 霍 乱 病 毒 E2 基因、细小病毒属 VP2、猪环状病毒 2 型 ORF1、猪环状病毒 2 型 ORF2。 关于猪 病原体的免疫原、编码其的核酸分子和表达其的构建体，参考美国专利号 6,517,843、 6,497,883、6,391,314、6,379,676、6,217,883、6,207,165 和美国专利公开 2003003112 以及 WO99/53047、 WO99/08706、 WO01/83737 和 WO00/47756。
本发明的 DNA 质粒可以表达编码 E、 prM、 M 或其组合或多蛋白 ( 例如， E、 或 E 和 prM、或 E 和 M、或 E 和 prM 和 M、或多蛋白 E-prM-M、或多蛋白 prM-E、或 多蛋白 M-E，或其至少一个表位 ) 的一种或多种西尼罗河病毒 ( “WNV” ) 多核苷酸。 根据本发明的一个实施方案，在制剂中的其他一种或多种载体包含这样的多核苷酸、基 本上由这样的多核苷酸组成或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码 WN 病毒的一 种或多种其他蛋白质，例如 prM、 M、 prM-M 或其表位，并且在合适的环境下，该载体 表达 WN 病毒的一种或多种其他蛋白质，例如 prM、 M、 prM-M 或其表位。
如本文所使用的，术语 “抗原” 或 “免疫原” 意指在宿主动物中诱导特异性 免疫应答的物质。 抗原可以包含被杀死、减毒或活的整个生物体 ；生物体的亚单位或部 分 ；包含具有免疫原性性质的插入片段的重组载体 ；在呈递给宿主动物后能够诱导免疫 应答的 DNA 碎片或片段 ；蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或其任何组合。 备选地，免 疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。如本文所使用的，术语 “免疫原性蛋白质或肽” 还指包括在这样的意义上是免 疫活性的肽和多肽，施用于宿主后，它能够引起针对蛋白质的体液和 / 细胞类型的免疫 应答。 优选地，蛋白质片段是这样的，使得它具有与总蛋白基本上相同的免疫活性。 因 此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇，或基本上由至少一个表 位或抗原决定簇组成，或由至少一个表位或抗原决定簇组成。 术语表位涉及能够诱导体 液类型 (B 细胞 ) 和 / 或细胞类型 (T 细胞 ) 的免疫应答的蛋白质位点。
术语 “免疫原性蛋白质或肽” 进一步考虑了对序列的缺失、添加和置换，只要 多肽作用于产生如本文所定义的免疫应答。 在这点上，特别优选的置换一般在性质上是 保守的，即在氨基酸家族内发生的那些置换。 例如，氨基酸一般分成 4 个家族 ：(1) 酸 性 - 天冬氨酸和谷氨酸 ；(2) 碱性 - 赖氨酸、精氨酸、组氨酸 ；(3) 非极性 - 丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸 ；和 (4) 不带电的 极性 - 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。 苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。 可合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸分别替换 亮氨酸，或反之亦然 ；用谷氨酸替换天冬氨酸，或反之亦然 ；用丝氨酸替换苏氨酸，或 反之亦然 ；或氨基酸用结构上相关的氨基酸的相似保守替换，对生物活性将没有主要影 响。 因此，具有与参照分子基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质的免疫 原性的氨基酸置换的蛋白质在参照多肽的定义内。
术语 “表位”指特异性 B 细胞和 / 或 T 细胞对其响应的抗原或半抗原上的位点。 该术语还可与 “抗原决定簇” 或 “抗原决定位点” 互换使用。 识别相同表位的抗体可 以在简单的免疫测定法中进行鉴定，所述免疫测定法显示一种抗体阻断另一种抗体与靶 抗原的结合的能力。
对组合物或疫苗的 “免疫应答” 是宿主中对目的组合物或疫苗的细胞和 / 或抗 体介导的免疫应答的发展。 通常， “免疫应答” 包括但不限于一种或多种下述效应 ：特 异性针对目的组合物或疫苗中包括的一种或多种抗原的抗体、B 细胞、辅助 T 细胞和 / 或 细胞毒性 T 细胞的产生。 优选地，宿主将显示治疗或保护性免疫应答，从而使得对新感 染的抗性将增强和 / 或疾病的临床严重性减少。 此种保护将通过通常由受感染宿主显示 的症状的减少或缺乏、在受感染宿主中更快速的恢复时间和 / 或降低的病毒滴度加以证 实。
如本文所使用的，术语 “免疫原性” 蛋白质或多肽还指引发如上所述的免疫 应答的氨基酸序列。 如本文所使用的， “免疫原性” 蛋白质或多肽包括蛋白质的全长 序列、其类似物、或其免疫原性片段。 “免疫应答片段” 意指这样的蛋白质片段，其 包括一个或多个表位并且从而引发上文描述的免疫应答。 此种片段可以使用本领域众 所周知的任何表位定位技术进行鉴定。 参见例如， Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology， 第 66 卷 (Glenn E.Morris， 编 辑，1996)Humana Press， Totowa， NJ。 例如，线性表位可以这样测定，例如在固体载体上同时合成大量肽，该肽对应于 蛋白质分子的部分，并且在肽仍与载体附着时使肽与抗体反应。 此种技术是本领域已知 的，并且在例如美国专利号 4,708,871 ；Geysen 等人 (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 3998-4002 ；Geysen 等人 (1986)Molec.Immunol.23 ：709-715 中描述，所述参考文献全部 整体引入本文作为参考。 相似地，构象表位通过测定氨基酸的空间构象容易地鉴定，例如通过 x 射线晶体学和二维核磁共振。 参见例如，Epitope Mapping Protocols，同上。 可 特别应用于小泰勒虫 (T.parva) 的蛋白质的方法在整体引入本文作为参考的 PCT 申请序列 号 PCT/US2004/022605 中充分描述。
合成抗原也包括在定义内，例如多表位、侧翼表位和其他重组抗原。 参见 例 如， Bergmann 等 人 (1993)Eur.J.Immunol.23 ：2777-2781 ；Bergmann 等 人 (1996) J.Immunol.157 ：3242-3249 ；Suhrbier， A.(1997)Immunol， 和 Cell Biol.75 ：402-408 ； Gardner 等 人 (1998)12th World AIDS Conference， Geneva， Switzerland， Jun.28-Jul.3， 1998。 为了本发明的目的，免疫原性片段通常将包括分子的至少约 3 个氨基酸，优选至 少约 5 个氨基酸，更优选至少约 10-15 个氨基酸，并且最优选 25 个或更多氨基酸。 不存 在对片段长度的临界上限，这可以包含接近蛋白质序列的全长，或甚至包含蛋白质的至 少一个表位的融合蛋白。
因此，表达表位的多核苷酸的最低限度结构是它包含核苷酸或基本上由核苷酸 组成或由核苷酸组成，以编码目的蛋白质或多蛋白的表位或抗原决定簇。 更有利地， 编码总蛋白或多蛋白的片段的多核苷酸包含编码总蛋白或多蛋白的序列的最少 21 个核 苷酸，有利地至少 42 个核苷酸，且优选至少 57、87 或 150 个连续或邻接核苷酸，或基 本上由编码总蛋白或多蛋白的序列的最少 21 个核苷酸，有利地至少 42 个核苷酸，且优 选至少 57、87 或 150 个连续或邻接核苷酸组成，或由编码总蛋白或多蛋白的序列的最 少 21 个核苷酸，有利地至少 42 个核苷酸，且优选至少 57、87 或 150 个连续或邻接核苷 酸组成。 表位测定操作例如，产生重叠肽文库 (Hemmer B. 等人， Immunology Today， 1998，19(4)，163-168)、 Pepscan(Geysen 等 人， (1984)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81， 3998-4002 ；Geysen 等 人， (1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82，178-182 ；Van der Zee R. 等人，(1989)Eur.J.Immunol.，19，43-47 ；Geysen H.M.，(1990)Southeast Asian J.Trop. Med.Public Health，21，523-533 ；Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kitsde Chiron) 和 算 法 (De Groot A. 等人，(1999)Nature Biotechnology，17，533-561)，以及在 PCT 申请序列号 PCT/US2004/022605 中，无需过度实验即可在本发明的实践中使用，所述参考文献全部 整体引入本文作为参考。 关于用于测定免疫原或抗原的表位以及因此编码此种表位的核 酸分子的方法，还可以参考本文引用和引入的其他文件。
“多核苷酸” 是任何长度的聚合形式的核苷酸，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖 核苷酸和以任何组合的类似物。 多核苷酸可以具有三维结构，并且可以执行已知或未 知的任何功能。 术语 “多核苷酸” 包括双链、单链和三螺旋分子。 除非另有说明或要 求，本文描述的其为多核苷酸的本发明的任何实施方案包含双链形式和已知或预测构成 DNA、 RNA 或杂交分子的双链形式的 2 个互补形式中的每一个。
下 述 是 多 核 苷 酸 的 非 限 制 性 例 子 ：基 因 或 基 因 片 段、 外 显 子、 内 含 子、 mRNA、 tRNA、 rRNA、核酶、 cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任 何序列的分离 DNA、任何序列的分离 RNA、核酸探针和引物。 多核苷酸可以包含经修饰 的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团例如氟核糖 和硫醇盐、以及核苷酸分支。 核苷酸的序列可以在聚合 ( 例如通过缀合 ) 后用标记组分 进一步修饰。 在这个定义内包括的其他类型的修饰是加帽、用类似物替换一个或多个天 然存在的核苷酸、和引入用于使多核苷酸与蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体载体附着的手段。 多核苷酸可以通过化学合成获得或源自微生物。
本发明进一步包含编码目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的多核苷酸的互补 链。 互补链可以是聚合的且具有任何长度，并且可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸 和以任何组合的类似物。
术语 “蛋白质”、 “肽”、 “多肽” 和 “多肽片段” 在本文中可互换使用， 以指任何长度的氨基酸残基聚合物。 聚合物可以是线性或分支的，它可以包含经修饰的 氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以由非氨基酸的化学部分间断。 该术语还包含已天然 或通过本发明修饰的氨基酸聚合物 ；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸 化、或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。
“分离的” 多核苷酸或多肽是基本上不含它在其天然环境中与之结合的材料的 那种。 基本上不含意指至少 50％、有利地至少 70％、更有利地至少 80％、且更加有利地 至少 90％不含这些材料。
杂交反应可以在不同 “严格性” 条件下进行。 增加杂交反应严格性的条件是众 所周知的。 参见例如，″ Molecular Cloning ：ALaboratory Manual″，第 2 版 (Sambrook 等人 1989)。 相关条件的例子包括 ( 按增加严格性的顺序 ) ：25℃、37℃、50℃和 68℃ 的温育温度 ；10xSSC、6xSSC、1xSSC、0.1xSSC( 其中 SSC 是 0.15M NaCl 和 15mM 柠檬 酸盐缓冲液 ) 的缓冲液浓度，及其使用其他缓冲系统的等价物 ；0％、25％、50％和 75％ 的甲酰胺浓度 ；5 分钟 -24 小时的温育时间 ；1、2 个或更多洗涤步骤 ；1、2 或 15 分钟的 温育时间 ；和 6xSSC、1xSSC、0.1xSSC 的洗涤溶液或去离子水。 本发明进一步包含编码目的多肽的功能等价变体和衍生物的多核苷酸及其功能 等价片段，其可以增强、减少或不显著影响由其编码的多肽的性质。 这些功能等价变 体、衍生物和片段显示保留生物活性的能力。 例如，不改变编码氨基酸序列的 DNA 序列 中的变化，以及导致氨基酸残基的保守置换的那些，一个或数个氨基酸缺失或添加、和 通过氨基酸类似物置换氨基酸残基是将不显著影响编码的多肽性质的那些。 保守氨基酸 置换是甘氨酸 / 丙氨酸 ；缬氨酸 / 异亮氨酸 / 亮氨酸 ；天冬酰胺 / 谷氨酰胺 ；天冬氨酸 / 谷氨酸 ；丝氨酸 / 苏氨酸 / 甲硫氨酸 ；赖氨酸 / 精氨酸 ；和苯丙氨酸 / 酪氨酸 / 色氨酸。 在一个实施方案中，变体与目的多核苷酸或多肽具有至少 50％、至少 55％、至少 60％、 至少 65 ％、至少 70 ％、至少 75 ％、至少 80 ％、至少 85 ％、至少 86 ％、至少 87 ％、至 少 88 ％、至少 89 ％、至少 90 ％、至少 91 ％、至少 92 ％、至少 93 ％、至少 94 ％、至少 95％、至少 96％、至少 97％、至少 98％或至少 99％的同源性或同一性。
为了本发明的目的，序列同一性或同源性通过比较序列进行测定，所述序列这 样比对，以便使重叠和同一性达到最大同时使序列空位降到最低。 特别地，序列同一性 可以使用许多数学算法中的任何进行测定。 用于比较 2 个序列的数学算法的非限制性例 子是 Karlin 和 Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990 ；87 ：2264-2268 的算法，如 Karlin 和 Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 ；90 ：5873-5877 中修饰的。
用于比较序列的数学算法的另一个例子是 Myers 和 Miller， CABIOS 1988 ；4 ： 11-17 的算法。 此种算法并入 ALIGN 程序 ( 版本 2.0) 内，这是 GCG 序列比对软件包的 部分。 当利用 ALIGN 程序用于比较氨基酸序列时，可以使用 PAM120 权残基表、12 的 空位长度罚分和 4 的空位罚分。 用于鉴定局部序列相似性区域和比对的另一个有用算法
是 FASTA 算法，如 Pearson 和 Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988 ；85 ：2444-2448 中 描述的。
对于根据本发明的用途有利的是 WU-BLAST(WashingtonUniversity BLAST) 版 本 2.0 软件。 用于数个 UNIX 平台的 WU-BLAST 版本 2.0 可执行程序可以从 ftp://blast. wustl.edu/blast/executables 下载。 这个程序基于 WU-BLAST 版本 1.4，所述 WU-BLAST 版本 1.4 依次基于公众域 NCBI-BLAST 版本 1.4(Altschul 和 Gish，1996， Local alignment statistics，Doolirtle 编辑，Methods in Enzymology 266 ：460-480 ；Altschul 等人，Journalof Molecular Biology 1990 ；215 ：403-410 ；Gish 和 States，1993 ；Nature Genetics 3 ： 266-272 ；Karlin 和 Altschul，1993 ；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ：5873-5877 ；所 述 参 考 文献全部引入本文作为参考 )。
一般而言，氨基酸序列的比较通过使已知结构多肽的氨基酸序列与未知结构多 肽的氨基酸序列比对来完成。 序列中的氨基酸随后进行比较，并且使同源的氨基酸组 集中在一起。 这种方法检测多肽的保守区，并且说明氨基酸插入和缺失。 氨基酸序 列之间的同源性可以通过使用商购可得的算法进行测定 ( 还参见上文的同源性描述 )。 除本文在其他方面提及的这些外，还提及由美国生物技术信息中心 (NationalCenter for Biotechnology Information) 提 供 的 程 序 BLAST、 空 位 BLAST 、 BLASTN、 BLASTP 和 PSI-BLAST。 这些程序在本领域中广泛用于这个目的，并且可以比对 2 个氨基酸序列的 同源区。
在套件中的所有搜索程序中，将空位比对程序整合至数据库搜索其自身。 需要 时可以关闭空位。 对于蛋白质和 BLASTP，空位长度 1 的缺省罚分 (Q) 是 Q ＝ 9，而对 于 BLASTN，Q ＝ 10，但可以变成任何整数。 对于蛋白质和 BLASTP，延伸空位的缺省 每残基罚分 (R) 是 R ＝ 2，对于 BLASTN， R ＝ 10，但可以变成任何整数。 可以使用 Q 和 R 的值的任何组合，以便这样比对序列，使得重叠和同一性达到最大同时使序列空 位降到最低。 缺省氨基酸比较矩阵是 BLOSUM62，但可以利用其他氨基酸比较矩阵例如 PAM。
备选地或另外地，术语 “同源性” 或 “同一性” 例如就核苷酸或氨基酸序 列而言，可以指 2 个序列之间的同源性的定量测量。 序列同源性百分比可以计算为 (Nref-Ndif)*100/Nref，其中 Ndif 是当比对时 2 个序列中的非相同残基总数目，并且其中 Nref 是序列之一中的残基数目。 因此，DNA 序列 AGTCAGTC 将与序列 AATCAATC 具有 75％ 的序列同一性 (Nref ＝ 8 ；Ndif ＝ 2)。
备选地或另外地，术语 “同源性” 或 “同一性” 就序列而言，可以指具有相同 核苷酸或氨基酸的位置数目除以 2 个序列中较短序列中的核苷酸或氨基酸数目，其中 2 个 序列的比对可以依照 Wilbur 和 Lipman 算法 (Wilbur 和 Lipman， Proc Natl Acad Sci USA 1983 ；80 ：726，引入本文作为参考 ) 进行测定，例如使用窗口大小 20 个核苷酸、字长 4 个核苷酸和空位罚分 4，并且计算机辅助分析和序列数据 ( 包括比对 ) 的解释可以使用商 购可得的程序 ( 例如 IntelligeneticsTMSuite， Intelligenetics Inc.CA) 方便地执行。 当 RNA 序列被说成与 DNA 序列相似或具有序列同一性或同源性程度时，DNA 序列中的胸苷 (T) 视为与 RNA 序列中的尿嘧啶 (U) 等价。 因此， RNA 序列在本发明的范围内，并且可以 衍生自 DNA 序列，通过 DNA 序列中的胸苷 (T) 视为与 RNA 序列中的尿嘧啶 (U) 等价。并且无需过度实验，技术人员可以参考许多其他程序或参考文献用于测定同源 性百分比。
本发明进一步包含了这样的目的多核苷酸，其包含在载体分子或表达载体中， 并且与启动子元件且任选地与增强子可操作地连接。
“载体” 指重组 DNA 或 RNA 质粒或病毒，其包含在体外或在体内待递送给靶 细胞的异源多核苷酸。 异源多核苷酸可以包含用于治疗用途的目的序列，并且可以任选 以表达盒的形式。 如本文所使用的，载体无需在最终靶细胞或受试者中能够复制。 该术 语包括克隆载体，还包括病毒载体。
术语 “重组体” 意指半合成或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以 自然界中未发现的排列与另一种多核苷酸连接。
“异源的” 意指衍生自它与之比较的其余实体遗传上不同的实体。 例如，多核 苷酸可以通过基因工程技术放置到衍生自不同来源的质粒或载体内，并且是异源多核苷 酸。 从其天然编码序列中取出并且与非天然序列的编码序列可操作地连接的启动子是异 源启动子。
本发明的多核苷酸可以包含附加序列，例如在相同转录单位内的附加编码序 列，控制元件 ( 例如启动子 )、核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、在相同或不同启动子 的控制下的附加转录单位，允许宿主细胞的克隆、表达、同源重组和转化的序列，以及 如可能是提供本发明的实施方案所需的任何此种构建体。
用于表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的元件有利地存在于本发明载 体中。 以最低限度形式，这包含下述、基本上由下述组成或由下述组成 ：起始密码子 (ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地用于特定载体 ( 例如质粒和特定病毒载体 ( 例 如非痘病毒的病毒载体 )) 的多腺苷酸化序列。 当多核苷酸编码载体中的多蛋白片段，例 如有利地肽时，将 ATG 放置在读码框的 5’ 处，并且终止密码子放置在 3’ 处。 可以存 在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列、稳定序列，例如内含子和允许蛋白质分 泌的信号序列。
用于制备和 / 或施用用于在体内或在体外表达本发明基因的基因产物的载体或 重组体或质粒的方法可以是任何所需方法，例如通过或类似于下述中公开的方法的方 法，或下述中引用的文件中公开的方法 ：美国专利号 4,603,112 ；4,769,330 ；4,394,448 ； 4 , 722 , 848 ；4 , 745 , 051 ；4 , 769 , 331 ；4 , 945 , 050 ；5 , 494 , 807 ；5 , 514 , 375 ；5 , 744 , 140 ； 5 , 744 , 141 ；5 , 756 , 103 ；5 , 762 , 938 ；5 , 766 , 599 ；5 , 990 , 091 ；5 , 174 , 993 ；5 , 505 , 941 ； 5 , 338 , 683 ；5 , 494 , 807 ；5 , 591 , 639 ；5 , 589 , 466 ；5 , 677 , 178 ；5 , 591 , 439 ；5 , 552 , 143 ； 5 , 580 , 859 ；6 , 130 , 066 ；6 , 004 , 777 ；6 , 130 , 066 ；6 , 497 , 883 ；6 , 464 , 984 ；6 , 451 , 770 ； 6 , 391 , 314 ；6 , 387 , 376 ；6 , 376 , 473 ；6 , 368 , 603 ；6 , 348 , 196 ；6 , 306 , 400 ；6 , 228 , 846 ； 6 , 221 , 362 ；6 , 217 , 883 ；6 , 207 , 166 ；6 , 207 , 165 ；6 , 159 , 477 ；6 , 153 , 199 ；6 , 090 , 393 ； 6 , 074 , 649 ；6 , 045 , 803 ；6 , 033 , 670 ；6 , 485 , 729 ；6 , 103 , 526 ；6 , 224 , 882 ；6 , 312 , 682 ； 6,348,450 和 6,312,683 ；1986 年 10 月 16 日 提 交 的 美 国 专 利 申 请 序 列 号 920,197 ；WO 90/01543 ；WO91/11525 ；WO 94/16716 ；WO 96/39491 ；WO 98/33510 ；EP 265785 ； EP 0 370 573 ；Andreansky 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 ；93 ：11313-11318 ； Ballay 等 人， EMBO J.1993 ；4 ：3861-65 ；Feigner 等 人， J.Biol.Chem.1994 ；269 ：2550-2561 ；Frolov 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 ；93 ：11371-11377 ；Graham， Tibtech1990 ；8 ：85-87 ；Grunhaus 等 人， Sem.Virol.1992 ；3 ：237-52 ；Ju 等 人， Diabetologia 1998 ；41 ：736-739 ；Kitson 等 人， J.Virol. 1991 ；65 ：3068-3075 ； McClement s 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 ；93 ：11414-11420 ；Moss， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1996 ；93 ：11341-11348 ；Paoletti， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 ；93 ： 11349-11353 ；Pennock 等 人， Mol.Cell.Biol.1984 ；4 ：399-406 ；Richardson( 编 辑 )， Methodsin Molecular Biology 1995 ；39， ″ Baculovirus Expression Protocols， ″ Humana Press Inc. ；Smith 等人 (1983)Mol.Cell.Biol.1983 ；3 ：2156-2165 ；Robertson 等人， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1996 ；93 ：11334-11340 ；Robinson 等 人， Sem.Immunol.1997 ；9 ： 271 ；和 Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 ；93 ：11307-11312。 除提供在本发明的 实践中有用的载体的例子外，本文引用和引入本文作为参考的文件还可以提供关于在本 发明的组合物中或包括在本发明的组合物中待由一种或多种载体表达的肽或其片段的来 源。
本发明还涉及包含载体例如表达载体的制剂，例如治疗组合物。 制剂可以包含 一种或多种载体、基本上由一种或多种载体组成或由一种或多种载体组成，例如表达载 体，例如体内表达载体，包含下述、基本上由下述组成或由下述组成 ( 且有利地表达 ) ： 一种或多种目的抗原、表位或免疫原。 有利地，载体包含且表达这样的多核苷酸，所述 多核苷酸包括下述、基本上由下述组成或由下述组成 ：编码 ( 且有利地表达 ) 目的抗原、 表位、免疫原、肽或多肽的多核苷酸，在药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介 物中。 因此，根据本发明的一个实施方案，制剂中的其他一种或多种载体包含这样的多 核苷酸、基本上由这样的多核苷酸组成或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码目 的抗原、表位、免疫原、肽或多肽或其片段的一种或多种其他蛋白质，并且在合适的环 境下，该载体表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽或其片段的一种或多种其他蛋白 质。
根据另一个实施方案，制剂中的一种或多种载体包含这样的多核苷酸、或基本 上由这样的多核苷酸组成或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码目的抗原、表 位、免疫原、肽或多肽或其片段的一种或多种蛋白质或其片段，一种或多种载体表达一 种或多种多核苷酸。 本发明制剂有利地包含至少 2 种载体、基本上由至少 2 种载体组 成或由至少 2 种载体组成，所述至少 2 种载体包含下述、基本上由下述组成或由下述组 成，并且有利地在体内在合适条件下或适当条件下或在合适的宿主细胞中有利地还表达 下述 ：来自不同编码相同蛋白质和 / 或不同蛋白质，但有利地相同的蛋白质的分离物的 多核苷酸。 制剂包含一种或多种载体，所述载体包含这样的多核苷酸、基本上由这样的 多核苷酸组成或由这样的多核苷酸组成，所述多核苷酸编码且有利地在体内有利地表达 目的抗原或融合蛋白或其表位。 本发明还涉及载体的混合物，所述载体包含下述、基本 上由下述组成或由下述组成 ：编码且表达不同抗原、表位或免疫原，例如来自不同物种 的抗原、表位、免疫原、肽或多肽，所述物种例如但不限于鸟类、犬、猫、牛、马、人 和猪。
根据本发明的另一个实施方案，表达载体是用于在合适的细胞系统中体外表达 蛋白质的表达载体。 在分泌后或不在分泌后 ( 如果不存在分泌，那么一般发生或执行细胞裂解 )，所表达的蛋白质可以在或从培养上清液中收集，任选地通过常规方法例如超滤 浓缩和 / 或通过纯化手段纯化，例如亲和力、离子交换或凝胶过滤类型的层析法。
“宿主细胞” 指原核或真核细胞，其已在遗传上改变，或能够通过施用外源多 核苷酸例如重组质粒或载体而在遗传上改变。 当提及遗传上改变的细胞时，该术语指最 初改变的细胞及其后代。 有利的宿主细胞包括但不限于，幼仓鼠肾细胞 (BHK)、结肠癌 (Caco-2) 细胞、COS7 细胞、MCF-7 细胞、MCF-10A 细胞、Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞、 Madin-Darby 牛肾细胞 (MDBK)、貂肺 (Mvl Lu) 细胞、 MRC-5 细胞、 U937 细 胞和 VERO 细胞、中国仓鼠卵巢 (CHO)K1 细胞。 包含所需序列的多核苷酸可以插入合 适的克隆或表达载体内，并且可将载体再引入合适的宿主细胞内用于复制和扩增。 多核 苷酸可以通过本领域已知的任何方法引入宿主细胞内。 包含目的多核苷酸的载体可以通 过许多合适方法中的任何引入宿主细胞内，包括直接摄取，胞吞作用，转染，核转染， f- 配对，电穿孔，利用氯化钙氯化铷、磷酸钙、 DEAE- 葡聚糖或其他物质的转染 ；微粒 轰击 ；脂转染 ；和感染 ( 其中载体是传染性的，例如逆转录病毒载体 )。 引入载体或多 核苷酸的选择通常将依赖于宿主细胞的特征。
在一个有利的实施方案中，本发明提供了治疗有效量制剂的施用用于在靶细胞 中递送且表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。 治疗有效量的测定对于本领域普通 技术人员是常规实验。 在一个实施方案中，制剂包含表达载体和药学或兽医学上可接受 的载体、媒介物或赋形剂，所述表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸表达目的抗原、 表位、免疫原、肽或多肽。 在一个有利的实施方案中，药学或兽医学上可接受的载体、 媒介物或赋形剂促进载体或蛋白质的转染和 / 或改善载体或蛋白质的保存。
药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂是本领域技术人员众所周知 的。 例如，药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是 0.9％ NaCl( 例如盐 水 ) 溶液或磷酸盐缓冲液。 可以用于本发明方法的其他药学或兽医学上可接受的载体或 媒介物或赋形剂包括但不限于聚 (L- 谷氨酸盐 ) 或聚乙烯吡咯烷酮。 药学或兽医学上可 接受的载体或媒介物或赋形剂可以是促进载体 ( 或在体外由本发明载体表达的蛋白质 ) 施 用的任何化合物或化合物组合 ；有利地，载体、媒介物或赋形剂可以促进载体 ( 或蛋白 质 ) 的转染和 / 或改善载体 ( 或蛋白质 ) 的保存。 剂量和剂量体积在本文中在一般描述 中讨论，并且还可以通过技术人员根据与本领域知识结合阅读的本公开内容进行测定， 无需任何过度实验。
有利地但并非唯一适合于质粒的包含季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下式的 那些 ：
其中 R1 是具有 12-18 个碳原子的饱和或不饱和直链脂肪族原子团，R2 是包含 2-3 个碳原子的另一种脂肪族原子团，并且 X 是胺或羟基，例如 DMRIE。 在另一个实施方案 中，阳离子脂质可以与中性脂质例如 DOPE 结合。
在这些阳离子脂质中，优选的是 DMRIE(N-(2- 羟乙基 )-N， N- 二甲基 -2，
3- 双 ( 十四烷氧基 )-1- 丙烷铵 ；WO96/34109)，有利地与中性脂质有利地 DOPE( 二油 酰基 -3- 磷脂酰乙醇胺 ；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389) 结合，以 形成 DMRIE-DOPE。
有利地，具有佐剂的质粒混合物随时且有利地与制剂施用同时或在制剂施用前 不久形成 ；例如有利地在施用前不久或在施用前，形成质粒 - 佐剂混合物，以便在施用 给出足够时间用于混合物形成复合物，例如在施用前约 10- 约 60 分钟，例如在施用前约 30 分钟。
当 DOPE 存在时，DMRIE ∶ DOPE 摩尔比有利地是约 95 ∶约 5 到约 5 ∶约 95， 更有利地约 1 ∶约 1，例如 1 ∶ 1。
DMRIE 或 DMRIE-DOPE 佐剂∶质粒重量比可以是约 50 ∶约 1 到约 1 ∶约 10， 例如约 10 ∶约 1 到约 1 ∶约 5，并且有利地约 1 ∶约 1 到约 1 ∶约 2，例如 1 ∶ 1 和 1 ∶ 2。
根据本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种佐剂、或基本上由 一种或多种佐剂组成。 用于在本发明的实践中使用的合适佐剂是 (1) 丙烯酸或甲基丙 烯酸聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物， (2) 免疫刺激序列 (ISS)，例如具有一个 或多个非甲基化 CpG 单位的寡脱氧核苷酸序列 (Klinman 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.， USA，1996，93，2879-2883 ；WO98/16247)， (3) 水包油乳状液，例如在由 M.Powell， M.Newman， Plenum Press 1995 出 版 的 ″ VaccineDesign， The Subunit and Adjuvant Approach″的第 147 页上描述的 SPT 乳状液，和在相同著作的第 183 页上描述的乳状液 MF59，(4) 包含季铵盐的阳离子脂质例如 DDA，(5) 细胞因子，(6) 氢氧化铝或磷酸铝， (7) 皂苷或 (8) 在本申请中引用且引入作为参考的任何文件中讨论的其他佐剂，或 (9) 其 任何组合或混合物。
特别适合于病毒载体的水包油乳状液 (3) 可以基于 ：轻液体石蜡油 ( 欧洲药典类 型 )，类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯，起因于烯烃寡聚的油，例如异丁烯或癸烯，具 有直链烷基的酸或醇的酯，例如蔬菜油、油酸乙酯、丙二醇、二 ( 辛酸盐 / 癸酸盐 )、甘 油三 ( 辛酸盐 / 癸酸盐 ) 和丙二醇二油酸酯，或分支、脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸 酯。
油与乳化剂组合使用以形成乳状液。 乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例 如 ：一方面山梨聚糖酯、二缩甘露醇酯 ( 例如脱水甘露醇油酸酯 )、甘油酯、聚甘油酯或 丙二醇酯，以及另一方面油酸、异硬脂酸、蓖麻酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选是乙氧 基化的，或聚氧丙烯 - 聚氧乙烯嵌段共聚物，例如 Pluronic，例如 L121。
在 (1) 型佐剂聚合物中，优选的是交联丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，特别通过 糖或多元醇的聚烯基醚交联的。 这些化合物在名称卡波姆 (Pharmeuropa，第 8 卷，no.2， 1996 年 6 月 ) 下已知。 本领域技术人员还可以参考美国专利号 2,909,462，其提供通过具 有至少 3 个羟基，优选不超过 8 个此种基团的多羟基化合物交联的此种丙烯酸聚合物，至 少 3 个羟基的氢原子由具有至少 2 个碳原子的不饱和、脂肪族原子团替换。 优选的原子团 是包含 2-4 个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其他烯化不饱和基团。 不饱和原子 团还可以包含其他取代基，例如甲基。 在名称 Carbopol(BF Goodrich，Ohio，USA) 下出 售的产品是特别合适的。 它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。 在它们中， 提及 Carbopol 974P、934P 和 971P。关于马来酸酐 - 烯基衍生物共聚物，优选的是 EMA(Monsanto)，它是直链或交 联乙烯 - 马来酸酐共聚物，并且它们是例如通过二乙烯醚交联的。 还参考 J.Fields 等人， Nature 186 ：778-780， June 4，1960。
就结构而言，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和 EMA 优选通过具有下式的基本单位 形成 ：
其中 ：
- 可以相同或不同的 R1 和 R2 表示 H 或 CH3
-x ＝ 0 或 1，优选 x ＝ 1，
-y ＝ 1 或 2，其中 x+y ＝ 2。
对于 EMA， x ＝ 0 和 y ＝ 2，并且对于卡波姆， x ＝ y ＝ 1。
这些聚合物在水或是生理盐溶液 (20g/l NaCl) 中是可溶的，并且 pH 可以例如通 过苏打 (NaOH) 调节至 7.3 到 7.4，以提供其中可以掺入一种或多种表达载体的佐剂溶液。 最终疫苗组合物中的聚合物浓度可以是 0.01-1.5％ w/v，有利地 0.05-1％ w/v，并且优选 0.1-0.4％ w/v。
一种或多种细胞因子 (5) 在免疫原性或疫苗组合物中可以是蛋白质形式，或可 以在宿主中与一种或多种免疫原或其一个或多个表位共表达。 优选的是一种或多种细胞 因子通过与表达一种或多种免疫原或其一个或多个表位的相同载体或通过为此分别的载 体的共表达。
本发明包含制备此种联合组合物 ；例如通过使活性组分有利地与佐剂、载体、 细胞因子和 / 或稀释剂混合在一起。
可 以 在 本 发 明 中 使 用 的 细 胞 因 子 包 括 但 不 限 于， 粒 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (G-CSF)、粒细胞 / 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、干扰素 α(IFNα)、干扰素 β(IFNβ)、 干 扰 素 γ(IFNγ)、 白 介 素 -1α(IL-1α)、 白 介 素 -1β(IL-1β)、 白 介 素 -2(IL-2)、白介素 -3(IL-3)、白介素 -4(IL-4)、白介素 -5(IL-5)、白介素 -6(IL-6)、 白 介 素 -7(1L-7)、 白 介 素 -8(IL-8)、 白 介 素 -9(IL-9)、 白 介 素 -10(IL-10)、 白 介 素 -11(IL-11)、 白 介 素 -12(IL-12)、 肿 瘤 坏 死 因 子 α(TNFα)、 肿 瘤 坏 死 因 子 β(TNFβ) 和转化生长因子 β(TGFβ)。 应当理解细胞因子可以与本发明的免疫原性 或疫苗组合物共施用和 / 或顺次施用。 因此，例如本发明的疫苗还可以包含外源核酸分 子，其在体内表达合适的细胞因子，例如与待接种疫苗或在其中待引发免疫应答的这种 宿主匹配的细胞因子 ( 例如犬细胞因子用于待施用于犬的制剂 )。
有利地，根据本发明的药物和 / 或治疗组合物和 / 或制剂包含有效量、或基本上 由有效量组成或由有效量组成，以引发一种或多种表达载体和 / 或多肽的治疗应答，如 本文讨论的 ；并且，有效量可以根据本公开内容包括本文引入的文件和本领域知识进行 测定，无需过度实验。
在基于质粒载体的治疗和 / 或药物组合物的情况下，一般而言剂量可以包含
下述、或基本上与下述组成或由下述组成 ：约 1μg- 约 2000μg，有利地约 50μg- 约 1000μg，并且更有利地约 100μg- 约 800μg 表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽 的质粒。 当基于质粒载体的治疗和 / 或药物组合物由电穿孔施用时，质粒的剂量一般是 0.1μg-1mg，有利地约 1μg-100μg，有利地约 2μg-50μg。 剂量体积可以是约 0.1- 约 2ml，有利地约 0.2- 约 1ml。 这些剂量和剂量体积适合于治疗哺乳动物靶物种。
在一个有利的实施方案中，动物用灭活疫苗的 2 个剂量以约 3-4 周间隔经由皮下 途径进行疫苗接种，尽管还考虑了肌内途径。 血样可以在第一次和 / 或第二次疫苗接种 当天和第二次疫苗接种后约 2-4 周时收集，以通过本领域技术人员已知的方法测定特异 性抗体水平，所述方法例如病毒中和、血凝素抑制、 ELISA 或单向辐射状溶血 (SRH) 测 试。
本领域技术人员应当理解本文公开内容提供作为例子，并且本发明并不限于 其。 根据本文公开内容和本领域知识，技术人员可以测定施用次数、施用途径、和待用 于每种注射方案的剂量，无需任何过度实验。
本发明考虑了对动物至少一次施用有效量的根据本发明制备的治疗组合物。 动 物可以是雄性、雌性、妊娠雌性和新生儿。 这种施用可以经由各种途径，包括但不限 于，肌内 (IM)、皮内 (ID) 或皮下 (SC) 注射或经由鼻内或经口施用。 根据本发明的治疗 组合物还可以通过无针器械 ( 例如用 Pigjet、 Biojector 或 Vitajet 器械 (Bioject， Oregon， USA)) 进行施用。 施用质粒组合物的另一种方法是使用电穿孔 ( 参见例如， S.Tollefsen 等 人 Vaccine，2002，20，3370-3378 ；S.Tollefsen 等 人 Scand.J.Immunol.，2003，57， 229-238 ；S.Babiuk 等人，Vaccine，2002，20，3399-3408 ；PCT 申请号 WO99/01158)。 在另一个实施方案中，治疗组合物通过基因枪或金颗粒轰击递送给动物。 在一个有利的 实施方案中，动物是脊椎动物。
本发明的一个实施方案是在动物中引发针对目的抗原、表位、免疫原、肽或多 肽的免疫应答的方法，其包括以有效量施用用于递送且表达重组疫苗的制剂用于引发免 疫应答。 本发明的另外一个实施方案是在动物中诱导免疫或保护应答的方法，其包括给 动物施用有效量的用于递送且表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的制剂，其中制 剂包含重组疫苗和药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。
本发明涉及引发、诱导或刺激动物有利地哺乳动物或脊椎动物的免疫应答的方 法。
本发明的另一个实施方案是用于执行在动物中诱导针对目的抗原、表位、免疫 原、肽或多肽的免疫或保护应答的方法的试剂盒，其包括重组疫苗和用于执行以有效量 递送用于在动物中引发免疫应答的方法的说明书。
本发明现在将通过下述非限制性实施例进一步描述。
实施例 1 ：在细菌中卡那霉素抗性 ( “KanaR”) 基因表达效率对质粒复制效率 的影响
下述实施例举例说明在细菌中卡那霉素抗性 ( “KanaR”) 基因表达效率对质粒 复制效率的影响。
首先，分析 KanaR 表达盒元件，特别是一个或多个启动子、翻译起始和转录终 止。 在分析这些表达元件后，修饰这些元件并且分析经修饰的元件对质粒生产产率的影响。 鉴定了 4 种潜在的启动子。 P3(SEQID NO ：3) 从数据库和文献检索中鉴定，结 构在 GenBank AN#X00928(SEQ ID NO ：4) 中描述但未通过目前软件检测出。 P2(SEQ ID NO ：2) 通过生物信息学分析鉴定并且也在公开的 GenBank AN#V00359(SEQID NO ： 5) 中发现。 P1(SEQ ID NO ：1) 是属于 pVR1012 骨架的另外潜在启动子。 P0 是属于 pVR1012 骨架的另一种潜在启动子。 图 1 显示 P2(SEQ ID NO ：2) 和 P 3 如何部分重叠。
在 pVR1012 中不存在 KanaR 的转录终止信号序列。 这可以具有许多潜在后 果。 许多 KanaR 转录物可以异常地长并且降解，因为将存在无用的代谢负荷。 此外， KanaR 表达在 pVR1012 中可以是亚最佳的。 KanaR 转录可以通过复制起点 ORI 继续， 并且干扰复制起始，如图 2 中示意性显示的。 因此，鉴定了 2 种合适的转录终止子 ： 可以在 GenBankAN#U13872(SEQ ID NO ：6) 中发现并且在许多商业表达载体中使用的 rrnBT1+T2，和具有登记号 M31770(SEQ ID NO ：7) 的 speA。 此外， pVR1012 的 ATG 起始密码子由 TTG 替换，以便降低翻译起始效率。 因此，目的是测定每种经修饰的表达 盒对卡那霉素抗性能力和质粒生产产率的影响。
因此，用启动子 P1(SEQ ID NO ：1)、 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 或 P1(SEQ ID NO ：1) 与 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3)，转录终止子 rrnBT1+T2 或 speA，以及起始密码子 TTG 产生了 PVR1012 衍生物。 为了将此种 DNA 序列引入 KanaR ORF 上游或下游，需要 单个限制位点。 此种位点在 pVR1012 中未发现，所以它们通过定点诱变引入。
首先，将 KanaR 盒克隆到诱变载体 pALTER-1 内，如图 3 中所示。 图 4 显示了 PacI 限制位点如何被引入 KanaR ORF 下游，从而产生 pLL2，SwaI 限制位点被引入上游， 和 RsrII 限制位点被引入下游，从而产生 pLL4，并且最后使翻译起始密码子 ATG 突变成 TTG，产生 pLL6。 突变的 pLL4 的 KanaR 盒随后被克隆到 pVR1012 内，以形成 pLL7， 如图 5 中所示。 随后通过 PCR 将 rrnB 终止序列从 pSB062 克隆到 pLL7 内，和后续 PacI RsrII 消化，以形成 pLL9，如图 6 中所示。 图 7 显示了 speA 终止序列通过合成寡核苷 酸的退火被克隆到 pLL7 内，和 PacI RsrII 消化，以形成 pLL11。 接下来，突变的 pLL6 的翻译起始序列通过 MscIPacI 消化被克隆到 pLL9 内，以形成 pLL10，如图 8 中所示。 最后，图 9 举例说明了启动子序列 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 与 P1(SEQ ID NO ：1)、 P1(SEQ ID NO ：1) 和 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 如何被分别通过 URS11-URS12 PCR、 URS13-URS12 PCR 和 URS11-URS 14 PCR 进行克隆。 图 10、11 和 12 显示这些随后如何 被掺入 pLL9 内，以分别形成 pLL13、14 和 15。 类似地，图 13 显示了 P1(SEQ ID NO ： 1) 如何被掺入 pLL7 内，以形成 pLL16。 图 14 显示了几种所得到的构建体。 pLL13、 pLL14、pLL15 和 pLL16 构建体具有在 CMV 启动子和 Kana P1(SEQ ID NO ：1) 启动子之 间的 192 碱基对缺失，如由图 15 举例说明的。 表 1 概括了这些构建体。
表1
* 具有在 CMV 启动子和 Kana P1 启动子之间的 192bp 缺失的构建体
修饰对 KanaR 基因转录物大小的影响通过 RNA 印迹实验加以证实。 这些证 实 pVR1012 KanaR 转录物的异质性，如由花点显示的。 它们还证实在 pLL9、 pLL10 和 pLL11 中 3 种活性启动子的存在 ：来自 P2/P3(SEQID NO ：2-3) 的一种主要的短转录 物，和来自 P0 和 P1(SEQ ID NO ：1) 的 2 种较弱的转录物。 如预期的，pLL13 产生 2 种 转录物，并且 pLL14 和 pLL15 仅产生 1 种。
随后对 pVR1012 衍生物测试几种参数，以便评估其新特征。 抵抗渐增的卡那霉 素浓度的能力这样进行测试，首先在 LB 培养基中接种包含每种构建体 pVR1012 到 pLL15 的 1 个细菌菌落，并且在 37℃和 200RPM 下生长过夜。 每种悬浮液中的细菌通过分光光 度法 (OD600nm) 进行定量。 将细菌悬浮液的合适稀释物 50 或 100μl 铺平板在包含渐增 的卡那霉素浓度的 LB 培养基上。 最后，计数菌落，其结果显示于图 16 中。 这些结果显 示包含大多数 pVR1012 衍生物的细菌无需适应就具有抵抗渐增的卡那霉素浓度的相同能 力，因为生长在 0-800μg/ml 之间不受影响，并且在 3200μg/ml 时被抑制。 包含 pLL10 和 pLL14 的细菌具有显著降低的抵抗卡那霉素的能力，因为生长在 800μg/ml 时但不是 在 200μg/ml 时被抑制 90％ -100％。 因此，得出结论，P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 启动子 的缺失或降低的翻译效率对 KanaR 酶生产具有显著影响，指出 P2/P3(SEQ ID NO ：2-3) 启动子对 KanaR 表达最有效，并且 TTG 抑制剂降低 KanaR 表达。 然而，这些突变仍使 细菌抵抗力成为可能并且在常规 Kana 浓度的存在下生长。
EGLI 培养基适应能力这样进行测试 ：首先使包含每种细菌构建体的细菌细胞悬 浮液和 104CFU 在 LB 中生长，并且其后在 EGLI 平板上铺平板。 随后将包含每种构建体 的 25-50 个分离菌落铺平板在新 EGLI 平板上。 计数生长菌落，其结果显示于表 2 中。 pLL10、pLL14 和 pLL16 质粒骨架对包含其的细菌赋予在营养素限制培养基中明确的生长 优点。 此外，在 Kana 100μg/ml 的存在下，降低的卡那霉素生产能力与在低营养培养基 上更佳的适应能力相关。
表2
在实验室生长条件下获得的质粒产率这样进行测试，首先使包含每种构建体的 一个细菌菌落在具有 Kana 100μg/ml 的液体 LB 培养基中在 37℃和 200RPM 下生长过夜。 在每种悬浮液中的细菌量通过分光光度法 OD600 进行评估。 来自每种悬浮液的 DNA 使用 Eppendorf 柱进行纯化，并且通过分光光度法 OD260 进行定量，每种 DNA 溶液定量 2 次。 随后计算每种悬浮液中的质粒拷贝数，其结果在图 17 中可见。 在具有 Kana 100μg/ml 的 液体 LB 培养基中生长后，在不同构建体之间未观察到显著差异。 通过将衍生自每种构建 体的 3 个质粒制剂提交限制性分析进一步评估质粒稳定性。
在实验室生长条件下获得的质粒产率通过首先在固体培养基上适应 EGLI 进行测 试。 包含每种构建体的实验 A 和 B 分别 15 和 25 个菌落在液体 EGLI 培养基中在 37℃和 200RPM 下生长过夜。 在每种悬浮液中的细菌量通过分光光度法 OD600 进行评估。 来自 每种悬浮液的 DNA 使用 Qiagen 柱进行纯化，并且通过分光光度法 OD260 进行定量。 随 后推导每种悬浮液中的质粒拷贝数，其结果在图 19 中可见。
结果显示就在实验室条件下在 EGLI 培养基中的质粒产率而言，构建体 pLL14 和 pLL16 是最佳候选物。 此外，当构建体包含转录终止子和有效的翻译起始 (ATG) 时，质 粒产率显著较低。 伴随地，当构建体不包含翻译终止子或包含亚最佳 P1(SEQ ID NO ： 1) 启动子或亚最佳翻译起始 (TTG) 时，质粒产率最高。 质粒产率在构建体 pVR1012 和 pLL10 中可比较，表明低翻译效率补偿转录终止子的负面效应。 这些结果暗示表达 KanaR 的能力越低，质粒产率越高。 在测试的延伸中，通过将衍生自每种构建体的每个 质粒制剂进行限制性分析进一步评估质粒稳定性。 表 2 显示这种分析的结果。 在 EGLT 适应后，对于 pLL10、pLL14、pLL16 和 pLL19 未检测出突变，而它对于其他构建体超过 9％。 还发现在 pLL14、 pLL16 和 pLL19EGLI 适应的克隆中，存在增加的质粒产率同质
性。 图 20 举例说明了用构建体 pVR1012 的高质粒产率异质性和用构建体 pLL14 或 pLL19 的较低异质性之间的差异。
通过发酵获得的质粒产率通过首先任意选择 EGLI 适应的 SCS1/pLL14 的一个 菌落用于发酵进行测试。 发酵后，细菌进行离心，并且从等分试样中提取质粒，并且根 据由 PGEA 开发的方法定量 2 次。 结果显示 SCS1/pLL14 的生长率显著低于通常对于 pVR1012 衍生物例如 pPB266 和 pPB662 观察到的那种。 此外，pLL14 的特异性质粒产率 是 3.1mg 质粒 /g 细菌团块。 这个结果对应于在 Kana 适应和克隆选择后用 pVR1012 衍生 物例如 pPB266 曾经获得的最佳结果。 随后通过将来自每种发酵克隆的质粒制剂进行具 有 3 种不同限制性消化图谱的限制性分析评估质粒稳定性。 表 4 提供总体质粒分析结果 的概括。 结果显示 KanaR 表达水平对质粒复制效率具有影响。 表达越低，在低营养素 培养基和 Kana 100μg/ml 中的复制率越高。 较低的 KanaR 表达可以这样获得 ：使天然 启动子 (P2/P3(SEQ ID NO ：2-3)) 缺失，确保转录终止信号的不存在并且使翻译起始突 变。 低 KanaR 表达导致与亲本质粒骨架 pVR1012 相比，高达 50％增加的质粒产率。 它 还导致增加的质粒稳定性和质粒生产产率中的同质性。 这因此可能允许有限克隆选择。
表4
* 具有在 CMV 启动子和 Kana P1 启动子之间的 192bp 缺失的构建体
** 在第二质粒产率定量测试中获得的结果。
*** 在第三质粒产率定量测试中获得的结果。
对质粒 pLL16 实施进一步分析，例如对渐增的 Kana 浓度的抗性和在发酵后的质 粒产率。 还完成了 pLL17 和 pLL18 的构建，其中 pLL17 具有 P1 启动子、TTG 起始密码 子和终止子 rrnB T1/2，并且 pLL18 具有 p1 启动子、TTG 起始密码子且无终止子。然而， 由于低 KanaR 能力，这些构建体可能难以获得。 使用先前描述的测试分析这些构建。 在 所选择的构建体 ( 例如 pLL14 至 -18) 的 Kana 适应后执行质粒产率测试。 执行来自所有
构建的 KanaR 基因的 RNA 转录物分析，以证实推导模型。 通过使 KanaR 盒在 pVR1012 内翻转，可以证实 KanaR 盒对复制起点无影响。
实施例 2 ：序列
定义转座子来自质粒 P1 的 Tn2350Km(r) 基因 5’ 区。
登记 X00928(SEQ ID NO ：4)
1 gaattcccgc agattaacgc gcataacaag cggtttactc gttttggcct gcaatgtaac
61 ataatataca ttatgcgcac taaggtagag gcagcaagat tatgcggttt tgatcagaac
121 tcagttaacc atcccgggat tctgctctgg cccattcagc gcagtttttt actttggatg
181 aagttaaccc atgttatatt gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt
241 ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt
301 gctcgaggga attc
定义转座子 Tn903。
登记 V00359J01839(SEQ ID NO ：5)
1 ggctttgttg aataaatcag atttcgggta agtctccccc gtagcgggtt gtgttttcag
61 gcaatacgca cgctttcagg catacctgct ttcgtcattt tgttcagcgc tcgtaccagg
121 gccatagcct ccgcaacctg accatcgtag tcacgcagcg tcagtgaacc cccgaacagc 181 tgttttaccc ggtacatcgc cgtttccgct atcgagcgac ggttgtaatc tgttgtccat 241 ttccaccgcg cattactccc ggtcattcgc tgattagcca ctgcacggtt acggtctgca 301 tattcaccgg gccagtaacc cgcacctttt cggggaggga taagcgcgct gattttctta 361 cgccgcagtt catcgtgaca gagccgggtg tcgtaagcgc cgtctgccga tgctgccctg 421 atttttctgt gagtctgccg gataagaccc gggaaggctt ctgagtcggt cacattgttc 481 agcgacaggt cagcgcagat gatttcatgt gttttactgt caacggcgag atgcagctta 541 cgccagatac ggcggcgttc ctggccatgc tttttgactt tccattcgcc ttcaccaaag 601 accttcagcc cggtggaatc aatcaccaga tgcgcgattt caccccgggt gaacgttttg 661 aaactgatat taaccgactt tgcccgcctg ctgacacagc tgtaatccgg gcagcgcaac 721 ggaacattca tcagtgtaaa aatggaatca ataaagccct gcgcagcgcg cagggtcagc 781 ctgaatacgc gtttaatgac cagcacagtc gtgatggcaa ggtcagaata gcgctgaggt 841 ctgcctcgtg aagaaggtgt tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc atcatccagc 901 cagaaagtga gggagccacg gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt 961 ttgaactttt gctttgccac ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc 1021 ttcaactcag caaaagttcg atttattcaa caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga 1081 tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata 1141 aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctcgaggccg 1201 cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc 1261 gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt 1321 ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac 1381 tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat 1441 gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat 1501 cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg1561 attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa 1621 tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg 1681 cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc 1741 gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt 1801 tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg 1861 aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt 1921 gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca 1981 gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcggc 2041 tttgttgaat aaatcgaact tttgctgagt tgaaggatca gatcacgcat cttcccgaca 2101 acgcagaccg ttccgtggca aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc acctacaaca 2161 aagctctcat caaccgtggc tccctcactt tctggctgga tgatggggcgattcaggcct 2221 ggtatgagtc agcaacacct tcttcacgag gcagacctca gcgctattct gaccttgcca 2281 tcacgactgt gctggtcatt aaacgcgtat tcaggctgac cctgcgcgct gcgcagggct 2341 ttattgattc catttttaca ctgatgaatg ttccgttgcg ctgcccggat tacagctgtg 2401 tcagcaggcg ggcaaagtcg gttaatatca gtttcaaaac gttcacccgg ggtgaaatcg 2461 cgcatctggt gattgattcc accgggctga aggtctttgg tgaaggcgaa tggaaagtca 2521 aaaagcatgg ccaggaacgc cgccgtatct ggcgtaagct gcatctcgcc gttgacagta 2581 aaacacatga aatcatctgc gctgacctgt cgctgaacaa tgtgaccgac tcagaagcct 2641 tcccgggtct tatccggcag actcacagaa aaatcagggc agcatcggca gacggcgctt 2701 acgacacccg gctctgtcac gatgaactgc ggcgtaagaa aatcagcgcg cttatccctc 2761 cccgaaaagg tgcgggttac tggcccggtg aatatgcaga ccgtaaccgt gcagtggcta 2821 atcagcgaat gaccgggagt aatgcgcggt ggaaatggac aacagattac aaccgtcgct 2881 cgatagcgga aacggcgatg taccgggtaa aacagctgtt cgggggttca ctgacgctgc 2941 gtgactacga tggtcaggtt gcggaggcta tggccctggt acgagcgctg aacaaaatga 3001 cgaaagcagg tatgcctgaa agcgtgcgta ttgcctgaaa acacaacccg ctacggggga 3061 gacttacccg aaatctgatt tattcaacaa agcc 定义 pTrc99a 克隆载体，全序列。 登记 U13872(SEQ ID NO ：6) 1 gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 61 ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 121 gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 181 tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 241 taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta 301 gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 361 tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 421 gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 481 atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 541 aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 601 ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg661 tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 721 acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa 781 atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 841 agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 901 ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 961 gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 1021 gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 1081 tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1141 acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1201 aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1261 cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 1321 gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1381 cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1441 tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1501 tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1561 ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1621 tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1681 gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1741 ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1801 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1861 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1921 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1981 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2041 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2101 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2161 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2221 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2281 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2341 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2401 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2461 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2521 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2581 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2641 cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2701 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2761 gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2821 gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2881 gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2941 ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc3001 tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa
3061 ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc
3121 gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg
3181 gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg
3241 ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg
3301 attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc
3361 ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg
3421 atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat
3481 gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc
3541 catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc
3601 gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat
3661 aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc
3721 atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg
3781 ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg
3841 cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat
3901 atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac
3961 cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca
4021 ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg
4081 gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg
4141 caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg
定义大肠杆菌精氨酸脱羧酶 (speA) 基因，完全 cds，鲱精胺酶 (speB) 和甲硫氨 酸腺苷转移酶 (metK) 基因，5’ 末端。
登记 M31770(SEQ ID NO ：7)
1 tacccaaggt cgctggtggt gatttcgccg ccaactaaaa ccaatgccgg tttttacgta
61 ggtttcgcaa gcaacgcgtg ctttcggatc ctgttcgagg atcgcgtcta aaacggcatc
121 agaaatttgg tcagcaattt tgtcaggatg cccttcagag acggactcgg acgtaaaaag
181 gtgttttgcc atatttaata tcacctaaag agaatttggt tagctcaaac tgttgtgtgg
241 attttctgtg gtagcggatc ctaccacgac tctgcaggtt aaaaacactg gcagtctgag
301 tgttaatcgg tatggatgga ttaacatctg gatggctatt ttaggtcaat tcttcaccct
361 atttccactt ttttttgaat cgtgtctcat tctgttaaaa acgtggctgg aaatttttcc
421 tgacaatgcc ggcattctgc gtatttatct tttgcaattt tctgccattg tggggtataa
481 aacgcggcgc gcggcttaaa taaaaagcac acgacgtttc tttcgtgttg ccacttccag
541 ccgggttcaa atcagagttt tggcttgtgg gttcgtctta acaggcggcc gtggaggtga
601 tacgaaataa tgaaccgttg tctgctgctt aacctgtctc accgttctgg tgaagattcg
661 ttccccgcac tctgcatctc tgctttgcat acctgccgat gttataccca tctcggcgct
721 tctcaggatt caagagctgg ttacagttac tgaggactga acaagggcgc tcttgtaaaa
781 acaagagttt tctcgtggtt tcgccgaact ttcacactta cgttcggtta tgtgcttaat
841 aatgttatga aaaagaaacc ggttgcgcag ttggagcgtc agcattcact gctggaaaat
901 ccatgtgctt atgggttgtt atcgcagttc caggctgcga tagtcgttaa ctgttttaca961 cttaataaaa taatttgagg ttcgctatgt ctgacgacat gtctatgggt ttgccttcgt 1021 cagcgggcga acacggtgta ctacgctcca tgcaggaggt tgcaatgagc tcccaggaag 1081 ccagcaagat gctgcgtact tacaatattg cctggtgggg caataactac tatgacgtta 1141 acgagctggg ccacattagc gtgtgcccgg acccggacgt cccggaagct cgcgtcgatc 1201 tcgcgcagtt agtgaaaact cgtgaagcac agggccagcg tctgcctgca ctgttctgtt 1261 tcccacagat cctgcagcac cgtttgcgtt ccattaacgc cgcgttcaaa cgtgcgaggg 1321 aatcctacgg ctataacggc gattacttcc ttgtttatcc gatcaaagtt aaccagcacc 1381 gccgcgtgat tgagtccctg attcattcgg gcgaaccgct gggtctggaa gccggttcca 1441 aagccgagtt gatggcagta ctggcacatg ctggcatgac ccgtagcgtc atcgtctgca 1501 acggttataa agaccgcgaa tatatccgcc tggcattaat tggcgagaag atggggcaca 1561 aggtctatct ggtcattgag aagatgtcag aaatcgccat tgtgctggat gaagcagaac 1621 gtctgaatgt cgttcctcgt ctgggcgtgc gtgcacgtct gcgttcgcag ggttcgggta 1681 aatggcagtc ctccggcggg gaaaaatcga agttcggcct ggctgcgact caggtactgc 1741 aactggttga aaccctgcgt gaagccgggc gtctcgacag cctgcaacta ctgcacttcc 1801 acctcggttc gcagatggcg aatattcgcg atatcgcgac aggcgttcgt gaatccgcgc 1861 gtttctatgt ggaactgcac aagctgggcg tcaatattca gtgcttcgac gtcggcggcg 1921 gtctgggcgt ggattatgaa ggtactcgtt cgcagtccga ctgttcggtg aactacggcc 1981 tcaatgaata cgccaacaac attatctggg cgattggcga tgcgtgtgaa gaaaacggtc 2041 tgccgcatcc gacggtaatc accgaatcgg gtcgtgcggt gactgcgcat cacaccgtgc 2101 tggtgtctaa tatcatcggc gtggaacgta acgaatac8c ggtgccgacc gcgcctgc8g 2161 aagatgcgcc gcgcgcgctg caaagcatgt gggaaacctg gcaggag8tg cacgaaccgg 2221 gaactcgccg ttctctgcgt gaatggttac acgacagtca gatggatctg cacgacattc 2281 atatcggcta ctcttccggc atctttagcc tgca8gaacg tgcatgggct gagcagcttt 2341 atttgagcat gtgccatgaa gtgcaaaagc agctggatcc gcaaaaccgt gctcatcgtc 2401 cgattatcga cgagctgcag gaacgtatgg cggacaaaat gtacgtcaac ttctcgctgt 2461 tcc8gtcgat gccggacgca tgggggatcg accagttgtt cccggttctg ccgctggaag 2521 ggctggatca agtgccgg8a cgtcgcgctg tgctgctgga tattacctgt g8ctctgacg 2581 gtgct8tcga ccactatatt gatggtgacg gtattgccac gacaatgcca atgccggagt 2641 acgatccaga gaatccgccg atgctcggtt tctttatggt cggcgcatat caggagatcc 2701 tcggcaacat gcacaacctg ttcggtgata ccgaagcggt tgacgtgttc gtcttccctg 2761 acggtagcgt agaagtagaa ctgtctgacg aaggcgatac cgtggcggac atgctgcaat 2821 atgtacagct cgatccgaaa acgctgttaa cccagttccg cgatcaagtg aag8aaaccg 2881 atcttg8tgc tgaactgcaa caacagttcc ttgaagagtt cgaggcaggt ttgtacggtt 2941 atacttatct tgaagatgag taagtcctgt gttacttgaa tccgcttaat ttagcggtga 3001 taatccgcca caatttattg tgacaaatcc aacccttcct cgtcgggcct aacgacgcgg 3061 aagggttttt ttatatcgac tttgtaatag gagtccatcc atgagcacct taggtcatca 3121 atacgataac tcactggttt cca8tgcctt tggtttttta cgcctgccga tgaacttcca 3181 gccgtatgac agcgatgcag actgggtgat tactggcgtg ccgttcgata tggcca ***因此已详细描述本发明的优选实施方案，应当理解由上述段落定义的本发明并 不限于上文说明书中阐述的具体细节，因为其许多显而易见的变化是可能的，无需背离 本发明的精神或范围。