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1、(10)申请公布号 CN 101993848 A (43)申请公布日 2011.03.30 CN 101993848 A *CN101993848A* (21)申请号 201010534675.6 (22)申请日 2010.11.08 CGMCC N0. 4011 2010.07.16 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/46(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (71)申请人 淮海工学院 地址 222000 江苏省连云港市新浦区苍梧路 59 号淮海工学院海洋学院王淑军转 (72)发明人 王淑军 吕明生 房耀维 焦豫良 刘姝 曹茜 李瑛 王东 (74)专利代。
2、理机构 南京众联专利代理有限公司 32206 代理人 刘喜莲 (54) 发明名称 海洋低温右旋糖酐酶与产酶方法及其产生菌 S6-2 (57) 摘要 本发明是一种海洋弧菌 S6-2 （Vibriosp. S6-2） CGMCCN0.4011。 该菌株生长温度范围 为 4-37，最适生长温度为 25 ；生长 pH 范 围为 6-11，最适生长 pH 为 7.0 ；生长的 NaCl 浓 度为 0.5%-10%，最适生长的 NaCl 浓度为 4%。 本发明还公开了一种利用弧菌产海洋低温右旋糖 酐酶的方法及按该方法得到的低温右旋糖酐酶产 品。该低温右旋糖酐酶在龋齿防治、制糖工业和 药用右旋糖酐的生产等方。
3、面发挥着重要的作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 9 页 CN 101993852 A1/1 页 2 1. 一种弧菌 S6-2（Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0.4011。 2. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 弧 菌 S6-2（Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0.4011，其 特 征在于 ： 该菌株具有以下特征 ： 弧菌 S6-2 为革兰氏阴性杆状细菌、 无芽孢， 大小约为 1.31-1.58m0.53-0.79m ； 在含有右旋糖酐固。
4、体培养基上的菌落特征 ： 菌落直径 2mm-5mm， 圆形、 乳白色、 湿润、 透明， 菌落长出后加入 95% 乙醇， 冷冻 34h， 菌落周围出现透 明圈 ； 菌株 V-P 试验阴性、 MR 试验阳性， 无氯化钠不能生长， 能液化明胶， 有运动能力 ； 能利 用蔗糖、 果糖， 而不能利用乳糖、 半乳糖、 甘露糖、 木糖醇、 纤维二糖、 阿拉伯糖、 蜜二糖和山 梨醇。 3. 根据权利要求 1 所述弧菌 S6-2（Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0.4011， 其特征在于， 其生长特性为 ： 该菌株生长温度范围为4-37， 生长pH范围为6-11 ； 生长的NaCl浓度范围 为 。
5、0.5-10%。 4. 根据权利要求 1 所述弧菌 S6-2（Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0.4011， 其特征在于， 其生长特性为 ： 该菌株最适生长温度为 25； 最适生长 pH 为 7.0 ； 最适生长的 NaCl 浓度为 4%。 5. 一种如权利要求 1-4 中任何一项所述的弧菌 S6-2 （Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0.4011 产低温右旋糖酐酶的方法， 其特征在于， 其步骤如下 ： 将弧菌 S6-2（vibrio sp. S6-2） 菌株接种到 2216E 培养基中， 转速 180r/min， 装液量 20%， 培养 12h， 得种子液 ；。
6、 将种子 液以 2% 的接种量接种于产酶培养基， 180r/min， 25培养 24h， 10000r/min 离心 5min， 取上 清液经过硫酸铵、 DEAE-sepharose Flat Flow 和 Sephacryl S-200 方法制备低温右旋糖酐 酶。 6. 一种如权利要求 5 所述的方法所产低温右旋糖酐酶， 其特征在于 ： 所述的低温右旋 糖酐酶的理化性质为 ： 酶的适合作用温度为20， 在60保温2h后该酶仍具有50%以上的 活性 ； 右旋糖酐酶在 pH6.0-10.0 范围内稳定， Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Mg2+、 Li2+、 Co3+、 Cu2+、 Zn2+。
7、对酶 有不同程度的抑制作用 ； Al3+对该酶有激活作用 ； SDS、 尿素、 DTT 和 NBS 对该酶有抑制作用。 权 利 要 求 书 CN 101993848 A CN 101993852 A1/6 页 3 海洋低温右旋糖酐酶与产酶方法及其产生菌 S6-2 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物， 特别是一种分离自中国江苏省连云港海域的弧菌 S6-2 （Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0. 4011（已于 2010 年 7 月 16 日保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 CGMCC， 保藏编号为 CGMCC N0. 4011） ； 本发明还涉及该菌株产 。
8、海洋低温右旋糖酐酶的方法及其产品。 背景技术 0002 右 旋 糖 酐 （Dextean） （a homoglycan of D-glucopyranose）是 95% 为 -1,6 糖 酐 键 的 多 糖。 右 旋 糖 酐 酶 （Dextranase,-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase, EC3.2.1.11） ， 又叫 - 葡聚糖酶， 是专一切割右旋糖酐 （Dextean） 中 -1,6 糖酐键的水解 酶。 右旋糖酐酶有很重要的应用价值， 在龋齿防治、 制糖工业和药用右旋糖酐的生产等方面 发挥着越来越重要的作用。右旋糖酐酶在制糖工业中降解多糖聚合物， 降低。
9、多糖的相对分 子质量， 从而降低糖的黏性。 而在口腔疾病研究的领域中， 右旋糖酐酶能有效阻滞唾液糖蛋 白和粘性葡聚糖所组成的口腔牙菌斑形成， 对龋齿和牙周病的防治具有重要的意义。在血 液替代品制造中该酶被用于控制右旋糖酐的水解 ； 并且可以增强抗菌药物的疗效。 0003 目前国内外报道的产生右旋糖酐酶微生物主要为青霉 （Penicillium） 、 斯达油 脂酵母 （Lipomyces starkeyi） 、 对角毛壳菌 （Chaetomium gracile） 、 曲霉 （Aspergillus ustus） 、 芽孢杆菌 （Bacillus） 、 链球菌 （Streptococcus） 均。
10、能产生右旋糖酐酶。 0004 低温酶 (cold-adapted-enzyme)， 是指在低温条件下能有效催化生化反应的一类 酶， 低温酶具有最适温度低， 低温下催化活性高， 高温下容易失活等性质， 在工业生产中可 以节约能源及减少中温菌的污染， 这些催化性质使低温酶在工业生产应用中具有很大的优 势。目前右旋糖酐酶主要分离于口腔、 陆地及温泉， 大部分酶为中温酶， 最适温度大多为 50， 导致右旋糖酐酶在应用时能量消耗大， 成本高。 低温酶主要来源于低温生态环境如海 水、 海底沉积物、 冰川、 高山、 南北极的低温微生物产生， 随着陆地资源的不断开发而面临枯 竭， 近年来人们逐渐将海洋微生物作。
11、为获得低温蛋白酶的新来源。目前国内外对海洋微生 物产右旋糖酐酶的研究尚未见报道。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足， 提供一种新的能产低温右旋 糖酐酶的来自海洋的弧菌 S6-2。 0006 本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述弧菌 S6-2 产低温右旋糖酐酶的方 法及产品。 0007 本发明的特征包括弧菌 S6-2 （Vibrio sp. S6-2） 菌株本身 （以下称菌株 S6-2） ， 以 及利用该菌株产低温右旋糖酐酶的方法， 以及利用该菌株所产的右旋糖酐酶产品。 0008 本发明所涉及的菌株 S6-2 是在中国江苏省连云港海域的海水中分离到的弧菌 S6。
12、-2 （Vibrio sp. S6-2） ， 该弧菌 S6-2 于 2010 年 7 月 16 日保藏在中国微生物菌种保藏管 说 明 书 CN 101993848 A CN 101993852 A2/6 页 4 理委员会普通微生物中心CGMCC， 保藏编号为CGMCC N0. 4011。 保藏单位地址 ： 北京市朝阳 区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所。 0009 以下对本发明进行详细的阐述。 0010 一、 本发明菌株 S6-2 的形态特征与生理生化特征。 0011 1.1 形态特征 ： 菌株 S6-2 为革兰氏阴性杆状细菌、 无芽孢， 大小约为 1.31-1.58m0.53。
13、-0.79m， 参见图 1。在含有右旋糖酐固体培养基上的菌落特征 ： 菌落直径 2mm-5mm， 圆形、 乳白色、 湿 润、 透明， 菌落长出后加入 95% 乙醇， 冷冻 34h， 菌落周围出现透明圈， 参见图 2。 0012 1.2 生理生化特征 : 菌株 S6-2 的生理生化特征以及与其它弧菌的比较见图 3、 4。菌株 S6-2V-P 试验阴性、 MR 试验阳性， 无氯化钠不能生长， 能液化明胶， 有运动能力 ； 能利用蔗糖、 果糖， 而不能利用 乳糖、 半乳糖、 甘露糖、 木糖醇、 纤维二糖、 阿拉伯糖、 蜜二糖、 山梨醇。 通过Bergey s Manual of Systematic。
14、 Bacteriology(second edition)分析比较， 初步判定该菌株S6-2为弧菌属 (Vibri)。 0013 1.3 菌株 S6-2 的分子生物学鉴定 ： 用 Takara 试剂盒提取 DNA 模板， 并于 -40保存。 0014 正向引物 P1 ： 5?-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3?， 反向引物 P2 ： 5?-CGGCTACCTTGTTACGAC-3?。反应体系 50?l， Taq 酶 2U， 反应条件为 95预变性 5min， 94变性 1min， 53退火 30s， 72延伸 90s， 35 个循环， 72延伸 10min。PCR 产物的纯化、 克隆、。
15、 测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增菌株 S6-2 的 16S rDNA， 其长 度为 1500bp。将菌株 S6-2 的 16S rRNA 基因序列提交 GenBank 数据库， 通过 16S rDNA 序列 同源性比较， 可以初步确认该菌为弧菌属 （Vibrio） 。 将亲缘关系较近的菌株16S rDNA应用 MEGA软件进行多重比较， 用中邻接法 （Neibor-joining method） 建系统进化树， 从进化树表 明菌株 S6-2 与Vibrio alginolyticus （HM771350） 亲缘关系最近。参见图 5。 0015 二、 本发明菌株 S6-2 的生。
16、长特性 本发明提供的菌株 S6-2， 对其生长特性进行了细致的研究， 基本摸清不同条件下该菌 的生长情况。 0016 2.1 本发明中涉及的培养基 ： 2216E 培养基 ： 蛋白胨 0.5%， 酵母粉 0.1%， 琼脂 2%， 陈海水配制， pH8。 0017 初筛培养基 ： 蛋白胨 1%， 牛肉膏 0.5%， 右旋糖酐 0.2%， 琼脂 2%， 陈海水配制， pH 8.0 ； 产酶培养基 ： 酵母膏 0.1%， 蛋白胨 0.1%， 右旋糖酐 1%， 陈海水配制， pH 8.0。 0018 微量矿物盐溶液 ( 每升 ) ： CuSO4 5H2O, 0.01g; ZnSO4 7H2O, 0.1。
17、g; CoCl2 6H2O, 0.005g; MnCl2 4H2O, 0.2g; Na2MoO4 2H2O, 0.1g; KBr, 0.05g; KI, 0.05g; H3B03, 0.1g; NaF, 0.05g; LiCl, 0.05g; Al2(SO4)3, 0.05g; NiCl2 6H2O, 0.01g; VoSO4 2H2O, 0.005g; H2WO42H2O, 0.002g; Na2SeO4, 0.005g; SrCl6H2O, 0.005g; BaCl2, 0.005g。 0019 2.2 种子液的制备 ： 将保藏在 2216E 培养基的弧菌 S6-2 接种到 2216E 培。
18、养基中， 转速 180r/min， 装液量 20%， 培养 12h。 0020 2.3 温度对菌株 S6-2 生长的影响 ： 说 明 书 CN 101993848 A CN 101993852 A3/6 页 5 将种子液以 2% 接种量于 2216E 培养基， 转速 180r/min， 装液量 20%， 分别在不同温度下 培养， 每隔一段时间测定细胞浓度， 选择在 600nm 波长下测定 OD 值， 该菌株能够在 4下生 长， 其生长温度范围为 4-37， 最适生长温度为 25， 见图 6。 0021 2.4 pH 对弧菌 S6-2 生长的影响 ： 在 2216E 培养基中加入终浓度为 10m。
19、mol/L 的磷酸 ： 醋酸 ： 硼酸 （1 ： 1 ： 1） 作为缓冲液， 使培养基的 pH 分别为 4.0-11.0 之间， 在 25培养 24 小时， 测定细胞浓度， 生长 pH 范围为 6-11， 最适生长 pH 为 7.0， 见图 7。 0022 2.5 NaCl 对菌株 S6-2 生长的影响 ： 按照 2.2 方法制备种子液， 在 2216E 培养基 （将陈海水改用微量矿物盐溶液代替， 每升 培养基加入 10ml） 中加入 NaCl， 使之为 0% 到 12% 的 NaCl， 在 25培养 24 小时， 测定细胞浓 度， 生长的 NaCl 浓度为 0.5%-10%， 最适生长的 N。
20、aCl 浓度为 4%， 见图 8。 0023 三、 菌株 S6-2 产低温右旋糖酐酶的方法 发明人对弧菌 S6-2（vibrio S6-2） 产低温右旋糖酐酶的产酶条件进行了研究。 0024 3.1 发酵时间对菌株 S6-2 产酶的影响 ： 将种子液接入到产酶培养基中， 在 25、 180r/min 下， 振荡培养 48h， 每 4h 取出测酶活 力及 OD600。在 24h 之前， 产酶量上升速度较快， 到发酵 24h 时 （即菌体生长到稳定期） 产酶 量最高， 随时间增加， 酶活力逐渐下降， 见图 9。 0025 3.2 发酵温度对菌株 S6-2 产酶影响 ： 在不同温度下进行发酵培养， 。
21、结果显示 20-30时右旋糖酐酶产量达到最高， 低于 20、 高于 30的情况下产酶均迅速下降。15和 35时分别只有最高产酶量 13.7% 和 50.3% 的产酶量。低于 20时菌体生长缓慢， 产酶量也相应降低 ； 而温度高于 30后， 菌体 代谢太快， 衰老快， 不利于产酶， 见图 10。 0026 3.3 培养基 pH 对菌株 S6-2 产酶的影响 ： 在不同pH条件下发酵培养24h后测定右旋糖酐酶活力。 实验结果证明随着pH的升高， 酶产量逐渐增加， 当 pH 达到 7.0 时产酶量达到最大 ； pH 继续升高， 酶产量迅速下降。在低 于 pH5.0 或高于 pH10.0 时酶产量均很。
22、低， 见图 11。 0027 3.4 NaCl 浓度对菌株 S6-2 产酶的影响 NaCl浓度对产酶影响不太显著。 起初， 产右旋糖酐酶的量随NaCl浓度的增加而逐渐增 加， 当培养基 NaCl 浓度升至 4% 时， 产右旋糖酐酶最高， 进一步升高 NaCl 浓度则会对菌体生 长和右旋糖酐酶酶活积累产生一定的抑制作用。 0028 3.5 装液量对菌株 S6-2 产酶的影响 ： 摇瓶装液量分别为10%、 15%、 20%、 25%、 30%和40%进行发酵试验， 结果表明， 装液量太少 溶氧过大， 对菌体造成伤害不利于产酶， 装液量太多溶氧太差， 不利于菌体生长， 同样降低 产酶， 结果显示装液。
23、量在 25时产酶最高， 见图 12。 0029 3.6 不同碳氮源对菌株 S6-2 产酶的影响 ： 分别在培养基中添加不同的碳源和氮源进行发酵培养， 发酵 24h 后测定发酵液酶活 力， 结果发现， 在碳源的比较中， 麦芽糖最能促进产酶， 葡萄糖和可溶性淀粉次之， 乳糖、 纤 维素不利于产酶， 培养基中添加不同碳源对产酶的影响较大 ； 不同氮源的发酵结果显示， 酵母膏最有利于产酶， 胰蛋白胨和蛋白胨、 酪蛋白、 玉米粉次之， 无机氮源不利于产酶， 见图 说 明 书 CN 101993848 A CN 101993852 A4/6 页 6 13。本实验证明适当调整培养基中的碳氮源， 可以较高地促。
24、进右旋糖酐酶的产出。 0030 四、 低温右旋糖酐酶的性质 4.1 粗酶液的制备 ： 将弧菌 S6-2（Vibrio sp. S6-2） 菌株接种到 2216E 培养基中， 转速 180r/min， 装液量 20%， 培养 12h， 得种子液 ； 将种子液以 2% 的接种量接种于产酶培养基， 180r/min， 25培养 24h， 10000r/min离心5min， 取上清液经过硫酸铵、 DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200 方法制备低温右旋糖酐酶。 0031 4.2 酶作用温度对酶活性的影响 ： 将右旋糖酐酶置于不同温度下与底物发生反应， 测定酶活。
25、力， 结果见图 14， 酶的最适作 用温度为 20， 5仍有 34% 的酶活力， 在 5 50温度范围时有较高的催化活力。 0032 4.3 酶的热稳定性 ： 取适量酶液分别在不同温度 （20、 30、 40和 60） 下保温 2.5h， 每隔 0.5 到 1h 取 出一组样品， 迅速置于 4冰箱内， 待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活， 以未处 理酶液的酶活设为 100%， 结果见图 15， 在 60保温 2h 后该酶仍具有 50% 以上的活性。 0033 4.4 酶的作用 pH 对酶活性的影响 ： 将酶液与在不同 pH 的 1.0 的右旋糖酐溶液中在 20下进行酶活力测定， 不同 p。
26、H 值 的缓冲液为 ： 50mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH3.0 到 6.0） ； 50mM 磷酸钠缓冲液 （pH 6.0 到 8.0） ； 50mM Tris-盐酸缓冲液 (pH 8.0 to 9.0) ； 50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 （pH9.0到10.0） 。 结果见图 16， pH7.0 该酶的活性最高。 0034 4.5 酶的 pH 稳定性 ： 将 50ul 酶 液 与 150ul 不 同 pH 的 缓 冲 液 混 合，缓 冲 液 为 伯 瑞 坦 - 罗 宾 森 （Britton-Robinson） 缓冲溶液， pH 分别为 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0。
27、、 9.0、 10.0， 在 20水 浴锅中保温1h 取出测定残余酶活， 将未处理酶液的酶活设为100%。 结果见图17， 结果表明 在 20 C 保温下 1h 后， 右旋糖酐酶在 pH6.0-10.0 范围内稳定， 残余酶活力保持在 50% 以 上， 在 pH4.0 有 11.6% 残余酶活。 0035 4.6 金属离子、 化学试剂对酶的作用 ： 将各种金属离子与酶液混合， 使其最终浓度达到1.0 mM、 5.0mM， 然后在20下测酶活， 结果见图 18。将各种化学试剂与酶液混合， 使其达到预定浓度， 测定酶活， 结果见图 19。结 果发现低浓度的 Al3+对右旋糖酐酶有激活作用， 高浓度。
28、的 Al3+会抑制该酶活性。Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Mg2+、 Li2+、 Co3+、 Cu2+、 Zn2+对酶有不同程度的抑制作用。其它金属离子如 ： Ca2+、 Ba2+和 Fe3+对该酶的影响不大。化学试剂 SDS、 尿素、 DTT 和 NBS 对酶有抑制作用。 0036 4.7 右旋糖酐酶活测定。 0037 右旋糖酐酶活测定方法 ： 取 1% 右旋糖酐溶液 100L 加入 100L 酶液， 空白 以 100L 灭活的酶液代之， 20反应 15min， 立即放入冰浴中终止反应， 加入 200L DNS 100煮沸5min， 终止反应并显色， 加入3mL去离子水振荡混匀， 取2。
29、00L于96孔酶标板上 于 520nm 下进行吸光值测定。 0038 酶活力单位定义 ： 上述反应条件下每分钟水解右旋糖酐产生 1g 麦芽糖所需 的酶量， 定义为一个酶活力单位 （U） 。 0039 本发明方法所产低温右旋糖酐酶在龋齿防治、 制糖工业和药用右旋糖酐的生产等 说 明 书 CN 101993848 A CN 101993852 A5/6 页 7 方面发挥着重要的作用。 附图说明 0040 图 1 为菌株 S6-2 形态染色特征 （10100） 。 0041 图 2 为菌株 S6-2 在含右旋糖酐平板上的透明圈。 0042 图 3 为菌株 S6-2 的生理生化特征图表。 0043 图。
30、 4 为菌株 S6-2 理化特征与其它弧菌的比较图表。 0044 图 5 为菌株 S6-2 的 16S rRNA 进化树分析图。 0045 图 6 为温度对菌株 S6-2 生长的影响图。5 （） ， 10 （） ， 15 （） ， 20 （） ， 25（） ， 30（） ， 35（） 。 0046 图 7 为 pH 对菌株 S6-2 生长的影响图。 0047 图 8 为 NaCl 对菌株 S6-2 生长的影响图。 0048 图 9 为时间对菌株 S6-2 生长和产酶的影响图。 0049 图 10 为温度对菌株 S6-2 产酶的影响图。 0050 图 11 为 pH 对菌株 S6-2 产酶的影响。
31、图。 0051 图 12 为装液量对菌株 S6-2 产酶的影响图。 0052 图 13 为碳氮源对菌株 S6-2 产酶的影响图表。 0053 图 14 为温度对酶活性的影响图。 0054 图 15 为温度对酶热稳定性的影响图， 20 （） ， 30 （） ， 40 （） ， 60 （） 。 0055 图 16 为 pH 对酶活力的影响图。 0056 图 17 为 pH 对酶稳定性的影响图。 0057 图 18 为金属离子对酶活力的影响图表。 0058 图 19 为化学试剂对酶活力的影响图表。 0059 本发明弧菌 S6-2（Vibriosp. S6-2） 己于 2010 年 7 月 16 日保。
32、藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC， 保藏编号为CGMCC N0. 4011。 保藏单位地址 ： 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所。 具体实施方式 0060 以下参照附图， 进一步描述本发明的具体技术方案， 以便于本领域的技术人员进 一步地理解本发明， 而不构成对其权利的限制。 0061 实施例 1。一种弧菌 S6-2 （Vibriosp. S6-2） CGMCC N0.4011。该菌株具有以下特 征 ： 菌株为革兰氏阴性杆状细菌、 无芽孢， 大小约为 1.31-1.58m0.53-0.79m ； 在含有 右旋糖酐固体培养基上的菌落特征 ：。
33、 菌落直径 2mm-5mm， 圆形、 乳白色、 湿润、 透明， 菌落长 出后加入95%乙醇， 冷冻34h， 菌落周围出现透明圈 ； 菌株V-P试验阴性、 MR试验阳性， 无氯 化钠不能生长， 能液化明胶， 有运动能力 ； 能利用蔗糖、 果糖， 而不能利用乳糖、 半乳糖、 甘露 糖、 木糖醇、 纤维二糖、 阿拉伯糖、 蜜二糖、 山梨醇。 弧菌S6-2的生长特性为 ： 该菌株生长温 度范围为 4-37， 生长 pH 范围为 6-11 ； 生长的 NaCl 浓度范围为 0.5%-10% ； 该菌株最适生 长温度为 25 ； 最适生长 pH 为 7.0 ； 最适生长的 NaCl 浓度为 4%。 006。
34、2 实施例 2。一种如实施例 1 所述的弧菌 S6-2 CGMCC N0.4011 产低温右旋糖酐酶 说 明 书 CN 101993848 A CN 101993852 A6/6 页 8 的方法， 其步骤如下 ： 将弧菌 S6-2（vibrio sp. S6-2） 菌株接种到 2216E 培养基中， 转速 180r/min， 装液量 20%， 培养 12h， 得种子液 ； 将种子液以 2% 的接种量接种于产酶培养基， 180r/min， 25培养 24h， 10000r/min 离心 5min， 取上清液经过硫酸铵、 DEAE-sepharose Flat Flow 和 Sephacryl S。
35、-200 方法制备低温右旋糖酐酶。 0063 实施例 3。一种如实施例 2 所述的方法所产低温右旋糖酐酶， 该低温右旋糖酐酶 具有以下特征 ： 所述的低温右旋糖酐酶的性质为 ： 右旋糖酐酶的最适作用温度为 20， 在 60保温 2h 后该酶仍具有 50% 以上的活性 ； 右旋糖酐酶在 pH6.0-10.0 范围内稳定， Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Mg2+、 Li2+、 Co3+、 Cu2+、 Zn2+对酶有不同程度的抑制作用 ； Al3+对该酶有激活作用 ； SDS、 尿素、 DTT 和 NBS 对该酶有抑制作用。 说 明 书 CN 101993848 A CN 101993852 。
36、A1/9 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A2/9 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A3/9 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A4/9 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A5/9 页 13 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A6/9 页 14 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A7/9 页 15 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A8/9 页 16 图 15 图 16 说 明 书 附 图 CN 101993848 A CN 101993852 A9/9 页 17 图 17 图 18 图 19 说 明 书 附 图 CN 101993848 A 。