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1、10申请公布号CN102002480A43申请公布日20110406CN102002480ACN102002480A21申请号201010581138722申请日20101209CCTCCC201012220101201C12N5/20200601C07K16/10200601C07K16/06200601G01N33/577200601G01N33/569200601G01N33/543200601C12R1/9120060171申请人湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址410004湖南省长沙市湘府中路188号72发明人朱忠武唐连飞肖家勇孟芳赵和平姜金林禹思宇欧阳振宇74专利代理机构长沙。
2、市融智专利事务所43114代理人颜勇54发明名称抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒57摘要本发明公开了一种抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。该单克隆抗体是由保藏号为CCTCCC2010122的杂交瘤细胞分泌产生的，其效价和特异性高。研制成的抗原捕获ELISA试剂盒包含有包被有单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液。该试剂盒特异性和灵敏度高，操作简单，可用于大规模H3N2猪流感病毒的临床和实验室检测，应用前景。
3、广阔。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102002490A1/1页21一种产生抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏号为CCTCCC2010122。2一种抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCC2010122的杂交瘤细胞株产生的。3一种检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA试剂盒，其特征在于，包含有包被有单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对。
4、照、洗涤液和反应终止液；所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCC2010122的杂交瘤细胞株产生的。4根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体的制备过程如下用昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感病毒的血凝素蛋白免疫雄性新西兰兔1MG/只，皮下多点注射，分别在0，3，6周共免疫3次；取血清纯化得抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体；再用辣根过氧化物酶标记。5根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感表达血凝素蛋白溶液，浓度为100G/ML，所述的阴性对照为SPF。
5、鸡胚尿囊液100倍稀释液。权利要求书CN102002480ACN102002490A1/5页3抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒技术领域0001本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及其抗原捕获ELISA试剂盒。背景技术0002猪流感SWINEINFLUENZA，SI是甲型A型流感病毒引起的猪或人的一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。属于正粘病毒科、A甲型流感病毒属，为单股负链RNA病毒，基因组约为136KB，由大小不等的8个独立片段组成。A型流感病毒包含有16种血球凝集素蛋白H1H16和9种神经氨。
6、糖酸苷酶蛋白N1N9。目前最常见的亚型是H1N1，H1N2和H3N2，全世界很多新的病毒变种和亚型还在不断地被发现中。0003猪流感的临床症状为体温突然升高4045。猪流感能造成急性上呼吸道感染，典型特征是发热、嗜睡、厌食、体重减轻、呼吸困难，以及流涕、喷嚏、结膜炎，后期有咳嗽，有时还会出现流产。猪流感可继发细菌或病毒感染，严重时可导致呼吸衰竭WORLDORGANIZATIONFORANIMALHEALTHOIEMANUALOFDIAGNOSTICTESTSANDVACCINESFORTERRESTRIALANIMALSONLINEPARIS；OIE；2008SWINEINFLUENZAAVA。
7、ILABLEATHTTP/WWWOIEINT/ENG/NORMES/MMANUAL/2008/DF/20808_SWINE_INFLUENZAPDFACCESSED7JAN2008。某些毒株感染后，猪仅有轻微的或没有临床症状，发病率很高但死亡率低于14ACHAPN，SZYFRESBPANAMERICANHEALTHORGANIZATIONPAHOZOONOSESANDCOMMUNICABLEDISEASESCOMMONTOMANANDANIMALSVOLUME2CHLAMYDIOSIS，RICKETTSIOSESANDVIROSES3RDEDWASHINGTONDCPAHO；2003SCIEN。
8、TIFICANDTECHNICALPUBLICATIONNO580INFLUENZA；P15572。此外，猪流感病毒也是猪免疫抑制的主要诱因之一，猪群感染猪流感病毒可引起猪繁殖能力减退，育肥猪增重减慢等CHOIYK，GOYALSM，JOOHSPREVALENCEOFSWINEINFLUENZAVIRUSSUBTYPESONSWINEFARMSINTHEUNITEDSTATESJARCHVIROL，2002，14712091220。猪流感不仅给养猪业造成重大经济损失，还对人类健康造成威胁，因此研究快速、敏感、准确的猪流感诊断产品，具有重要的经济价值和公共卫生意义。0004血清学调查和毒株监测研究。
9、发现，19992003年间我国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区等20个省、市猪群大范围存在H3亚型流感病毒感染李海燕，于康震，辛晓光，等部分省市猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定J动物医学进展，2003，2436772，SRETA等研究了H1N1和H3N2亚型泰国分离株对断奶乳猪仔猪的致病力，发现这2种亚型均可诱导流感样症状和肺损伤SRETAD，KEDKOVLDR，TUAMSANGS，ETALPATBOGENESISOFSWINEINFLUENZARIMSNLAIISOLATESINWEANLINGPIGSANEXPERIMENTALTRIALJVIROLJ20096134，此病。
10、一旦暴发流行，很难将其控制和根除，因此及时准确地检测出SIV，对预防和控制猪流感暴发流行具有重大意义。0005猪流感病毒抗原检测方法较多，到目前为止，国际上通用的猪流感抗原检测方法说明书CN102002480ACN102002490A2/5页4有鸡胚分离、荧光RTPCR、RTPCR等。病毒分离耗时长，同时存在生物安全隐患；RTPCR和荧光RTPCR方法对检测设备和人员专业知识要求较高、成本大，难以在普通实验室和基层开展，因此，研制一种直接检测样品中H3N2猪流感病毒的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒具有很强的实用价值和广阔的应用前景，对猪流感的防控具有重要意义。0006本发明制备了H3N2。
11、猪流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，并以此单克隆抗体为基础，建立起具有高度敏感性和特异性、操作简单的ELISA检测方法。该方法能快速、经济、高通量检测样品中H3N2猪流感病毒。发明内容0007本发明的目的之一是提供特异性抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4。本发明另一目的是提供体外检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA检测试剂盒，该试剂盒能对血液、组织和棉拭子等样品中H3N2猪流感病毒进行特异性检测，操作简单、敏感性高、特异性好。0008本发明所提供的抗H3N2猪流感血凝素蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株2B4分泌产生的，该杂交瘤细胞株已于2010年。
12、12月1日保藏在中国典型培养物保藏中心CHINACENTERFORTYPECULTURECOLLECTION，简称CCTCC，保藏号为CCTCCC2010122。0009一种检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA试剂盒，包含有包被有单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液；所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCC2010122的杂交瘤细胞株产生的。0010所述的辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体的制备过程如下用昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感病毒的血凝素蛋白免。
13、疫雄性新西兰兔1MG/只，皮下多点注射，分别在0，3，6周共免疫3次；取血清纯化得抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体；再用辣根过氧化物酶标记。0011所述的阳性对照为昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感表达血凝素蛋白溶液，浓度为100G/ML，阴性对照为SPF鸡胚尿囊液100倍稀释液。0012一种病毒含有多种抗原，一种抗原又可能含有多个抗原表位。因此，针对一种抗原可以获得不止一个抗体，但这些抗体对抗原的结合特性可能是不同的。为了找到能与抗原特异性结合的单克隆抗体，需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定工作。本发明通过大量的工作，获得了能分泌特异性结合H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的杂交。
14、瘤细胞株2B4；并在此基础上首次制备出体外检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA检测试剂盒。该试剂盒特异性和灵敏度高，操作简单，可用于大规模H3N2猪流感病毒的临床和实验室检测，应用前景广阔。具体实施方式0013以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。0014实施例1、抗H3N2猪流感病毒特异性单克隆抗体的制备0015本发明中单克隆抗体是利用杂交瘤技术来制备的，具体如下0016A动物免疫说明书CN102002480ACN102002490A3/5页50017将经甲醛灭活的H3N2亚型猪流感病毒免疫BALB/C小鼠，进行3次免疫。0018B细胞融合0019分离免疫小鼠的脾细胞，与。
15、SP2/0骨髓瘤细胞株融合。0020C阳性杂交瘤细胞株筛选0021加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株。0022D有限稀释法克隆化筛选0023利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的杂交瘤细胞株。0024本发明得到了一株能稳定分泌、特异性强的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的杂交瘤细胞株，命名为2B4。0025E单克隆抗体的生产和纯化0026本发明采用了2种方法进行单克隆抗体的生产，一是接种小鼠腹腔的方法生产单克隆抗体，用辛酸饱和硫酸铵法进行纯化，最后用PROTEING预装层析柱纯化。二是按照常规的细胞培养方法。这2种方法均为单克隆抗体技。
16、术中常用的方法。0027实施例2、H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒研制0028一、H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒组成0029本发明所述H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒组成为已包被本发明所述单克隆抗体的固相载体即酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液。00301ELISA条板包被抗H3N2猪流感单克隆抗体0031用包被缓冲液005MOL/L碳酸盐缓冲液，PH值96将纯化的本发明所述单克隆抗体稀释至浓度为10G/ML，包被96孔EIA/RIA高效结合酶标板。
17、美国CORNING公司，100L/孔，4过夜。取出后用PBST洗板3次，每次3MIN，甩干。用PBST稀释脱脂奶粉至终浓度5作为封闭液，每孔加入该封闭液100L，37封闭1H。取出后用PBST洗板3次，每次3MIN，甩干，干燥后真空密封保存。003225PBST的配制0033NACL1000G，KCL02G，MCI26H2O25G，KH2PO450G，NA2HPO4285G，TWEEN20125ML，硫柳汞25G，用蒸馏水定容至1000ML，加入002叠氮纳作为防腐剂，除菌过滤后分装。00342抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体及标记0035用昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感。
18、病毒的血凝素蛋白免疫雄性新西兰兔。1MG/只，皮下多点注射，分别在0，3，6周共免疫3次。取血清纯化得抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体。采用“简易过碘酸钠法”用辣根过氧化物酶标记该多克隆抗体。00361称取6MGHRP溶解于蒸馏水中。00372于上液中加入02ML新鲜配制的01MOL/LNAIO4溶液，室温下避光搅拌20MIN。00383将上述溶液装入透析袋中，对0001MOL/L，PH44的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。00394加20L02MOL/L、PH95碳酸盐缓冲液，使溶液PH上升至9095，立即加说明书CN102002480ACN102002490A4/5页6入1ML多抗约5M。
19、G溶液，室温避光搅拌2H。00405加01ML新配的4MG/MLNABH4液，混匀，置42H。00416将上述液装入透析袋中，对015MOL/MLPH74PBS透析，42H。00427取出透析袋，置PEG8000干粉中浓缩袋内液体至5ML，吸出，20保存。00433底物0044采用3，3，5，5四甲基联苯胺SIGMA公司作为辣根过氧化物酶的底物。以05过氧化脲为氧化剂。00454阳性和阴性对照0046阳性对照昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感病毒的血凝素蛋白，浓度为100G/ML。0047阴性对照SPF鸡胚尿囊液100倍稀释液。00485洗涤液0049如前述PBST配制。00506反。
20、应终止液0051用三蒸水配制2MOL/LH2SO4溶液。0052二、H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒的使用方法00531样本处理0054组织样本用PBS研磨，取上清备用。棉拭子样本加入适量PBS后振荡，离心取上清。00552加入对照和待测样本取待测样本100L加入相应酶标孔，阳性和阴性对照孔分别加100L阳性和阴性对照，敲击已加样板的一侧，以确保样品均匀覆盖孔底。加样后的酶标板置湿盒中37孵育1H，然后用PBST洗板3次，甩干。00563加酶标多克隆抗体加入酶工作液配制方法以PBST稀释酶标抗体，稀释倍数11000，100L/孔，湿盒中37孵育1H，取出后PBST洗板3次，。
21、甩干。00574加底物液显色100L/孔，室温避光515MIN。00585终止用2MOL/LH2SO4终止显色反应，50L/孔。00596测450NM值酶标板置酶标仪上测定450NM值。00607结果判定0061按上述方法，对30份阴性尿囊液进行了检测。按照公式临界值阴性OD平均值3标准差，计算得阴阳临界值为0104。待检样本OD值大于0104的判为阳性，否则判为阴性。0062实施例3H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒的特异性和敏感性测定00631特异性测定以下实验材料均经5630MIN灭活处理0064为了验证本发明的H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒的特异。
22、性，按照实施例2对2株新城疫病毒样本1、2号、3株H1N1病毒样本3、4、5号、1株H5N1病毒样本6号、1株H7N17号和1株H9N2病毒样本8号进行了检测。结果表明，本发明试剂盒对上述蛋白样本的检测OD值在00560093之间表1，显示出良好的特异性。0065表1试剂盒的特异性检测说明书CN102002480ACN102002490A5/5页7006600672敏感性测定0068将H3N2病毒尿囊液连续2倍稀释，得到2222个HA单位，然后按实施例2进行检测。结果表明本发明试剂盒能检测到21个HA单位的抗原表2。0069表2试剂盒敏感性测定00700071实施例4H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒对临床样本的检测0072利用本发明H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒，对本发明人所在单位的1390份猪鼻腔棉拭子进行了检测，检出阳性样本数6份表3。提取这6份样本RNA采样荧光RTPCR方法进行确认，其荧光RTPCR检测结果也为阳性，符合率为100。0073表3临床样本检测0074说明书CN102002480A。