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1、(10)授权公告号 CN 101139556 B (45)授权公告日 2011.05.11 CN 101139556 B *CN101139556B* (21)申请号 200710045081.7 (22)申请日 2007.08.21 C12N 1/19(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 9/46(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (73)专利权人 华东理工大学 地址 200237 上海市梅陇路 130 号 (72)发明人 周祥山 张元兴 陈琳 范卫民 陆建 江希 (74)专利代理机构 上海智信专利。
2、代理有限公司 31002 代理人 王洁 李洪淼等 . 毕赤酵母高密度发酵研究进 展 . 生物技术通讯 16 2.2005,16(2),210-212. Kang et al.Cloning and characterization of a dextranase gene fromLipomyces Starkeyi and its expression in Saccharomycescerevisiae.Yeast22 15.2005,22(15),1239-1248. Kang et al.Cloning and characterization of a dextranase gene。
3、 fromLipomyces Starkeyi and its expression in Saccharomycescerevisiae.Yeast22 15.2005,22(15),1239-1248. 邬小兵等 . 影响毕赤酵母高效表达外源蛋白 的因素 . 生物技术 12 4.2002,12(4),45-46. Roca et al.Cloning of the Penicillium minioluteum geneencodingdextranase and its expression in Pichia pastoris.Yeast12 12.1996,12(12),1187-1。
4、200. (54) 发明名称 重组 - 葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及 相关表达载体和菌株 (57) 摘要 本发明提供了一种重组 - 葡聚糖酶融合蛋 白高效生产方法， 通过 PCR 方法获得编码油脂酵 母-葡聚糖酶的基因序列， 将其构建入带有His Tag 标签的毕赤酵母分泌表达载体， 并转化毕赤 酵母获得高表达菌株， 通过优化的高密度发酵和 纯化工艺， 获得了高纯度的带有His Tag的-葡 聚糖酶融合蛋白， 其具有高度的 - 葡聚糖酶活。 该方法工艺简便、 高分泌表达 - 葡聚糖酶融合 蛋白， 获得的 - 葡聚糖酶融合蛋白纯度高、 活性 好、 生产成本低。 (51)Int.Cl. (56)。
5、对比文件 审查员 张丽华 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 17 页 附图 4 页 CN 101139556 B1/1 页 2 1.一种高效生产-葡聚糖酶融合蛋白的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： a.在适合 的表达条件下， 培养一酵母工程细胞， 所述酵母工程细胞整合有内含编码所述 - 葡聚糖 酶融合蛋白的核苷酸序列的酵母分泌表达载体， 所述核苷酸序列编码的蛋白是 SEQ ID NO ： 6 所示的氨基酸序列， 从而分泌表达出所述 - 葡聚糖酶融合蛋白 ； b. 步骤 a 获得的发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液， 通过 S。
6、P-sephrose 阳离子交换和 Ni 亲和层析， 即可获得纯度在 95以上的纯品， 从而分离纯化 出表达的所述 - 葡聚糖酶融合蛋白。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞， 所 述核苷酸序列是SEQ ID NO ： 5所示核苷酸序列， 所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了 所述核苷酸序列的 pdex-9k-His。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述表达条件为 ： 分为培养阶段和诱导阶 段， 溶氧维持在30， 温度保持在2528， 培养阶段培养至发酵罐中甘油基本耗尽时， 流 加 50甘油， 持续 6 小时， 进入诱。
7、导阶段， 流加 100甲醇诱导， 甲醇终浓度在 1 2， 诱 导 pH 为 6.0。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述 SP-sephrose 阳离子交换的缓冲液的 pH 值为 4.0， 所述 Ni 亲和层析的缓冲液的 pH 值为 6.5。 权 利 要 求 书 CN 101139556 B1/17 页 3 重组 - 葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体 和菌株 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术领域， 更具体地， 涉及 - 葡聚糖酶的生产方法， 特别是 指一种重组 - 葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法， 及相关表达载体和菌株。 背景技术 0002 根据国际生物化。
8、学与分子生物学命名委员会， 葡聚糖酶分为 5 类 ： 葡聚糖酶 (EC3.2.1.11)， 葡聚糖 -1， 6-D- 葡糖苷酶 (EC3.2.1.70)， 葡聚糖 -1， 6-D- 异麦芽糖 酶 (EC3.2.1.94)， 葡聚糖 -1， 6-D- 异麦芽三糖酶 (EC3.2.1.95) 和支链 - 葡聚糖外切 1， 2- 糖苷酶 (EC3.2.1.115)。 0003 很多真菌， 如曲霉、 薄毛壳酶、 镰刀酶、 油脂酵母、 拟青霉、 和青霉类等都可以产生 葡聚糖酶。它们产生的这些酶均为内葡聚糖酶， 特异地作用于葡聚糖内 -(1 6)- 键， 作用后主要生成异麦芽糖或异麦芽三糖。已有报道， 许。
9、多细菌链球菌、 假单胞菌、 大环杆 菌等也可以产生胞外葡聚糖内切酶。如球形节杆菌产生异麦芽糖葡聚糖酶， 这是一种可 以从葡聚糖和寡糖的非还原末端连续的释放出异麦芽糖的外葡聚糖酶。该酶不仅能够识 别 -(1 6)- 糖苷键， 还能识别 -(1 2)-、 -(1 3)- 和 -(1 4)- 糖苷键。同 时，一 些 Bacteroides oralis IG、 Arthrobacter globiforms I-42、 Pseudomonassp.、 Streptococcus mitis 也能产生外切葡聚糖酶。 0004 由于蔗糖是形成葡聚糖的天然底物， 所以在含糖食品的生产中， 葡聚糖污染是一 。
10、个很大的问题。因为葡聚糖会阻塞过滤装置而防碍糖特别是甘蔗的结晶。当原液中葡聚糖 含量低至如 75mg/L 时， 过滤效率仍能降低 50左右。目前， 工业上已成功用细丽毛壳霉和 青霉菌生产的葡聚糖酶来解决糖加工过程中的葡聚糖污染问题， 含量为 10ppm/50L 的葡聚 糖酶就能使过滤效率恢复到 90的正常水平。 0005 此外， 葡聚糖酶在牙齿保健方面也具有重要的应用价值， 它能有效地阻止牙菌斑 的形成， 从而达到防治包括蛀牙、 牙龈炎和牙周炎等多种口腔疾病的功效。M.Marotta 的研 究表明， 商业用酶 Dextranase50L 在浓度为 3.7510-2-1.510-1U/L 范围内。
11、能有效的抑制 口腔中葡聚糖的合成同时抑制蔗糖的黏附， 对消除早期形成的由蔗糖沉积引起的生物膜起 到了良好的预防效果。 0006 我国对葡聚糖酶的需求潜力很大， 但目前产量较低， 且酶种数量较少。迄今为止， 达到生产规模的酶制剂只有 - 淀粉酶、 糖化酶和碱性蛋白酶， 所以需要加大投入和研究 开发。 这些研究的成功将促进葡聚糖酶在酒精、 发酵、 饲料、 制糖等产业的广泛应用， 因而具 有广阔的开发应用前景。 0007 目前， 国际上商业用葡聚糖酶大多来源于青霉菌 (Penicillium minioluteum) 和 Chaetomiunm sp.， 而油脂酵母是一种产子囊酵母， 也可以产生葡聚。
12、糖酶。关于油脂酵 母产葡聚糖酶的研究从 1989 年 Koenig D 分离了分子量为 74KDa， 71KDa， 68KDa， 65KDa 的葡聚糖酶开始， 有了一系列的研究。在此基础上， David W 通过添加诱导物 1-O-， 说 明 书 CN 101139556 B2/17 页 4 Methyl-glucopyranoside 在发酵 12h 后达到最大的酶活。1993 年 Day， Donal F， KimD 利 用 Lipomyces starkeyi ATCC74054 和 Leuconostoc mesenteroides 在工业化生产上的联 合培养获得一定分子量的葡聚糖酶并。
13、申报了专利。寥威、 周河治等从土壤中分离出的一株 产葡聚糖酶酶活 31U/ml 的野生菌株 SB12， 经 UV、 60Co、 LiC1 诱变筛选后得到了产葡聚糖酶 高产菌株 SB126， 经优化发酵转速、 pH 值、 温度、 接种量和发酵时间等发酵条件后， 检测酶活 达到70U/ml， 较野生菌株提高了近两倍。 青霉菌葡聚糖酶在毕赤酵母中重组表达， 产量达到 了 3.2g/L。 0008 目前， 关于葡聚糖酶的分离纯化方法主要还是采用盐和 PEG 沉淀、 萃取法和色谱 法等。 Dipak K， Sadhan K等用磷酸钙凝胶色谱从Penicillium lilacinum中分离出了分子 量大。
14、小为 26KDa 的葡聚糖酶。C.V.A.Wynter， M.Chang 等从厌氧细菌 Rt364 中分离了具热 稳定性的葡聚糖酶， 通过硫酸胺沉淀， 离子交换， 疏水层析和分子排阻色谱分离纯化了分子 量大小为 140KDa 的葡聚糖酶。Elvira Khalikova， Petri Susi 等对 Bacillus sp. 分泌的 葡聚糖酶粗酶液用硫酸胺和 PEG 沉淀， 酶活提高了 733 倍， 经过阴离子交换柱和亲和吸附， 总酶产率为 19。 0009 目前关于 - 葡聚糖酶的研究大多集中于从自然界筛选生产葡聚糖酶的菌株， 已 知开放阅读框的 - 葡聚糖酶真菌类共有 7 种， 主要是青霉。
15、菌和曲霉菌， 细菌共有 13 种， 主 要是链球菌和产气杆菌。对 - 葡聚糖酶的纯化步骤都比较复杂， 大多 3 5 步。 发明内容 0010 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足， 提供一种重组 - 葡聚糖酶 融合蛋白高效生产方法以及涉及的表达载体、 菌株， 该方法工艺简便、 高分泌表达 - 葡聚 糖酶融合蛋白， 获得的 - 葡聚糖酶融合蛋白纯度高、 活性好、 生产成本低。 0011 在本发明的第一方面， 提供了一种高效生产 - 葡聚糖酶融合蛋白的方法， 其点 是， 包括以下步骤 ： 0012 a. 在适合的表达条件下， 培养一酵母工程细胞， 所述酵母工程细胞整合有内含编 码所述 - 。
16、葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列的酵母分泌表达载体， 所述核苷酸序列编码的 蛋白包含 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 4 所示的氨基酸序列， 从而分泌表达出所述 - 葡聚 糖酶融合蛋白 ； 0013 b. 分离纯化出表达的所述 - 葡聚糖酶融合蛋白。 0014 所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞， 所述核苷酸序列是 SEQ ID NO:5 所示核 苷酸序列， 所述酵母分泌表达载体是 pPIC9k 中整合了所述核苷酸序列的 pdex-9k-His。 0015 所述步骤 a 的所述表达条件为 ： 分为培养阶段和诱导阶段， 溶氧维持在 30， 温度 保持在 25 28， 培养阶段。
17、培养至发酵罐中甘油基本耗尽时， 流加 50甘油， 持续 6 小时， 进入诱导阶段， 流加 100甲醇诱导， 甲醇终浓度在 1 2， 诱导 pH 为 6.0。 0016 所述步骤 b 包括步骤 ： 0017 (1) 发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液 ； 0018 (2) 通过简单的 SP-sephrose 阳离子交换和 Ni 亲和层析， 即可获得纯度在 95以 上的纯品。 0019 所述SP-sephrose阳离子交换的缓冲液的pH值为4.0， 所述Ni亲和层析的缓冲液 说 明 书 CN 101139556 B3/17 页 5 的 pH 值为 6.5。 0020 在本发明的第二方。
18、面， 提供了一种酵母分泌表达载体， 其特点是， 所述酵母分泌表 达载体含有编码 - 葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列， 所述核苷酸序列编码的蛋白包含 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 4 所示的氨基酸序列。 0021 所述核苷酸序列的编码区包含与 SEQ ID NO ： 1 所示核苷酸序列有 95以上相同 性的序列和与 SEQ ID NO ： 3 所示核苷酸序列有 95以上相同性的序列。 0022 所述的核苷酸序列是 SEQ ID NO ： 5 所示核苷酸序列， 所述酵母分泌表达载体是 pPIC9k 中整合了所述核苷酸序列的 pdex-9k-His。 0023 在本发明的第三。
19、方面， 提供了一种酵母工程细胞， 其特点是， 所述酵母工程细胞整 合有上述的酵母分泌表达载体。 0024 所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞。一般常用 GS115 菌株。 0025 本发明的有益效果如下 ： 0026 1. 本发明通过构建重组毕赤酵母分泌表达载体， 并转化毕赤酵母， 从而高效分泌 表达 - 葡聚糖酶融合蛋白， 表达量高。 0027 2. 由于是分泌表达， 而且在 - 葡聚糖酶的 C 末端融合了 His Tag 标签， 经 SP-sephrose 阳离子交换和 Ni 亲和层析两步纯化即可获得高纯度的 - 葡聚糖酶融合蛋 白， 纯化效率高， 简化了纯化工艺， 减少了纯化的成本。 0。
20、028 3. 同时， 利用毕赤酵母表达 - 葡聚糖酶融合蛋白， 使其糖基化位点能得到正确 的修饰， 比大肠杆菌表达具有更好的优势。 0029 4. 本发明为 - 葡聚糖酶融合蛋白的工业化发酵生产奠定了基础。 附图说明 0030 图 1 为本发明的重组毕赤酵母分泌表达载体的一具体实施例的示意图。 0031 图 2 为图 1 的重组毕赤酵母分泌表达载体转化毕赤酵母后获得的重组毕赤酵母 Mut+/Mut-表型验证图。 0032 图 3 为本发明的高表达重组毕赤酵母菌株的发酵结果。 0033 图 4 表示阳离子交换层析纯化 - 葡聚糖酶融合蛋白的结果。 0034 图 5 表示 Ni 柱亲和层析纯化 -。
21、 葡聚糖酶融合蛋白的结果。 0035 图 6a 为发酵上清液、 阳离子交换层析纯化产物和 Ni 柱亲和层析纯化产物的 SDS-PAGE 蛋白电泳结果。 0036 图 6b 为发酵上清液、 阳离子交换层析纯化产物和 Ni 柱亲和层析纯化产物的蛋白 印迹鉴定结果。 0037 图 7a 表示温度对本发明获得的 - 葡聚糖酶融合蛋白的酶活的影响。 0038 图 7b 表示 pH 值对本发明获得的 - 葡聚糖酶融合蛋白的酶活的影响。 0039 图 7c 表示金属离子和 SDS 对本发明获得的 - 葡聚糖酶融合蛋白的酶活的影响。 具体实施方式 0040 本发明首先构建了 - 葡聚糖酶融合蛋白表达载体 pd。
22、ex-9k-His， 通过电击法 转化毕赤酵母 GS115， 获得重组菌株。摇瓶发酵筛选一株 - 葡聚糖酶融合蛋白的高表 说 明 书 CN 101139556 B4/17 页 6 达重组菌株， 5L 发酵上清液中其 - 葡聚糖酶融合蛋白的表达量可达到 83900U/L。通过 SP-sephrose 阳离子交换柱和 Ni 亲和层析两步纯化， 得到电泳纯 - 葡聚糖酶融合蛋白， 其最终纯化效率达 37.13。对重组酶进行初步酶学性质分析表明， 最适反应 pH 约为 4.5， 最适反应温度约为 30。本发明的 - 葡聚糖酶融合蛋白易于在毕赤酵母中表达， 表达量 高， 成本低， 易于纯化， 并具有良好。
23、的活性。 0041 本发明首先通过 PCR 方法将 6x His Tag 编码序列插入 pPIC9k(Invitrogen， 该 表达载体 pPIC9k 带有一段 Saccharomyces cerevisiae 的分泌信号肽， 使得蛋白质能分 泌到胞外 )， 构建了带有 6x His Tag 编码序列的甲醇毕赤酵母表达载体 pPIC9k-His， 并 设计一对带有酶切位点的特异引物， 从油脂酵母 Lipomyces starkeyi12659TM基因组中 通过 PCR 的方法克隆了编码 - 葡聚糖酶基因序列， 将获得的基因片段产物经过双酶切， 与经同样酶切的毕赤酵母表达载体 pPIC9k-H。
24、is 连接， 将该基因序列插入到 pPIC9k-His 中， 构建了 - 葡聚糖酶融合蛋白表达载体 pdex-9k-His( 当然也可以直接以 PCR 方法引 入 HisTag 构建 - 葡聚糖酶融合蛋白基因序列再将其插入 pPIC9k 中 )， His Tag 有利于 用 Ni 亲和层析的方法来纯化。采用电击法将用 Sac I 线性化的表达载体转入毕赤酵母 GS115(Invitrogen) 中， 获得重组菌株。 0042 将转化后生长在 MGY 板上的重组子， 然后涂于不同浓度的 G418 板， 从高浓度 G418 板上随机挑选重组子进行用 PCR 的方法来验证菌株 Mut+/Mut- 表。
25、型。将 Mut+ 重组子进行 摇瓶发酵， 每 24 小时， 用 DNS 法测酶活。在诱导 72 小时后， 筛选出一株在 48 小时有最高酶 活的菌株 pdex-9k-His7。这样， 通过平板筛选和摇瓶筛选得到了一株高效表达 - 葡聚糖 酶融合蛋白的重组毕赤酵母 pdex-9k-His7。 0043 在 5L 发酵罐上进行了 pdex-9k-His7 的 - 葡聚糖酶融合蛋白表达。分为培养阶 段和诱导阶段， 常规条件培养发酵47小时后， 流加甲醇诱导-葡聚糖酶融合蛋白表达， 保 持甲醇终浓度为 1 2， 此后每 4 小时用 DNS 法检测酶活。当持续出现两个酶活降低点 时， 结束发酵。 004。
26、4 发酵上清经过简单离心或过滤， 再经阳离子交换和 Ni 亲和层析纯化。在蛋白质专 家数据库中提交该蛋白， 得到该蛋白质的等电点为 5.71， 所以将阳离子柱缓冲液 pH 值调节 至 4.0。通过线性梯度洗脱摸索洗脱条件， 最终得到含 0.5mol/L 的 NaCl 洗脱后， 洗脱组分 包含全部的 - 葡聚糖酶活性。Ni 亲和层析的 A 相含有 20mmol/L 的咪唑， 减少了上样液中 杂质的非特异性结合。考虑到咪唑竞争性结合到 Ni 柱上的 pH 值范围， 选择了对酶活性没 有严重抑制的 pH 值 6.5。该步纯化特异性非常强， 唯一的洗脱组分含有全部的 - 葡聚糖 酶活性。本发明通过两步。
27、纯化， 得到了电泳纯的 - 葡聚糖酶融合蛋白， 并经过了 His- 蛋 白印迹鉴定。 0045 为更好的理解本发明的内容， 下面结合具体实施例作进一步说明。 0046 实施例 1 构建重组毕赤酵母表达载体 pdex-9k-His 0047 (1)pPIC9k-His 表达载体构建 0048 根据毕赤酵母表达载体pPIC9k(Invitrogen)的多克隆酶切位点和His4处酶切位 点， 合成一对引物， 其序列如下 ： 上游引物 ( 带有 6 个 His-tag 基因序列 (SEQ ID NO ： 3)， 5 -ATCGCGGCCGCGCATCATCATCATCATCATCATTAATAGAAT。
28、TAATTCG-3 ( 单下划线部分为 Not I 酶切序列， 波浪线部分为 His-tag 基因序列 ) ； 下游引物， 5 -CGGGTCGACAATGTTCGTCAAAATG 说 明 书 CN 101139556 B5/17 页 7 -3 ( 单下划线部分为 SalI 酶切序列 ) ； 以 pPIC9k(Invitrogen) 质粒为模板， 通过如下 PCR 反应扩增得到一个 1979bp 的 DNA 片段 ： 以总体积 50l 进行 PCR 反应， 94变性 5min， 按 94变性 30s， 62退火 30s， 72延伸 2min， 循环 30 次， 最后再 72延伸 7min。1琼。
29、脂糖 凝胶电泳回收所得的PCR反应片段， 经限制性内切酶Not I和SalI双酶切， 用快速连接试剂 盒 (Takara 公司 ) 连接， 克隆入经 Not I 和 Sal I 双酶切的毕赤酵母分泌表达载体 pPIC9k 的 NotI 和 SalI 位点处， 获得带有 His-tag 序列的毕赤酵母表达载体 pPIC9k-His。转化大 肠杆菌 TOP10。经菌落 PCR 挑选出阳性转化子， 并对阳性转化子进行序列测定， 结果表明成 功将 His-tag 克隆入毕赤酵母表达载体 pPIC9k 中。 0049 (2)pdex-9k-His 表达载体构建 0050 根据油脂酵母的 - 葡聚糖酶 (。
30、 简写为 dex) 基因序列 (SEQ ID NO ： 1) 及其编码 的蛋白序列 (SEQ ID NO ： 2) 和毕赤酵母表达载体 pPIC9k-His 的多克隆酶切位点， 合成一 对引物， 其序列如下 ： 上游引物， 5 -GCGCGAATTCATGACATTAATCTACGTG-3 ( 下划线部分为 EcoRI 酶切序列 ) ； 下游引物， 5 -ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTGACCC-3 ( 单下划线部分为 Not I 酶切序列 ) ； 采用 Tiangen 公司酵母基因组提取试剂盒提取油脂酵母 12659TM( 保藏 号为 ATCCLipomyces star。
31、keyiNo.12659TM) 基因组。以油脂酵母 12659TM基因组为模板， 通 过如下 PCR 反应扩增得到一个 1845bp 的 DNA 片段 ： 以总体积 501 进行 PCR 反应， 94变 性5min， 按94变性30s， 56退火30s， 72延伸2min， 循环30次， 最后再72延伸7min。 1琼脂糖凝胶电泳回收所得的 PCR 反应片段， 经限制性内切酶 EcoR I 和 NotI 双酶切， 用 快速连接试剂盒 (Takara 公司 ) 连接， 克隆入经 EcoR I 和 Not I 双酶切的毕赤酵母分泌表 达载体 pPIC9k-His 的 EcoR I 和 Not I 。
32、位点处， 获得带有 His-tag 序列的重组毕赤酵母表 达载体 pdex-9k-His( 如图 1 所示 )， 转化大肠杆菌 TOP10。经菌落 PCR 挑选出阳性转化子， 并对阳性转化子进行序列测定， 结果表明序列正确 (SEQ ID NO ： 5)， 将编码如 SEQ ID NO ： 6 所示氨基酸序列。 0051 实施例 2 高表达重组毕赤酵母菌株的获得 0052 (1) 重组毕赤酵母表达载体 pdex-9k-His 的转化和阳性克隆的筛选 0053 重组毕赤酵母表达载体 pdex-9k-His 经 Sac I 完全酶切线性化后， 电击法转化毕 赤酵母 GS115 菌株 (Invitr。
33、ogen)， 转化在不含组氨酸的基本培养基 MGY 平板上筛选出发生 同源重组的 His+克隆。 0054 利用含有不同浓度的 G418 的 YPD 平板， 可以估测出整合基因组的外源基因的 拷贝数， 其操作方法如下 ： 用 10ml 的无菌水把在 MGY(YNB1.34， 生物素 410-5， 甘油 1.5， 琼脂糖 1.5 ) 平板上的转化子洗脱并悬浮， 轻微振荡后， 稀释适当倍数， 以 105的 细胞浓度分别在含 G418 浓度为 1.0、 2.0、 3.0、 4.0mg/ml 的 YPD 平板上涂布， 随机挑选了 能在含有 3.0、 4.0mg/ml G418 的 YPD 平板上生长的。
34、转化子单菌落， 用 PCR 方法进行 Mut+/ Mut-表型鉴定。以 6 个转化子的基因组为模板 ( 用 Tiangen 公司酵母基因组提取试剂盒 抽提酵母基因组 )， 用 5 -AOX1 引物 (5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ) 和 3 -AOX1 引物 (5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 )， 以总体积 15l 进行 PCR 反应， 94变性 5min， 按 94 变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 2min， 循环 30 次， 最后再 72延伸 7min。1琼脂糖凝胶 电泳检验 PCR 产物。根据葡聚糖酶融合蛋白基因和 AOX 基因。
35、序列大小， Mut+转化子显示出 两条大小分别为 2.2kb 和 2.4kb 的条带 ( 如图 2 所示 )。 说 明 书 CN 101139556 B6/17 页 8 0055 (2) 摇瓶诱导筛选高表达 - 葡聚糖酶融合蛋白菌株 0056 将上述6个转化菌株在20ml MGY培养基(YNB1.34， 甘油1， 生物素410-5) 中， 30过夜培养， 直到菌液浓度 OD600 达到 2 6。将菌液于 50ml 离心管中 4000g， 4离 心5min。 用合适的MM培养基(YNB1.34， 生物素410-5， 甲醇0.5)洗涤一次， 4000g， 4离心 5min， 去上清。用适量的 MM。
36、 培养基将细胞浓度定 OD600 为 1， 然后在 30下培养。 每24小时添加甲醇至终浓度0.5。 每24小时用DNS法测一次酶活， 将48小时表达-葡 聚糖酶最高的重组菌株 pdex-9k-His7 进行 5L 发酵罐发酵。 0057 实施例 3 重组 - 葡聚糖酶融合蛋白的高密度发酵诱导表达 0058 在 5L 发酵罐中加入 3L 发酵基础培养基， 121灭菌 30min， 调节温度至 28， 用 氨水调节 pH 至 6.0， 加入 PTM4.5ml/L， 以 10的接种量接入种子， 发酵过程中溶氧维持在 30。 0059 参见图 3， 发酵分为两个阶段 ： 第一阶段为培养阶段， 为菌体。
37、生长期， 即从接入种 子后， 培养约37小时， 此时菌体已将发酵罐中甘油基本耗尽， 具体表现为pH下降， 溶氧突然 上升。此时流加 50甘油 ( 含有 PTM， 4.5ml/L)， 补料速度为 18ml L-1 h-1， 持续 6 小时， 至 菌体湿重达到 232g/L， 即进入第二阶段。第二阶段为诱导期。此阶段流加 100甲醇 ( 含 有 PTM， 4.5ml/L) 诱导 - 葡聚糖酶融合蛋白表达， 流速从 1mlL-1h-1逐步提高， 用甲醇 电极监测， 维持甲醇终浓度在 1 2， 此后每 4 小时用 DNS 法检测酶活， 当持续出现两个 酶活降低点时， 结束发酵。 在发酵100小时后， 。
38、酶活达到最高点， 为83900U/L， 菌体湿重达到 543g/L。整个发酵时间持续 107 小时， 发酵结束时酶活为 76600U/L。 0060 实施例 4 重组 - 葡聚糖酶融合蛋白的纯化 0061 将发酵液于 4 8000g 离心 20min， 取上清经 0.45m 纤维素膜过滤， 稀释发酵上 清酶活为10.36U/mg， 离子强度为1.5103s/cm。 利用SP-sephrose Fast Flow离子交换层 析柱进行纯化， 其中 A 相缓冲液 ： 20mmol/L 柠檬酸， 20mmol/L NaH2PO4， pH4.0， B 相缓冲液 ： 20mmol/L 柠檬酸， 20mmo。
39、l/L NaH2PO4， NaCl1mol/L， pH4.0。洗脱条件 ： 先用 A 相平衡阳离子 交换柱， 直至 UV280 检测线和电导线回到基线， 然后以 4ml/min 流速， 适当 A 相和 B 相缓冲 液比例洗脱 ( 结果见图 4)。洗脱样品经酶活测定后 ( 酶活为 181.96U/mg)， 过 Ni 亲和层析 柱， 其中 C 相缓冲液 ： 50mmol/L NaH2PO4， 500mmol/LNaCl， 10甘油， 20mmol/L 咪唑， pH6.5， D 相缓冲液 ： 50mmol/L NaH2PO4， 500mmol/LNaCl， 10甘油， 1mol/L 咪唑， pH6.。
40、5。以 2ml/min 流速， 分别用30和50D相梯度洗脱(结果见图5)， 得到电泳纯-葡聚糖酶融合蛋白， 其最终纯化效率达 37.13。洗脱样品进行进一步酶活测定， 测得酶活 188.34U/mg。 0062 实施例 5SDS-PAGE 和 Western Blotting 检测葡聚糖酶融合蛋白 0063 将原发酵液， 阳离子交换柱纯化后样品， Ni 柱纯化后具有葡聚糖酶活性的蛋白样 品进行蛋白电泳， 采用 8 SDS-PAGE 胶， 用考马斯亮蓝 R-250 染色， 结果见图 6a。Western Blotting 在 100V 下湿转 PVDF 膜 3 小时， 4封闭过夜， 小鼠 Hi。
41、s 单克隆抗体 ( 天为时代公 司 ) 孵育 2 小时， 鼠抗辣根过氧化物酶抗体孵育 1 小时， 用 TMB 显色。WesternBlotting 结 果 ( 见图 6b) 表明经 SP 阳离子交换纯化后， 产物基本为葡聚糖酶融合蛋白， 而 Ni 柱纯化后 为特异性的葡聚糖酶融合蛋白条带。 0064 实施例 6 重组葡聚糖酶融合蛋白的最适反应温度、 pH 及金属离子影响的测定 0065 维持 pH4.5， 在不同温度 (10 60 )， 用 DNS 法测定酶活性。测得重组葡聚糖 说 明 书 CN 101139556 B7/17 页 9 酶融合蛋白的最适反应温度为 30 ( 见图 7a)。 00。
42、66 配制不同 pH 值的 20mmol/L 醋酸 - 醋酸钠缓冲液 (pH3.5 4.5)， 20mmol/L 柠檬 酸 - 磷酸二氢钠缓冲液 (pH5.0 7.5)， 20mmol/L 磷酸氢钠 - 磷酸二氢钠缓冲液 (pH8.0 8.5)， 0.5 个 pH 单位为梯度。测定最适反应 pH 值时， 用不同 pH 值的缓冲液分别稀释纯化过 的酶与底物葡聚糖 T-2000， 在维持温度为 37下， 测定酶活。结果表明重组葡聚糖酶融合 蛋白的最适反应 pH 值为 pH4.5( 见图 7b)。 0067 配制 pH 为 4.5， 浓度为 1mmol/L 的金属离子 (AlCl3， CaCl2， 。
43、CoCl2， CuSO4， FeCl3， KCl， MgCl2， NaCl， NiSO4， MnCl2， ZnCl2) 和 1mmol/L 的 SDS 溶液， 与一定酶在 37下保温 3 小时， 然后测定剩余酶活性。测得 Al3+， Cu2+， Fe3+， SDS 能完全抑制葡聚糖酶活性， 而 Mg2+和 Ca2+均能增加酶活， 分别为 1.45 和 1.38 倍 ( 见图 7c)。 0068 综上所述， 本发明的重组 - 葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法工艺简便、 高分泌 表达 - 葡聚糖酶融合蛋白、 获得的 - 葡聚糖酶融合蛋白纯度高、 活性好、 生产成本低。 0069 需要说明的是， 在本发。
44、明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解， 以上所述的是本发明的具体实施例及所 运用的技术原理， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作 各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围， 这些等价形式同样落在本发明的范围内。 0070 序列表 0071 华东理工大学 0072 重组 - 葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株 0073 6 0074 1 0075 1824 0076 DNA 0077 油脂酵母 (Lipomyces starkeyi) 0078 0079 gene 0080 (1).(1824。
45、) 0081 - 葡聚糖酶基因 0082 1 0083 说 明 书 CN 101139556 B8/17 页 10 0084 说 明 书 CN 101139556 B9/17 页 11 0085 2 0086 608 0087 PRT 0088 油脂酵母 (Lipomyces starkeyi) 0089 2 0090 说 明 书 CN 101139556 B10/17 页 12 0091 说 明 书 CN 101139556 B11/17 页 13 0092 说 明 书 CN 101139556 B12/17 页 14 0093 说 明 书 CN 101139556 B13/17 页 15 。
46、0094 3 0095 18 0096 DNA 0097 人工序列 0098 0099 misc_feature 0100 (1).(18) 0101 His Tag 0102 3 0103 0104 4 0105 6 0106 PRT 0107 人工序列 0108 4 0109 0110 5 0111 1851 0112 DNA 0113 人工序列 0114 0115 misc_feature 0116 (1).(1851) 0117 - 葡聚糖酶融合蛋白编码序列 0118 5 0119 0120 说 明 书 CN 101139556 B14/17 页 16 0121 说 明 书 CN 10。
47、1139556 B15/17 页 17 0122 6 0123 617 0124 PRT 0125 人工序列 0126 6 0127 0128 说 明 书 CN 101139556 B16/17 页 18 0129 说 明 书 CN 101139556 B17/17 页 19 说 明 书 CN 101139556 B1/4 页 20 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101139556 B2/4 页 21 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101139556 B3/4 页 22 图 5 图 6a 图 6b 说 明 书 附 图 CN 101139556 B4/4 页 23 图 7a 图 7b 图 7c 说 明 书 附 图 。