技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新型酸性果胶酶PEC2及其 基因和应用。
背景技术
果胶是一种由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常 带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖等组成的侧链，游离的羧基部分或 全部可与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起。果胶存在于所有的高等植 物中，沉积于初生细胞壁和细胞层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、 木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，从而表现 出固有的形态。
果胶酶(pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，大致可分为果胶水 解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pentin lyases)、果胶酯酶(pectin esterases) 和原果胶酶等。按照作用最适pH的不同，果胶酶又可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。
果胶酶作为工业生产领域中的一种重要的新兴酶类，不仅是人们生活中最早得 到应用的酶类之一，而且也是世界四大酶制剂之一，在全世界食品酶的销售额中约 占到了四分之一，在各行业里得到了广泛应用，具体主要表现在以下几个方面：
1.果汁的提取及澄清
果胶酶在工业中最主要的用途是用于果汁的提取和澄清。果汁中如存在果胶物 质，果汁的黏度就加大并且变得混浊。因此，在工业生产时，可利用果胶酶和淀粉 酶等来澄清果汁，它能使过滤的时间缩短50％，另外，采用果胶酶处理后，果汁的 澄清度也有很大提高。
2.天然产物的提取
果胶物质的存在不同程度会影响或阻碍植物内相关天然产物的释放，在适宜条 件下，向其中加入相应的果胶酶，可将植物中的果胶类物质水解掉，从而有利于植 物内相应天然产物的提取。
目前利用果胶酶生产的提取物有：银杏叶提取物、大蒜油浓缩液、蘑菇浓缩液、 人参浆、当归浸膏、甘草液等。利用酶类提取，不仅可提高萃取率，还可提高纯度。
3.纺织品的生物脱胶
用果胶酶处理纺织品，可以去除初生胞壁中的果胶类物质，在比较缓和的pH和 温度条件下即可使处理后的织物手感柔软、强度高，从而取代耗能大、污染严重的 传统纺织脱胶工艺。
4.造纸业的生物制浆
造纸工业中的生物制浆与纺织品的生物脱胶类似，都是通过果胶酶等降解植物 纤维原料中的果胶、半纤维素及木质素，使其分散成满足造纸工业不同要求的束纤 维或单纤维，以生产柔软、均一、有弹性的高品质材料。
5.作为饲料用酶制剂
添加饲用酶制剂能补充动物体内酶源的不足，增加动物自身不能合成的酶，从 而促进畜禽对养分的消化吸收，提高饲料的利用率，促进动物生长。
果胶酶可有效降解饲料原料中的果胶，因此，可作为一种绿色饲料添加剂在畜 牧业中生产中广泛应用。研究结果表明：果胶酶的添加可显著提高全期增重、降低 料肉比，同时干物质、粗蛋白、有机物和粗纤维的消化率均提高了11％-22.5％。
因此，果胶酶的应用潜力很大，拥有良好的市场前景。
天然来源的果胶酶广泛存在于动植物和微生物中，但动、植物来源的果胶酶产 量低，难于大规模提取制备，微生物由于具有生长速度快、生长条件简单、代谢过 程特殊和分布广等优点而成为果胶酶的重要来源。
产生果胶酶的菌种很多，如霉菌、部分细菌和酵母菌等，其中主要以霉菌和杆 菌为主。由于真菌中的黑曲霉(Aspergillus niger)属于公认安全级(GRAS，General Regarded As Safe)，其代谢产物是安全的，因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于 黑曲霉，其最适pH值一般在酸性范围。
目前采用天然菌株生产的果胶酶存在一些局限性，主要包括产酶性能较低、果 胶酶的耐温性能较差以及作用pH范围较小等。因此，随着果胶酶应用越来越广泛， 迫切需要对果胶酶进行相应的改良，以提高菌种的产酶性能以及提高果胶酶的耐热 性能等。
随着分子生物学技术的不断提高，现在越来越多的科研人员正利用基因克隆技 术来实现果胶酶在工程菌宿主中进行表达。
本发明所提供了一种酸性果胶酶基因，该基因所表达的果胶酶，具有比活高、 耐高温、pH作用范围广等优点，可以广泛应用于各种工业生产，具有良好的应用前 景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型酸性果胶酶PEC2。
本发明的另一目的是提供编码上述新型酸性果胶酶的基因PEC2。
本发明的另一目的是提供包含上述新型酸性果胶酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述新型酸性果胶酶基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供制备上述新型酸性果胶酶的方法。
本发明的另一目的是提供上述新型酸性果胶酶的应用。
本发明的新型酸性果胶酶PEC2源自黑曲霉AN070902(Aspergillus niger)，于 2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为： CGMCC No.4235，其相关信息记载于申请号为CN201010566249.0的专利申请中， 已于2011年4月6日公开。
本发明提供的一种新型酸性果胶酶PEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MPSRFITAFV AALFASAASL PVNTTTEAQD ETIEAPAYSD VIGLEGDFDV
AVLPSFNNST 60
LNGLFTINTS IAIAAKEEGV ESLREKAEFA EVMSAFKLFI LLLSSSLGVH
HVPRASSSSR 120
QCQVVPSKYQ ASNGDSATAD SAVQAFAQCA TDSVIIFEEG VNYNIFQPIT
ATNLSNVEIR 180
MHGNLHLPQN ITAVQNIVSD GTSTWFTLEG PKVDWIGPED VNNGWIDSYG
QPWWDTNPAG 240
SSGIDNRPHL MSFKSSQATM KYFSLGSPSP GMSNCMDKTL QSATLLSTLP
RQVASHSTLT 300
VSMLVPRDHY PQRHVYHDDG AIPECADDIS HLKKFHLTHR AQTH 344
该酶蛋白由344个氨基酸组成，理论pI/Mw：5.26/37261.67。
本发明还提供了编码上述果胶酶的基因PEC2，该基因的序列如SEQ ID NO.2 所示：
atgccttcaa gatttattac tgcttttgtt gcagcattat tcgcatccgc tgcttcctta 60
ccagtcaaca ctacaacaga agcacaagat gaaacgattg aagctccggc ttactcagat 120
gtcatcggtt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc catcctttaa taacagcaca 180
ttgaacgggt tatttactat aaatactagc attgccattg ctgctaaaga agaaggggta 240
gagtctctca gagagaaagc tgaattcgct gaagtcatgt ctgcattcaa gctattcatt 300
cttcttcttt cctcctcact aggggtccac cacgttccaa gagcatccag cagctctcgg 360
caatgccaag tggttccgtc caaataccag gcatcgaatg gggactcggc tacggctgat 420
tccgctgtcc aggcctttgc acaatgcgcg actgactcgg ttattatttt cgaggagggt 480
gtcaactata acatctttca gccgatcacc gccaccaacc tcagcaatgt ggaaatccgg 540
atgcacggca acctgcatct gccacagaat atcactgcgg tgcagaatat agtcagtgac 600
ggtacttcta catggtttac cctagaagga ccaaaagtgg actggattgg tcctgaagac 660
gtgaacaatg gttggattga ctcgtacgga caaccgtggt gggatacgaa ccctgcaggt 720
agttcaggca tcgataaccg tccgcatctc atgagcttca agtctagcca agccactatg 780
aaatacttca gtctaggaag cccatcgcct ggaatgtcaa actgcatgga caagacatta 840
cagtcagcca cgctattatc gacgctacct cgacaggtag cttcccattc aacactgacg 900
gtttcgatgt tggtaccaag ggatcactat ccacagcgac atgtatatca cgacgatggc 960
gcgattgtag gcgcagcgga cgacatatcg caccttaaga aatttcacct aacacatcgg 1020
gcacagactc actga 1035
本发明还提供了包含上述新型酸性果胶酶基因PEC2的重组载体，优选为 Ppic9K-PEC2。将本发明的新型酸性果胶酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位 点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优 选的实施方案，优选为将本发明的果胶酶基因插入到质粒pPIC9K上的EcoRI和NotI 限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到 重组酵母表达质粒Ppic9K-PEC2。
本发明还提供了包含上述新型酸性果胶酶基因PEC2的重组菌株，优选重组菌 株是毕赤酵母菌株GS115。
本发明还提供了一种高效表达上述新型酸性果胶酶基因PEC2的方法，包括以 下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组酸性果胶酶PEC2的表达；以及
3)回收并纯化所表达的酸性果胶酶PEC2。
其中，步骤2)中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：
第一阶段为菌体培养阶段，按10％比例接入种子，培养18～24小时，以补完葡 萄糖、pH及DO上升为标志；
第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％ 以上即表明该阶段结束，为期约30～60min；
第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，整个 培养时间为180～200小时之间。
发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。
本发明还提供了上述新型酸性果胶酶PEC2的应用，优选该酶在水解果胶及在饲 料、食品、造纸工业中的应用。
利用本发明的方法高效表达上述的酸性重组果胶酶，可达到16000U/mL左右的 发酵水平，同目前已有的现有技术相比，本发明的新型酸性果胶酶通过高效表达后 能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可大大降低生产成本，使其在饲料、食品、 造纸等工业中显示出更大的应用潜力。
附图说明
图1新型酸性重组果胶酶在50L罐中的发酵过程曲线
图2新型酸性重组果胶酶的最适反应温度
图3新型酸性重组果胶酶的最适反应pH值
图4新型酸性重组果胶酶的耐热性能曲线
图5新型酸性重组果胶酶的pH耐受性能
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指 南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说 明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母GS115、载体Ppic9K购自Invitrogen公司。
黑曲霉AN070902(Aspergillus niger)，于2010年10月20日保存于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4235，其相关信息记载于 申请号为CN201010566249.0的专利申请中，已于2011年4月6日公开。
2、酶与试剂盒
逆转录酶SuperScriptTM III、RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。质粒DNA 提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购 自Fermentas公司。
3、培养基
基本盐培养基：磷酸二氢铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸 钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35 毫升PTM1
PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水 钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、 浓硫酸0.5％、生物素0.02％
实施例1、黑曲霉(Aspergillus niger)产果胶酶特性试验
采用筛选出的产糖化酶黑曲霉(保藏编号：CGMCC No.4235)进行摇瓶发酵实 验，其发酵培养基如下：
蛋白胨1％、酵母粉0.5％、葡萄糖0.5％、果胶2％、MgSO4 0.1％、K2HPO4 0.1％
发酵培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20min，冷却后接种，于32℃、200rpm条 件下培养2-3天。
发酵结束后，发酵液离心，取上清液进行果胶酶的反应温度、耐热性能、pH作 用范围等酶学性质测试。测试结果表明，该霉菌所产的果胶酶最适反应温度为40℃ 左右，并具有良好的耐热性能，经85℃水溶液状态下处理10min，酶活保存率仍可 达到75％左右，另外该果胶酶还具有pH作用范围广、耐酸碱性能强等特点，这些方 面的特性均较大程度上优于现有的果胶酶产品，更适于果胶酶的工业应用。
实施例2、黑曲霉(Aspergillus niger)果胶酶基因的克隆
以上述黑曲霉(Aspergillus niger，其保藏号为：CGMCC No.4235)为出发菌 株进行培养，并在培养基中添加适量的果胶(SIGMA)，培养基配方如下：
蛋白胨1％、酵母粉0.5％、葡萄糖0.5％、果胶1％、KH2PO4 0.15％、MgSO4 0.15％。
121℃、0.1MPa下灭菌20min，冷却至室温下接种，于30℃、200rpm条件下 培养2天，待菌丝体生长旺盛时即可收集菌丝体备用。
运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉(Aspergillus niger)总RNA，按照逆转录 酶SuperScriptTM III Reverse Transcriptase操作说明合成第一链cDNA。以cDNA为模 板，设计果胶酶引物进行PCR扩增，将PCR产物由EcoRI和Notl进行双酶切，然 后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K相连接，连接产物转化大肠杆菌 Topl0感受态细胞，经抗生素G418筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。 送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，所获得克隆DNA插入片段含有果胶 酶基因完整的开放阅读框。该果胶酶基因PEC2，全长1035bp(SEQ ID NO.2)，编 码344个氨基酸(SEQ ID NO.1)。得到的重组表达载体命名为Ppic9K-PEC2。
扩增所用引物如下：
PEC25EcoRI：
5’ACTGAATTC ATGCCTTCAAGATTTATTACTGC3’
PEC23NotI：
5’ACAGCGGCCGC TCAGTGAGTCTGTGCCCGATGT3’
实施例3、包含新型酸性果胶酶基因PEC2的毕赤酵母工程菌的构建
优化后的新型果胶酶基因PEC2，采用EcoRI和Notl进行双酶切，重新连接到 经相同双酶切的载体Ppic9K上，获得重组表达载体pPIC9K-PEC2。然后采用BglII 进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母GS115，电转化后涂布于YPD (G418)平板上进行筛选，筛选得到高产毕赤酵母重组菌株pPIC9K-PEC2-GS115-6。
实施例4、新型酸性果胶酶重组菌株的高效表达
将筛选获得的新型果胶酶重组菌株pPIC9K-PEC2-GS115-6进行高密度发酵培 养。
配制20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。 用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至4.6，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％ 以上，发酵温度为30℃。
整个发酵过程分3个阶段：
第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌pPIC9K-PEC2-GS115-6按照10％的接种量 接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L 50％的葡萄糖，培养24-30小时，以补完葡萄糖 为标志；
第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％ 以上，pH上升即表明该阶段结束，为期约30-60min；
第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，培养 时间在180-200小时之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。
在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中新型酸性果胶酶的表达 情况如图1所示，发酵198h的发酵液酶活为16050U/mL。
实施例5、新型酸性重组果胶酶的性质测定
1个酶活单位(U)定义为：在40℃、pH4.2条件下，每分钟催化果胶底物生成1μmol 半乳糖醛酸的酶量定义为一个酶活力单位(μmol/min)。
1、新型酸性重组果胶酶比活测定
将上述发酵液中的耐高温果胶酶通过离子交换柱(Q SepharoseTM Fast Flow Ion Exchanger)纯化，采用改良型Bradford试剂盒(上海Sangon公司)测定蛋白浓度， 得出该新型酸性果胶酶比活为1805U/mg。
2、新型酸性重组果胶酶的最适反应温度及pH测定
最适反应温度：将酶液稀释适当倍数，在不同温度(20～100℃)下反应，测定该酸 性果胶酶的酶活。以最高酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到 该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图2。
最适反应pH：将稀释后的酶液，与不同pH(2.0～9.0)检测条件下，检测该酸性 果胶酶的酶活力，并采用最高酶活为100％，其他检测结果与之相比，即得到不同pH 检测条件下的相对酶活。最适反应pH曲线见图3。
结果如图2和图3所示：该新型酸性重组果胶酶的最适反应温度为40℃，最适 反应pH为4.0。该果胶酶在pH2.0～6.0范围内相对酶活均可达到70％以上，说明该 新型果胶酶的pH作用范围较广，但在中性、碱性条件下酶活较低，为一种典型的酸 性果胶酶。
3、新型酸性重组果胶酶的耐热性能测定
将酶液稀释适当倍数，在不同温度下处理10min后，以未处理的酶活力为对照 100％，测定该酸性果胶酶的相对酶活，结果见图4。
检测结果表明，该酸性果胶酶的耐温性能较好，经85℃下处理10min后，剩余 酶活仍可达到75％以上，可达到工业生产需求。
4、新型重组果胶酶pH稳定性测定
将稀释后的酶液与不同pH的缓冲液混合，室温放置2h，以未处理的酶液为对 照，测定耐高温果胶酶的相对酶活，结果如图5所示。
从测试结查可以看出，该新型酸性果胶酶耐酸碱性能较好，尤其是耐酸能力强。
5、金属离子和EDTA对新型重组果胶酶活力的影响
将含有1mM K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Cu2+和EDTA 的溶液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置30min，以未处理的酶液为对照，结 果如表1所示。
结果表明，Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+对该果胶酶有一定的激活作用；Fe2+、EDTA、 Mn2+对酶活性没有什么影响；其余金属离子Cr3+、Cu2+和Fe3+对酶活性均有不同程度 的抑制作用，SDS则完全抑制了酶的活性。
表1金属离子和EDTA对重组果胶酶酶活力的影响