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1、10申请公布号CN102002469A43申请公布日20110406CN102002469ACN102002469A21申请号201010295552122申请日20100928CGMCC407420100804C12N1/20200601C12P17/16200601C12R1/4320060171申请人嘉兴学院地址314001浙江省嘉兴市越秀南路56号72发明人刘晓侠陈晓丽胡星夏54发明名称生产灵菌红素的菌株及其方法57摘要一种生产灵菌红素的菌株，属于粘质沙雷氏菌，保藏号为CGMCC4074。使用本发明菌株，可在液态发酵培养基中高效合成红色素，生产效率较高。本发明的菌株对碳源和氮源要求较低。
2、，碳源可以是单一碳源或是混合碳源，氮源可以是单一氮源或是混合氮源。本菌株连续传代10代以上，遗传稳定性好，操作简单。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页CN102002479A1/1页21一种生产灵菌红素的菌株，保藏号为CGMCC4074。2根据权利要求1所述的生产灵菌红素的菌株，其特征是所述菌株所成的菌落呈红色，不透明，菌体为0510M0812M。3一种发酵生产灵菌红素的方法，包括如下步骤1菌种培养将权利要求1所述菌株在LB固体培养基于2540恒温培养；2种子液的制备将步骤1固体培养基上的单菌落接入装有液体培养基的容器中，装液。
3、量为容器体积1/31/4，于2040下恒温培养1024小时，转速为150220RPM；3摇瓶液体发酵将步骤2种子液转入灭菌后的液体发酵培养中，接种量为110V/V，装液量50ML/250ML摇瓶，于2838恒温培养4872H，转速150220RMP；4提取灵菌红素。4根据权利要求3所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述提取灵菌红素的方法为把所述步骤3的发酵液离心处理，上清液加等体积的乙酸乙酯萃取，振荡20MIN，静置30MIN分层，8000RPM离心10MIN，收集上相乙酸乙酯，发酵液离心残渣加与原发酵液等体积的丙酮，振荡10MIN，静置10MIN，8000RPM离心10MIN，残渣继续用。
4、丙酮反复抽提3次，所得上相与乙酸乙酯相混合，经旋转蒸发浓缩，得到红色素灵菌红素粗品。5根据权利要求3所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的液体培养基的组成，以重量体积百分比计，甘油0120，蛋白胨0812，酵母粉0510，NACL1020，PH值为5090。6根据权利要求3所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，碳源110，氮源053，氨基酸0044，NACL05，MGCL200101，PH值为5090。7根据权利要求6所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的碳源为甘油、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、豆油和芝麻油之一种或几种。8根据权利要求6所。
5、述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、芝麻粉、花生粉、NH42SO4和硝酸盐之一种或几种。9根据权利要求6所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的氮源含量为052。10根据权利要求6所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的氨基酸为甘氨酸、脯氨酸或天冬氨酸。11根据权利要求10所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的甘氨酸含量为0204。12根据权利要求10所述的发酵生产灵菌红素的方法，其特征是所述的脯氨酸或所述的天冬氨酸含量为00402。权利要求书CN102002469ACN102002479A1/6页3生产灵菌红素的菌株及其方法技术领域0。
6、001本发明涉及一种沙雷氏菌及其用途，尤其涉及一种生产灵菌红素的沙雷氏菌株及其方法。背景技术0002灵菌红素PRODIGIOSINS具有以下所示的结构00030004其是由多种微生物产生的一类具有重要生物活性的次级代谢产物。通常含有3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构。它具有抗细菌、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物和自身免疫抑制活性如可抑制迟发型超敏反应和器官移植后的宿主排斥反应等生物活性。近年来发现灵菌红素在极低的浓度下十亿分之一的浓度，能快速杀死导致赤潮的大部分浮游生物，在水体污染的治理方面显示出巨大的威力。研究还发现灵菌红素在对肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种人癌细胞有抗性作用，在相同的作用剂量下，。
7、对正常细胞无任何毒害作用。另外灵菌红素还可诱导癌细胞的凋亡。因此，灵菌红素成为一种极具发展潜力的抗癌新药。0005灵菌红素制备方法主要包括化学合成法，从二十世纪六十年代，就有关于灵菌红素化学合成的报道，后来研究者陆续报道了不同工艺路线，并合成了一系列新的灵菌红素类似物。化学合成主要以研究其分子结构开拓其衍生物为主，产量产率都较低，且对环境有较大的污染。0006由于生物法合成灵菌红素具有对环境友好、过程易控制，成本低，易于工业化等优点，备受关注。至今发现的灵菌红素产生菌主要集中在粘质沙雷氏菌的不同菌株，包括SERRATIAMARCESCENSNIMA，SERRATIAMARCESCENSR2，S。
8、ERRATIAMARCESCENSW0206B20，SERRATIAMARCESCENSRZ21，但菌株不同，灵菌红素合成能力差别很大，总体产量较低。专利CN101392227A中公开了一种内生菌粘质沙雷氏菌，所产含红色素产量为785G/L，发酵时间为5天。0007由于灵菌红素在医药、食品添加剂、水体污染治理、生态染料等领域具有广阔的应用前景。因此，筛选一株灵菌红素高产菌株具有非常重要的意义。发明内容0008本发明的一个目的在于提供一种粘质沙雷氏菌，其可在低成本的液体培养基中高效合成灵菌红素，且方法简单，可操作性强。0009本发明的另一个目的在于提供一种用粘质沙雷氏菌菌株生产灵菌红素的方法。0。
9、010本发明所述的一种产灵菌红素的菌株，其特征在于所述的菌株为SERRATIA说明书CN102002469ACN102002479A2/6页4MARCESCENS，为粘质沙雷氏菌，保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC4074。0011本发明提供的菌株在LB固体培养基上37培养24H，菌落呈红色，不透明，表面凸起，湿润，较粘稠，易挑起，边缘不规则。利用透射电镜观察，周生鞭毛，无荚膜，无芽孢，大小为0510M0812M。生理生化特征见表1。0012表1菌株SMARCESCENS的生理生化特征00130014注“”代表阳性，“”代表阴性。0015对该菌株16SRNA基因进行测序，并将。
10、所测的序列登录到GENBANK中，序列号为FJ919562。将所得到的序列用BLAST软件和GENBANK中已有的16SRDNA序列进行同源性比较，利用软件MEGA40构建进化树，结果显示本发明菌株与PSEUDOMONASFLUORESCENSEU543578和SERRATIASPSB16SEU816383聚为一支，序列相似性均为99，结果见图1。综合形态观察、生理生化鉴定以及16SRDNA序列分析，最终鉴定为沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌。0016一种发酵生产灵菌红素的方法，包括如下步骤00171菌种培养将粘质沙雷氏菌CGMCC4074的菌种在LB固体培养基于2540恒温培养；00182种子液的制备。
11、将步骤1固体培养基上的单菌落接入装有液体培养基的容器中，装液量为容器体积1/31/4，于2040下恒温培养1024小时，转速为150220RPM。00193摇瓶液体发酵将步骤2种子液转入灭菌后的液体发酵培养中，接种量为110V/V，装液量50ML/250ML摇瓶，于2838恒温培养4872H，转速150220RMP。00204提取灵菌红素步骤3的发酵液离心处理，上清液加等体积的乙酸乙酯萃取，振荡20MIN，静置30MIN分层，8000RPM离心10MIN，收集上相乙酸乙酯，发酵液离心残渣加与原发酵液等体积的丙酮，振荡10MIN，静置10MIN，8000RPM离心10MIN，残渣继续用丙酮反复说。
12、明书CN102002469ACN102002479A3/6页5抽提3次，所得上相与乙酸乙酯相混合，经旋转蒸发浓缩，得到红色素灵菌红素粗品。0021步骤1制得的菌种培养液在使用前可置于24短期保藏。所使用的LB固体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是G/100ML，其中蛋白胨0615、酵母粉05105、NACL1020，PH值为5090。0022步骤2中的液体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位G/100ML，其中甘油0120，蛋白胨0812，酵母粉0510，NACL1020，PH值为5090。0023步骤3中的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，单位G/100ML，其中碳源110，氮源。
13、053，氨基酸0044，NACL05，MGCL200101，PH值为5090。0024碳源优选甘油、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、豆油和芝麻油之一种或几种。0025氮源优选蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、芝麻粉、花生粉、NH42SO4和硝酸盐之一种或几种，其含量优选052。0026氨基酸优选甘氨酸、脯氨酸或天冬氨酸，更优选甘氨酸24，脯氨酸或天冬氨酸含量00402。0027本发明所提供的粘质沙雷氏菌菌株在用于灵菌红素生产时，具有以下优点00281本发明使用的粘质沙雷氏菌菌株，可在液态发酵培养基中高效合成红色素，生产效率较高。本发明的菌株在250ML的摇瓶中，发酵周期3660H，红色素产量可达91。
14、0G/L。00292本发明的菌株对碳源和氮源要求较低，碳源可以是单一碳源或是混合碳源，氮源可以是单一氮源或是混合氮源。00303本菌株遗传稳定性好。该菌株操作简单，连续传代10代以上，红色素灵菌红素的合成能力基本不变。具体实施方式0031以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅供说明具体方法，该方法的其规模不受实施例的限制。0032实施例1灵菌红素的制取0033将粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESCENS的菌种CGMCC4074在LB固体培养基划线于2540恒温培养，然后于24短期保藏所述固体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是G/100ML，其中蛋白胨10、酵母粉05、NACL。
15、10，琼脂粉20，PH值为65。0034将上述活化的单菌落接入装有液体培养基的250ML的三角瓶中，装液量50ML/250ML摇瓶，与37下恒温培养12H，转速为180RPM；所述液体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位G/100ML，其中蛋白胨10、酵母粉05、NACL10，PH值为65。0035将种子液转入灭菌后的液体发酵培养中，接种量为1，装液量50ML/250ML摇瓶，于28恒温培养48H，转速180RPM；所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，单位G/100ML，其中甘油20，蛋白胨13，NACL050，PH值为65。0036发酵液离心处理，上清液加等体积的乙酸乙酯萃取，振荡。
16、20MIN，静置30MIN分层，8000RPM离心10MIN，收集上相乙酸乙酯。发酵液离心残渣加与原发酵液等体积的丙酮，振荡10MIN，静置10MIN，8000RPM离心10MIN，残渣继续用丙酮反复抽提3次，所得上相与乙酸说明书CN102002469ACN102002479A4/6页6乙酯相混合，经旋转蒸发浓缩，得到红色素灵菌红素粗品。0037获得粗品经过液质分析，采用的仪器和条件分别为WATERSZMD4000液质联用仪；色谱柱LICHROSPHERC18COLUMN416MM250MM，流动相80甲醇和20的10MMOL/L甲酸铵溶液，体积流量03ML/MIN，柱温30；MS条件ESI2。
17、MS锥孔电压60V，毛细管电压3188KV，离子源温度120，脱溶剂温度300。0038上述得到红色素样品用液质联用分析，结果见图2。在ESI图谱中有M/Z32426MH，据此判断该色素的相对分子质量为32326。通过LC/MS还可以得到离子碎片M/Z309、M/Z292、M/Z267、M/Z252、M/Z236、M/Z161和M/Z149等，与灵菌红素标准品的质谱图及文献记载的灵菌红素碎片数据一致JBACTERIOL，1974，118，756757；MICROBIOBIOTECH，2000，2，251257。0039实施例2素灵菌红素的PLACTETBURMAN实验优化0040根据经验和文献。
18、，选取其中较重要的9个因素进行PLACTETBURMAN实验。PLACKETTBURMAN实验中各因素及水平见表2，PLACTETBURMAN实验具体实验设计见表3。0041表2PLACKETTBURMAN实验涉及的因素和水平00420043表3PLACKETTBURMAN实验的设计0044说明书CN102002469ACN102002479A5/6页70045按实施例1制备种子液，并按接种量5将种子培养基接种到上述发酵培养基中，28恒温培养48H，转速180RPM。发酵结束后按实施例1，红色素灵菌红素的测定方法，检测灵菌红素的含量，实验数据通过DESIGNEXPERT70计算得出，实验结果如表4所示，处理结果如表5所示。模型显著P00256具有统计学意义。0046表4PLACKETTBURMAN实验结果00470048表5PLACKETTBURMAN实验处理说明书CN102002469ACN102002479A6/6页800490050由分析结果可知影响灵菌红素产量主要因素为蛋白胨含量及NACL的含量，从表5中可以看出在降低NACL浓度及提高蛋白胨浓度后灵菌红素产量达到了910G/L。说明书CN102002469A。