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1、10申请公布号CN102020701A43申请公布日20110420CN102020701ACN102020701A21申请号201010540985922申请日20101112C07K7/0820060171申请人重庆大学地址400044重庆市沙坪坝区沙正街174号72发明人梁桂兆苗霞马秀岩赵军郑洁李元朝杨力54发明名称一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽57摘要本发明公开了一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端AWLPETPLHWKHAG羧基端。本肽序列是基于肽的定量结构功能关系模型设计，经表面等离子共振技术检测得到。它对流感A型H1N1病毒血凝素蛋。
2、白具有高亲和能力，可用于抑制流感A型H1N1病毒血凝素蛋白活性，进一步开发为抗流感A型H1N1病毒药物。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102020715A1/1页21一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端AWLPETPLHWKHAG羧基端。权利要求书CN102020701ACN102020715A1/5页3一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽技术领域0001本发明涉及一种流感病毒血凝素蛋白亲和肽，特别是一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽。背景技术0002A甲型流感正在严重影响公共健康，A型。
3、流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。1918年的H1N1型西班牙流感，1957年的H2N2亚洲流感，1968年的香港H3N2流感，已夺取世界几千万人的生命DASETAL，NATSTRUCTMOLBIOL2010，17530。另外，目前仍在出现的H5N1病毒禽流感病毒，虽未在人与人之间有效的传播，但在人类中表现出高致病性。自2009年4月，一种新的H1N1流感猪流感已蔓延全球，至2010年8月6日，该流感病毒已致至少18449人死亡HTTP/WWWWHOINT/CSR/DON/2010_08_06/EN/INDEXHTML。这种病毒来自于北美和欧亚猪毒株的重组，猪流感的H1亚型的血凝。
4、素HA蛋白显著不同于最近季节性的流感A型病毒的H1亚型的HA。所以，大多数人缺少对这种病毒的免疫保护，因此导致流感大流行。0003疫苗接种是预防流感病毒传染的理想方法。抗病毒药物也已被用于预防和治疗季节性流感。但因为足够、快速地生产一种有效的疫苗是很困难的COUZINFRANKEL，SCIENCE2009，324，705，因此在快速传播流行的起初，抗病毒药物显得特别重要。流感A型病毒膜包括3种蛋白，血凝素HA，神经氨酸酶NA以及质子通道M2。在病毒感染的起初阶段，HA负责唾液酸受体亲，病毒吸收进入内涵体ENDOSOME之后，通过其构象的变化诱使病毒与细胞的融合。M2运输质子进入内涵体中正在感染。
5、的病毒，在酸性条件下，基质蛋白M1从基因转录酶复合体中分离出，以便于膜融合之后，未被包裹的复合体被运输到细胞核。在感染的末期，NA从病毒和细胞复合糖裂解唾液酸，以确保来自被感染细胞的、新的病毒释放。0004M2蛋白和NA已作为药靶用于抗A型流感，以M2蛋白为靶点的药物包括金刚胺及其衍生物，以NA为靶点的NA抑制剂，包括ZANAMIVIR和OSELTAMIVIR，然而，许多流感A型毒株已经对金刚胺或OSELTAMIVIR表现出抗性HTTP/WWWWHOINT/CSR/DISEASE/INFLUENZA/H1N1_TABLE/EN/INDEXHTML。因此，针对新的药靶研发新的抗病毒药物则显得特别。
6、重要。HA蛋白抗病毒药物潜在的药靶，因为其在病毒感染的最初阶段的作用受体亲和与病毒与细胞膜的融合RUPERT，ETAL，PNAS，2008，105，17736。同时，抑制病毒进入细胞是最有前景的策略，HA识别宿主细胞表面的唾液酸受体，这是病毒感染过程的第一步WILEY，ETAL，ANNUREVBIOCHEM1987，56，365，因此，HA抑制剂对于抗流感具有潜在的应用开发前景。目前，许多研究报道含唾液酸的聚合物可以有效的抑制流感病毒进入宿主细胞。肽可有效地抑制HA与唾液酸糖蛋白的相互作用MATSUBARA，ETAL，JMEDCHEM2010，534441。因此，设计有效的肽抑制剂则显得尤为重。
7、要。说明书CN102020701ACN102020715A2/5页4发明内容0005有鉴于此，为了解决上述问题，本发明提供了一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽，可进一步开发为抗流感A型H1N1病毒药物。0006本发明的目的是这样实现的它的氨基酸序列为氨基端AWLPETPLHWKHAG羧基端。0007本发明的一种流感A型H1N1病毒血凝素蛋白亲和肽，选取一组经过噬菌体肽库展示技术获得的、含有15个氨基酸残基的肽样本，经过肽定量构效关系建模技术设计具有高亲和力的流感A型H1N1病毒HA蛋白亲和肽，经过表面等离子体共振技术检测肽与HA的亲和力，依此方法找到了本发明所述的氨基酸序列，即氨基端AW。
8、LPETPLHWKHAG羧基端。0008本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书，权利要求书来实现和获得。0009合成本发明所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如下方法制成的0010采用标准FMOC方案，起始选用00125MMOL，PSC树脂ABI公司生产，批号A5F013，按照权利要求1所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸的用量为01MMOL，各种氨基酸保护基团是各氨基酸的ALPHA氨基P。
9、MOC保护，其余侧链保护基团，ARGMTR，TYRTBU，THRTBU，ASPOTBU，对于生物素基和十八酰基团的修饰，FMOCLYSBIOTINOH和十八酸分别连接到肽的C末端和N末端。每步缩合都加入HOBT/DCC活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20六氢吡啶的NMP溶液去除FMOC保护基，肽侧链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸075G，酒石酸乙二胺EDT025ML，苯硫基甲烷05ML，去离子水05ML，三氟乙酸10ML。在室温条件下持续搅拌，反应时间为45小时，把肽链从树枝上裂解下来，同时去除多种保护基团。将混合液经。
10、4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂和保护集团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至12ML，加乙醚50ML，使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI431A固相自动肽合成仪中完成。所合成肽经过RPHPLC纯化，纯度达到95，并经TOFMS鉴定结构。0011用表面等离子体共振技术测定上述所合成肽与流感A型H1N1病毒HA蛋白的亲和力。具体实施方式0012以下对采用本发明的方法用于流感A型H1N1病毒HA蛋白亲和肽的设计和鉴定为例进行详细的描述，包括以下步骤0013A肽的定量构效关系建模；0014A1肽结构表征；从文献MATSUBARAET。
11、LA，JMEDCHEM2010，5344414449选择57个肽样本，每个肽含有15个氨基酸残基。为了合理表征这些肽的结构特征，精说明书CN102020701ACN102020715A3/5页5选20种天然氨基酸的335种性质参数，这些变量表征氨基酸的如下性质，A螺旋与转角倾向性质；倾向性质；物理化学性质；构成特征及其它特性等。用因子分析法处理精选得到的变量，通过斜交旋转，并用主成分法提取6个因子，这6个因子解释了原始变量8347的信息，参见表1；0015对6个因子进行载荷分析发现，每个因子都具有较明显的物理化学意义，涉及序列的疏水性、A螺旋与转角倾向、体积性质、构成特征、局部柔性及静电性质。。
12、进一步计算各因子得分，见表1，为方便，称此6个因子得分矢量为氨基酸广义信息因子分析标度，该表征体系综合了335个原始氨基酸性质参数大部分信息，可将其用于肽或蛋白质结构表征。肽序列中的每个氨基酸残基用6个氨基酸广义信息因子分析标度表征，对于每个15肽序列，则可用156个90个变量表征。0016表120种天然氨基酸的335个性质参数的6个因子得分001700180019A20种天然氨基酸用常规的单个英文字母表示。0020A2用逐步多元回归建立肽的定量构效关系模型；0021用逐步方法挑选参数，以偏F检验对应的F值为依据，当F值大于384时，则说明书CN102020701ACN102020715A4/。
13、5页6该变量留在模型中，当该变量对应F值小于271时，则剔除该变量，经过留一法交互验证模型的预测能力，最后得到一个6变量模型，如下Y02500193X90168X260847X4101212X460236X570319X81M10022复相关系数R为0715，标准差SD为0223，留一法交互验证的Q为0608，B肽的设计；0023根据M1模型，X9为第2残基的体积特征，X26为第5残基的A螺旋与转角倾向特征，X41为第7残基的局部柔性，X46为第8残基的构成特征，X57为第10残基的体积特征，X81为第14残基的体积性质。以57个肽样本中具有最高亲和性的肽为模板，该肽的氨基酸序列为氨基端ARL。
14、PRTLVHPKHAQA羧基端。根据模型M1设计10个具有更高亲和性的肽，参见表2。0024表2根据模型M1设计的10个具有高亲和力的肽002500260027A根据模型M1预测的相对亲和量，以肽序列的相对亲和量为1000为参考标准，该肽的氨基酸序列为氨基端ARLPRTMVHPKPAQP羧基端。0028B肽与流感A型H1N1的HA蛋白的亲和力用表明等离子体共振测定，单位NG/CM2。0029C肽的合成；0030在ABI431A固相自动肽合成仪中合成肽。具体过程如下采用标准FMOC方案，起始选用00125MMOL，PSC树脂ABI公司生产，批号A5F013，按照权利要求1所述的序列特征，使肽链从。
15、C端逐个向N端延伸，各氨基酸的用量为01MMOL，各种氨基酸保护基团是各氨基酸的ALPHA氨基PMOC保护，其余侧链保护基团，ARGMTR，TYRTBU，THRTBU，ASPOTBU，对于生物素基和十八酰基团的修饰，FMOCLYSBIOTINOH和十八酸分别连接到肽的C末端和N末端。每步缩合都加入HOBT/DCC活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20六氢吡啶的NMP溶液去除FMOC保护基，肽侧链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的说明书CN102020701ACN102020715A5/5页7的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸075G，酒石酸乙二胺EDT02。
16、5ML，苯硫基甲烷05ML，去离子水05ML，三氟乙酸10ML。在室温条件下持续搅拌，反应时间为45小时，把肽链从树枝上裂解下来，同时去除多种保护基团。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂和保护集团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至12ML，加乙醚50ML，使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽产品。所合成肽经过RPHPLC纯化，纯度达到95，并经TOFMS鉴定结构。0031D肽与流感A型H1N1病毒的HA亲和力的测定；0032从美国阿克伦大学生物系DAVIDOLIVER教授课题组获得流感A型H1N1病毒A/NEWCALEDONIA/20/99H1。
17、N1的HA蛋白，用表面等离子体共振技术测定上述所合成肽与HA的亲和力。具体过程与参数如下用基于BIACOREX生物传感系统BIACOREINTERNATIONAL的SPR分析测定肽与HA亲和性。根据EDC/NHS活化程序，选择响应值大约11000RU，将HA在500G/ML，PH47的醋酸盐缓冲液中固定在一个CM5的传感芯片BR100014上。HBSEP缓冲液10MM的HEPES、150MM的NACL、34MM的EDTA、0005的吐温20，PH74作为运行缓冲液。HA固定后，以5L/MIN的流速将HBSEP缓冲液连续注射到芯片上，持续60MIN。在25下，肽溶液分别在0，50，100和200M得HBSEP缓冲液中连续以流速1L/MIN注射5MIN，然后HBSEP缓冲液单独注射3MIN。所得波长位移结果见表2。由表2可以看出，序号为1的肽具有最大的波长变化，表明该肽与HA的亲和力最强，为7225NG/CM2。该肽的氨基酸序列为氨基端AWLPETPLHWKHAGA羧基端。0033以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。说明书CN102020701A。