技术领域
本发明属于药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类荜茇酰胺-川芎嗪杂合物或其药学上可接受的盐，他们的制备方法、含有这些化合物的药用组合物以及它们的医药用途
背景技术
荜茇酰胺(piperlongumine,PL)又称荜茇明碱(piplartine)，属生物碱类化合物。最初分离自胡椒科植物荜茇的根，在长柄胡椒P.sylvaticum Roxb.及瘤突胡椒P.tuberculatum Jacq.等的根中也有分得。
荜茇酰胺具有多种药理作用，可调节高脂血症大鼠的血脂代谢，抗血小板聚集、镇痛、抗真菌等诸多药理活性，是一种极具药用价值的化学物质。近年来研究发现，荜拔酰胺可抑制肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭和转移；荜拔酰胺与一些抗肿瘤药物联用时，可减弱或消除抗肿瘤药物产生的不良反应。机制研究表明，荜茇酰胺通过靶向调节氧化应激蛋白来调节氧化还原作用和活性氧的动态平衡，造成肿瘤细胞内的GSH水平下降，GSSG水平上升，最终导致肿瘤细胞的ROS浓度升高，使其细胞凋亡或者坏死。由于正常细胞中无或极少有氧化应激出现，所以荜茇酰胺对正常细胞的影响很小。荜茇酰胺虽然具有很好的抗肿瘤活性，但本身也存在一些缺点，如水溶性很差，制约了其深入研究和临床开发。
天然产物川芎嗪(Ligustrazine,TMP)是川芎的主要活性成分之一，其结构含水溶性的吡嗪骨架。川芎嗪具有清除自由基、抗血小板聚集、抗血栓、扩血管等多种药理活性，临床用于呼吸系统疾病、冠心病及缺血性心脑血管疾病等的治疗，已取得了较好的疗效。新近研究发现，川芎嗪是ROS诱导剂，可增加肿瘤细胞内ROS水平，杀伤肿瘤细胞。此外，川芎嗪亦能抑制肿瘤细胞的增殖和转移。但是，川芎嗪需要高剂量给药才能获得所需药效，故有可能导致毒性累积。此外，川芎嗪抗肿瘤时，一般需要与化疗药物联用，故有可能改变药代动力学性质，增加毒副作用。
发明内容
本发明的目的之一是在现有技术的基础上，提供一类水溶性和药理活性优于荜茇酰胺的荜茇酰胺-川芎嗪杂合物、异构体或其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的是提供一种荜茇酰胺-川芎嗪杂合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种荜茇酰胺-川芎嗪杂合物在医药方面的应用。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一类荜茇酰胺-川芎嗪杂合物，即式(I)所示的化合物、异构体或其药学上可接受的盐，
其中，
R1、R3或R4分别独立地选自C1～3烷基或C1～3烷氧基；
R2选自氢或卤素。
本发明包含异构体，例如顺反异构体和立体异构体。特别是式(I)中与吡嗪环相连的直链双键为E构型的化合物。
我们出人意料地发现，当吡嗪的3,5,6-位同时具有烷基取代基时，与单取代或荜茇酰胺相比，可以显著提高化合物对部分人肿瘤细胞的增殖抑制活性以及在水溶液中的溶解性，从而使该类化合物具有更优异的应用前景。
在一种优选方案中，R1、R3或R4分别独立地选自甲基或乙基。
在一种更优选方案中，R1、R3或R4分别独立地选自甲基。
在一种优选方案中，R2选自氢、氯、溴或碘。
在一种优选方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，其中化合物选自：
(E)-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I1)
(E)-3-氯-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I2)
(E)-3-溴-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I3)
(E)-3-碘-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I4)
(E)-3-氯-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(I5)
本发明提供了一种式(I)所示的化合物的制备方法，它的反应路线如下：
其中，R为R1、R3和R4基团，R1、R3、R4或R2基团的定义如上所述。
在制备化合物III时，溶剂选自乙腈，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种；反应温度为室温。
由化合物III制备化合物IV时，溶剂选自乙腈，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种；反应在碱性条件下进行，碱选自碳酸钾，碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，氢氧化钾，吡啶，4-甲氨基吡啶，三乙胺，N,N-二异丙基甲胺；反应温度为室温。
由IV制备Ⅴ时，溶剂选自乙腈，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种；反应在碱性条件下进行，碱选自吡啶，4-甲氨基吡啶，三乙胺，N,N-二异丙基甲胺；反应温度为-20℃。
由V制备I时，溶剂选自乙腈，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种；反应在碱性条件下进行，碱选自吡啶，4-甲氨基吡啶，三乙胺，N,N-二异丙基甲胺；反应温度为-70℃。
这些中间体或目标化合物均可按照常规分离技术加以纯化，如果需要可按常规分离技术分离成它们的单体，并且可进一步根据需要将其转化为与可药用酸的加成盐。
除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：
“烷基”表示1‐20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1‐20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。含1－3个碳原子的烷基称为低级烷基。当低级烷基没有取代基时，称其为未取代的低级烷基。更优选的是，烷基是有1‐10个碳原子的中等大小的烷基(即C1～10烷基)，例如甲基、乙基、丙基、2‐丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。进一步优选的烷基是有1‐8或1‐6个碳原子，最好是，烷基为有1‐3个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2‐丙基等。烷基可以是取代的或未取代的。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
本发明中所指的“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：
(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、酒石酸、马来酸、抗坏血酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、γ‐羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、樟脑酸、草酸、乙磺酸、萘‐1‐磺酸、萘‐2‐磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、天冬氨酸、硬脂酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等。
(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N‐甲基葡糖胺、奎宁等。
本发明中的“药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。
本发明中的“药用载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的药物组合物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氢化蓖麻油或多乙氧基氢化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。
本发明提供了一种药物组合物，它以本发明所述的化合物、异构体或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的盐。该药物组合物的活性成分可以只为本发明化合物，也可以与现有的其他药物配伍使用。
本发明中，在给予哺乳动物通式I化合物及其药学上可接受的盐，以及这些化合物的溶剂化物(这里统称为“治疗药物”)时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药方式可以经各种途径，包括口服、非胃肠道给药或局部给药。这里所指的非胃肠道给药包括但并不限于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射和透皮给药。
本发明所提供的化合物具有较好的水溶性，约是荜茇酰胺的9-26倍。药理试验证明，该类化合物对4种结肠癌细胞的增殖抑制活性均明显优于荜茇酰胺。其中I2对结肠癌细胞的选择性(正常结肠细胞CCD-841的IC50与结肠癌细胞的IC50的比值)为43-172倍，而荜茇酰胺仅为5-17倍。I2能选择性升高肿瘤细胞内的ROS水平，体内外具有优异的抗结肠癌细胞增殖和转移活性，效果优于荜茇酰胺。
本发明的化合物、异构体或其药学上可接受的盐可应用在制备治疗或预防肿瘤的药物方面。另一方面，本发明的化合物、异构体或其药学上可接受的盐可应用在与转移性癌症有关的药物方面，尤其适用于治疗或预防癌症的药物方面，具体包括但不限于脑胶质瘤、结肠癌、转移性结肠癌、非小细胞肺癌、白血病等。
附图说明
图1本发明代表化合物I2对小鼠结肠癌移植瘤生长的影响；
图2本发明代表化合物I2对小鼠结肠癌肺转移的影响。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：(E)-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I1)
将中间体V(0.5mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，向其中滴加三乙胺(0.6mL)，-20℃下向反应液中滴加特戊酰氯(0.6mL)，接着反应45分钟左右；同时将中间体VI(0.5mmol)溶于20mL的无水四氢呋喃，-70℃条件下加入正丁基锂(2.9mL)，接着搅拌45分钟左右后，将前一步的反应液直接加入到该反应中，接着反应1小时后，TLC监测反应。向反应液中加入10mL的饱和氯化铵水溶液，猝灭反应中的正丁基锂，萃取，水相用乙酸乙酯洗涤(20mL×3)，有机相合并后饱和食盐水洗涤(30mL×3)，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，经柱纯化(PE/EA＝3:1)后得纯品淡黄色固体(I1)236mg，淡黄色固体。
产率53％；mp 115-118℃。1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):2.41～2.45(m,2H,CH2),2.48(s,6H,2×CH3),2.59(s,3H,CH3),4.01(t,J＝6.0Hz,2H,NCH2),6.03(d,J＝4.5Hz,1H,CH＝CH),6.90～6.96(m,1H,CH＝CH),7.80～7.91(m,2H,CH＝CH)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ20.9,21.9,22.2,26.5,42.3,126.2,138.4,143.2,149.3,150.1,152.6,161.4,169.0；ESI-MS:294.1[M+Na]+；HRMS calculated for C15H17N3O2Na[M+Na]+294.1218,found 294.1219,ppm error 0.3.
实施例2：(E)-3-氯-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I2)
参考化合物I1的合成方法，得纯品淡黄色固体(I2)236mg。产率56％；mp 111-114℃。1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):2.49(s,6H,2×CH3),2.54～2.56(m,2H,NCH2CH2),2.59(s,3H,CH3),4.06(t,J＝6.0Hz,2H,NCH2CH2),7.06(t,J＝4.5Hz,1H,COClC＝CH),7.82～7.95(m,2H,CH＝CH)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ21.0,21.9,22.2,25.5,42.0,126.2,128.3,138.4,141.3,143.2,149.3,150.1,152.6,161.4,168.8；ESI-MS:328.1[M+Na]+；HRMS calculated for C15H16N3O2ClNa[M+Na]+328.0829,found 328.0835,ppm error 1.8.
实施例3：(E)-3-溴-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I3)
参考化合物I1的合成方法，得纯品淡黄色固体(I3)。产率43％；mp 109-113℃。1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):2.44～2.59(m,11H,NCH2CH2and 3×CH3),4.06(t,J＝7.5Hz,2H,NCH2CH2),7.06(t,J＝4.5Hz,1H,COClC＝CH),7.83～7.93(m,2H,CH＝CH)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ21.0,21.9,22.2,26.9,42.1,113.2,126.3,138.3,143.3,147.3,149.3,150.1,152.6,161.3,169.0；ESI-MS:372.0[M+Na]+；HRMS calculated for C15H16N3O2BrNa[M+Na]+372.0368,found372.0371,ppm error 0.8.
实施例4：(E)-3-碘-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(I4)
将碘(104mg)加入到I1(50mg)的吡啶和四氢呋喃混合液(V(Py)/V(THF)＝1:1)中，室温下搅拌过夜，向反应中加入16mL的饱和氯化铵水溶液，加入适量的亚硫酸钠后，萃取，水相用乙酸乙酯洗涤(20mL×3)，有机相合并后用硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩后得粗品，经柱纯化(PE/EA＝3:1)后得黄色固体(I7)23mg，产率31.4％。
mp 108-113℃。1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):2.45～2.51(m,8H,NCH2CH2and 2×CH3),2.59(s,3H,CH3),4.07(t,J＝7.5Hz,2H,NCH2),7.65(t,J＝4.5Hz,1H,C＝CH),7.84(s,2H,CH＝CH)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ21.0,21.9,22.2,28.7,42.3,96.6,126.4,138.2,143.3,149.3,150.1,152.6,154.7,161.3,169.1；ESI-MS:420.0[M+Na]+；HRMS calculated for C15H16N3O2INa[M+Na]+420.0185,found 420.0191,ppm error 1.4.
实施例5：(E)-3-氯-1-{3-[2-(3,5,6-三甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮盐酸盐(I5)
化合物I2(50mg，0.16mmol)溶于乙酸乙酯(5mL)，再加入饱和HCl的乙酸乙酯溶液(15mL)，室温搅拌过夜。过滤得产物I5，淡黄色粉末，产率：49％，mp：95-97℃。1H NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):2.49(s,6H,2×CH3),2.54～2.56(m,2H,NCH2CH2),2.59(s,3H,CH3),3.97(t,J＝6.3Hz,2H,NCH2CH2),7.36(t,J＝4.5Hz,1H,COClC＝CH),7.77～7.67(m,2H,CH＝CH)。
实施例6：本发明代表化合物的溶解度测试结果
采用HPLC法，对川芎嗪-荜茇酰胺杂合物I1-4在纯水和PBS溶液(50mM，pH 7.4)中的溶解度进行测定。由表1可以看出，这些化合物的水溶性均优于荜茇酰胺，其中I2(22.84μg/mL)和I1(42.63μg/mL)在纯水中的溶解度分别是荜茇酰胺(1.63μg/mL)的约14倍和26倍。结果表明，本发明化合物可明显改善整体分子的水溶性。
表1.I1-4水溶性的测定
实施例7：本发明的代表化合物的部分药理试验及结果
1.体外抗肿瘤初筛
实验方法：
(1)细胞消化、计数、配制成浓度为3～5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔3～5×103个细胞)；
(2)96孔细胞培养板置于37℃，5％的CO2培养箱中培养24小时；
(3)用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组；
(4)96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时；
(5)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值；
a.每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；
b.弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；
c.λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。
(6)计算各组别抑制率。
测试结果：表2中列出了本发明部分化合物抑制多种肿瘤细胞增殖的活性数据，阳性对照药为PL。
此外，本课题组公开了一组含氮杂环衍生的PL类似物及其抗肿瘤活性(European Journal of Medicinal Chemistry,2017,138,313-319)，其中有三个化合物含吡嗪结构，分别为(E)-1-{3-[2-(吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(化合物A)，(E)-1-{3-[2-(3-甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(化合物B)以及(E)-1-{3-[2-(5-甲基吡嗪)]丙烯酰基}-5,6-二氢吡啶-2(1H)-酮(化合物C)。我们对化合物I1-4与A-C的抗肿瘤活性进行了对比。由表1可以看出，化合物I1-4抗肿瘤活性显著优于PL，其中化合物I2活性最强。值得注意的是，I2对HCT-116细胞的增殖抑制活性是A-C的10-30倍。该结果显示，将川芎嗪和荜茇酰胺杂合，可有效增强衍生物的体外抗肿瘤活性。
表2化合物对部分人肿瘤细胞的抑制增殖活性IC50值
表3化合物对不同的人结肠癌细胞及正常结肠上皮细胞的增殖抑制活性IC50(μM)
由表3可见，I2对4种结肠癌细胞的增殖抑制活性均明显优于荜茇酰胺，其中对HCT-116的效果最好。I2对结肠癌细胞的选择性(正常结肠细胞CCD-841的IC50与结肠癌细胞的IC50的比值)为43-172倍，而PL仅为5-17倍，提示I2对结肠癌细胞的选择性优于PL。
2.体内抗结肠癌活性研究
实验方法：收集培养细胞，在无菌条件下制备成2×107/mL细胞悬液，以0.1mL接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100mm3后将动物随机分4组，每组8只。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。模型组，不给药或给等剂量溶媒；药物组：腹腔注射给药，每天1次，连续给药3周。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2
其中a、b分别表示长宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
测试结果：如图1所示，腹腔注射2.5和5mg/kg两个剂量的I2，以考察其体内抑瘤活性。阳性对照选择PL，给药剂量为5mg/kg。每天给药一次，连续三周。结果显示，I2能有效抑制移植瘤的生长，5mg/kg剂量下抑瘤率为61％，明显优于PL(53％)。
3.体内抗结肠癌的肺转移试验
实验方法：裸鼠40只，20-22g，雄性。置于SPF级环境饲养，每3只一笼，室内相对湿度50％-70％，室温18～29℃。小鼠标准饲料、饮水及垫料均经高温高压灭菌处理，每周更换2次。小鼠需饲养1周时间适应新环境，1周后可用于实验建模。取对数生长期的HCT-116细胞，在无菌条件下用不含血清的培养基制备成5×106/mL细胞悬液，以0.2mL注射于裸鼠尾静脉，建立人源结肠癌细胞系HCT-116的BALB/c裸鼠肺转移模型。之后将化合物I2分1、2和4mg/kg三个剂量，经腹腔注射给药。阳性对照选择PL和Oxaliplatin，给药剂量为4mg/kg，亦经腹腔注射给药。注射后每3天记录一次小鼠体重变化。每周给药3次，6周后处死所有裸鼠，取其肺脏，切片行HE染色，观察其有无转移灶，若发现转移灶，观察肿瘤转移灶的数目，并计算肿瘤转移灶的面积，并进行统计分析。
测试结果：如图2所示，I2能有效抑制HCT-116细胞的肺转移。与对照组相比，I2能够剂量依赖性地改善裸鼠肺转移瘤模型中小鼠体重减轻的状况，其效果优于对照组PL及Oxaliplatin(图2A)。在造模过程中，对照组小鼠从第4周开始，陆续出现了死亡现象，实验结束时其最后存活率为66.7％，而I2，PL及Oxaliplatin能够明显提高小鼠存活率(图2B)，腹腔注射1mg/kg的I2，小鼠存活率提高到了83.3％，而腹腔注射2mg/kg、4mg/kg的I2，4mg/kg的PL和Oxaliplatin，小鼠的存活率均提高到了100％。更重要的是，I2能够剂量依赖性地减少小鼠肿瘤肺转移灶数目(图2D)及降低转移灶的肿瘤体积(图2C)，其效果明显好于对照组PL及Oxaliplatin。在4mg/kg，I2与PL及Oxaliplatin组的小鼠结肠癌肿瘤肺转移灶数目平均值分别为22、39和36。