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1、(10)申请公布号 CN 102586131 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586131 A *CN102586131A* (21)申请号 201110318869.7 (22)申请日 2011.10.19 CCTCC NO.M209163 2009.07.22 CCTCC NO:M209162 2009.07.22 CCTCC No ： M 2011314 2011.09.15 CCTCC NO:M209161 2009.07.22 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (71)申请人 黑龙江大学 地址 150080 黑龙江省。
2、哈尔滨市南岗区学府 路 74 号 (72)发明人 赵凯 张小燕 常志威 孙立庆 夏昕 郝妍 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 韩末洙 (54) 发明名称 一株产酸克雷伯氏菌菌株 (57) 摘要 一株产酸克雷伯氏菌菌株， 它涉及一株产酸 克雷伯氏菌菌株。本发明提供了一株产酸克雷伯 氏菌菌株。本发明产酸克雷伯氏菌菌株为产酸克 雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006， 保 藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2011 年 9 月 15 日， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2011314。 本发明产酸克雷伯氏菌 (K。
3、lebsiella oxytoca) HUB-IV-006 为从白蚁肠道内筛选得到的固氮菌， 可作为指示菌， 用于研究树木内生菌发酵产物对 白蚁肠道固氮菌的抑制作用， 对于白蚁肠道固氮 菌有抑制作用的树木内生菌发酵产物可以有效的 杀灭白蚁。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一株产酸克雷伯氏菌菌株， 其特征在于产酸克雷伯氏菌菌株为产酸克雷伯氏菌 (Klebsiella o。
4、xytoca)HUB-IV-006， 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏地址是 武汉市武汉大学， 保藏日期为 2011 年 9 月 15 日， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2011314。 权 利 要 求 书 CN 102586131 A 2 1/4 页 3 一株产酸克雷伯氏菌菌株 技术领域 0001 本发明涉及一株产酸克雷伯氏菌菌株。 背景技术 0002 白蚁 (Termite) 属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫， 是较为古老的社 会性害虫， 主要以富含纤维素、 半纤维素和木质素等木质材料为食， 这种本领是靠其后肠内 的微生物的作用。白蚁若丧失了肠道中消化。
5、木质素和纤维素的微生物的作用， 就会因为不 能消化木材而死。 0003 白蚁属于典型的寡氮营养型生物， 其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素 的主要来源。白蚁肠道固氮菌及其代谢产物可能直接作为白蚁生长的氮源， 这使白蚁得以 利用含氮极低的木质食物为生。固氮作用是白蚁生命活动必不可少的， 可以通过破坏白蚁 的固氮系统， 使白蚁氮素营养不良而死亡， 这不失为是一种值得探索的防治白蚁方法与途 径。目前， 对于白蚁氮营养方面， 还有许多重要问题仍需作进一步研究， 这不仅具有理论意 义， 而且也有一定的应用意义。 发明内容 0004 本发明提供了一株产酸克雷伯氏菌菌株。 0005 本 发 明 产 酸。
6、 克 雷 伯 氏 菌 菌 株 为 产 酸 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella oxytoca) HUB-IV-006， 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏地址是武汉市武汉大学， 保 藏日期为 2011 年 9 月 15 日， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2011314 ； 本发明产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006为革兰氏阴性菌， 呈短杆状， 菌体大小为(2.0m-2.1m)(1.8m-2.0m)， 无芽孢， 荚膜染色呈阳性 ； 在富集培养基 ( 无氮培养基 ) 上菌落呈乳白色， 圆形， 半透明， 边 缘整齐， 表面湿润不易挑取 ( 如图 1) ； 培养 5。
7、d 后有褐色色素产生。 0006 本发明产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006淀粉水解试验呈阳性， 脂肪水解试验呈阴性， 明胶水解试验呈阴性， 半固体穿刺呈阴性， H2S 试验呈阴性， 尿素试验 呈阳性， 吲哚试验呈阳性， 甲基红试验呈阴性， 伏普试验呈阳性， 柠檬酸盐试验呈阳性， 尿酶 试验呈阳性 ； 分解蔗糖产酸产气， 分解麦芽糖产酸产气， 分解 D- 山梨醇产酸产气， 分解鼠李 糖产酸产气， 分解甘露醇产酸产气， 分解乳糖产酸产气， 分解海藻糖产酸产气。产酸克雷伯 氏菌 HUB-IV-006 的最适生长温度为 37， 最适生长环境的 pH 为 7.00。
8、.2。 0007 本发明产酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 通过 16S rDNA 序列 比对分析， 与产酸克雷伯氏菌 TCCC11019(Klebsiella oxytoca TCCC11019) 的亲缘关系最 近， 比对后相似性达 100。通过结合菌体形态特征、 生长条件、 生理生化鉴定结果确定产 酸克雷伯氏菌HUB-IV-006属于克雷伯菌属(Klebsiella)， 为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) 的一株新菌株。 0008 本发明产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 为从白蚁肠道内筛选得到的固氮菌， 可作为 指示菌， 。
9、用于研究树木内生菌发酵产物对白蚁肠道固氮菌的抑制作用， 对于白蚁肠道固氮 说 明 书 CN 102586131 A 3 2/4 页 4 菌有抑制作用的树木内生菌发酵产物可以有效的杀灭白蚁。 0009 本发明产酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 属于克雷伯菌属 (Klebsiella)， 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏地址是武汉市武汉大学， 保 藏日期为 2011 年 9 月 15 日， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2011314。 附图说明 0010 图1为本发明产酸克雷伯氏菌HUB-IV-006的菌落形态图 ； 图2为具。
10、体实施方式二 中 PCR 扩增产物的电泳图， 其中 M 表示 Marker ； 图 3 为通过产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 和 相近菌株的 16S rDNA 序列进行同源性比对构建的系统进化树。 具体实施方式 0011 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0012 具体实施方式一 ： 本实施方式产酸克雷伯氏菌菌株为产酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006， 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏地址是 武汉市武汉大学， 保藏日期为 2011 年 9 月 15 日， 保藏编号为 CCTCC。
11、 No ： M 2011314。 0013 本实施方式产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006为革兰氏阴性菌， 呈短杆状， 菌体大小为 (2.0m-2.1m)(1.8m-2.0m)， 无芽孢， 荚膜染色呈阳性 ； 在 富集培养基 ( 无氮培养基 ) 上菌落呈乳白色， 圆形， 半透明， 边缘整齐， 表面湿润不易挑取 ； 培养 5d 后有褐色色素产生。 0014 所述富集培养基(无氮培养基)由15g蔗糖、 0.8g KH2PO4、 0.2g MgSO4、 0.2g NaCl、 1g CaCO3、 1mL 质量百分比浓度为 10的 Na2MO4溶液、 1mL H3B。
12、O3溶液、 1mL MnSO4溶液、 1mLFe2SO4溶液和 1000mLH2O 组成， 调 pH 至 6.5-7.0， 于 121灭菌 30min。 0015 参照 伯杰氏细菌鉴定手册 ( 第八版 ) 和 常见细菌系统鉴定手册 对产酸克雷伯 氏菌 (Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 进行生理生化鉴定 ： 产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 淀粉水解试验呈阳性， 脂肪水解试验呈阴性， 明胶水解试验呈阴性， 半固体穿刺呈阴性， H2S 试验呈阴性， 尿素试验呈阳性， 吲哚试验呈阳性， 甲基红试验呈阴性， 伏普试验呈阳性， 柠檬 酸盐试验呈阳性， 尿酶试验呈阳性 ； 。
13、分解蔗糖产酸产气， 分解麦芽糖产酸产气， 分解 D- 山梨 醇产酸产气， 分解鼠李糖产酸产气， 分解甘露醇产酸产气， 分解乳糖产酸产气， 分解海藻糖 产酸产气。产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 的最适生长温度为 37， 最适生长环境的 pH 为 7.00.2。 0016 具体实施方式二 ： 本实施方式产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 从白蚁肠道内筛选得到。筛选按以下步骤进行 ： 一、 制备白蚁匀浆 ： 蚁巢中收集 10 只健康 的白蚁， 用体积浓度为 75的乙醇对白蚁消毒 3 4min， 再用无菌水冲洗 3 次后， 然后切去 头胸部， 将腹部置于已。
14、灭菌的培养皿中 ； 之后， 在无菌条件下将 10 只白蚁的腹部转入已灭 菌的装有0.1mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液的研钵中， 研磨成匀浆， 加入10mL无菌水稀释 成混浊液， 即为白蚁匀浆 ； 同时， 将消过毒的白蚁腹部于计数培养基平板上滚动擦拭， 放入 培养箱培养， 以检验白蚁表面消毒是否彻底 ； 二、 富集培养 ： 用灭菌的移液枪吸取 1mL 白蚁 匀浆装入盛有 30mL 富集培养基 ( 无氮培养基 ) 的 250mL 的三角瓶中， 于 100r/min、 30培 说 明 书 CN 102586131 A 4 3/4 页 5 养 3 5d， 得富集培养后的培养液 ； 三、 平板。
15、分离单菌落 ： 将富集培养后的培养液梯度稀释 至 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7和 10-8， 用移液枪各取 0.1mL 培养液， 无菌操作涂布于平板 培养基上， 30下倒置培养24h。 挑取生长较大及不同形态菌落纯化6次以上， 镜检， 将纯化 的单菌落转至斜面培养基， 4冰箱保存， 即得到变栖克雷伯氏菌 HUB-IV-005。每次试验重 复三次 (n 3)。 0017 本实施方式所述富集培养基(无氮培养基)由15g蔗糖、 0.8g KH2PO4、 0.2g MgSO4、 0.2g NaCl、 1g CaCO3、 1mL 质量百分比浓度为 10的 Na2M。
16、O4溶液、 1mLH3BO3溶液、 1mLMnSO4 溶液、 1mLFe2SO4溶液和 1000mLH2O 组成， 调 pH 至 6.5-7.0， 于 121灭菌 30min。平板培养 基的制备过程为 ： 在富集培养基中加入 2琼脂， 灭菌后， 倒入无菌培养皿中制成平板培养 基。斜面培养基的制备过程为 ： 在富集培养基中加入 2琼脂， 灭菌后， 加入试管中制成斜 面培养基。 0018 本实施方式所述白蚁为黑翅土白蚁 (Odontotermes formosanus)， 取自中国武汉 珞珈山大白蚁亚科的高等培菌白蚁。 0019 对筛选得到的产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 进行分子鉴定， 按。
17、以下步骤进行 ： 一、 提取菌株的总 DNA， 以细菌 16S rDNA 通用引物对所获得的 DNA 进行 PCR 扩增后， 用 1琼脂 糖凝胶电泳 ( 如图 3)。结果可以看出， 在 1600bp 出现特异条带， 条带清晰、 完整， 无 DNA、 RNA 等污染， 此片段与预计的片段条带大小基本吻合。二、 将阳性克隆送南京金斯瑞生物 科技有限公司测序， 产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 的 16SrDNA 序列长度为 1580bp， 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。将产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 的 16S rDNA 基因序列与 GenBank 数 据库中已知细菌 16。
18、S rDNA 基因序列进行比对， 然后利用 MEGA4.1 和 ClustalX 软件绘制 系统进化树， 如图 4 所示， 分析结果表明产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 与产酸克雷伯氏菌 TCCC11019(Klebsiella oxytoca TCCC11019) 的亲缘关系最近， 比对后相似性达 100。通 过结合菌体形态特征、 生长条件、 生理生化鉴定结果确定产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 属于 克雷伯菌属 (Klebsiella)， 为产酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca) 的一株新菌株。 0020 白蚁属于典型的寡氮营养型生物， 主要以富含纤维素、 半纤维。
19、素和木质素等木质 材料为食， 此类食物的含氮量都不高， 但白蚁组织的含氮量与其他动物相似， 因此白蚁具有 从空气中固定 N2并转化为氨的能力。固氮作用是仅限于原核生物才有的现象， 白蚁生活所 必须的氮主要来自其肠道共生固氮微生物的固氮作用， 且白蚁固氮活性的高低与白蚁肠道 内共生微生物的种类和组成有关。白蚁肠道中微生物对其营养具有重要作用， 固氮菌及其 代谢产物可能直接作为白蚁生长的氮源， 这使白蚁得以利用含氮极低的木质食物为生。目 前， 对于白蚁氮营养方面， 还有许多重要问题仍需作进一步研究， 这不仅具有理论意义， 而 且也有一定的应用意义。如果固氮作用是白蚁生命活动必不可少的， 那么就有可。
20、能通过破 坏白蚁的固氮系统， 使白蚁氮素营养不良而死亡， 这不失为是一种值得探索的防治白蚁方 法与途径。 0021 本实施方式的产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 可作为指示菌， 用于研究树木内生菌 发酵产物对白蚁肠道固氮菌的抑制作用， 对于白蚁肠道固氮菌有抑制作用的树木内生菌发 酵产物可以有效的杀灭白蚁。 0022 本试验以产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 为指示菌， 以树木内生菌枯草芽孢杆菌新 亚种 (Bacillus subtilis subsp.lawsoniana subsp.nov)HUB-I-004、 枯草芽孢杆菌新 说 明 书 CN 102586131 A 5 4/4 页。
21、 6 亚种 (Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.nov)HUB-I-047 和罗森桧沙雷氏菌 (Serratia lawsoniana sp.nov)HUB-I-107 为功能菌， 进行抑菌试验。枯草芽孢杆菌新亚 种 (Bacillus subtilis subsp.lawsoniana subsp.nov)HUB-I-004 保藏在中国典型培养 物保藏中心 (CCTCC)， 保藏地址是武汉市武汉大学， 保藏日期为 2009 年 7 月 22 日， 保藏编 号为 CCTCC No ： M 209161 ； 枯草芽孢杆菌新亚种 (Bacillus 。
22、subtilis subsp.virginiana subsp.nov)HUB-I-047 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏地址是武汉市武汉 大学， 保藏日期为 2009 年 7 月 22 日， 保藏编号为 CCTCC No ： M 209162 ； 罗森桧沙雷氏菌 (Serratia lawsoniana sp.nov)HUB-I-107保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏 地址是武汉市武汉大学， 保藏日期为 2009 年 7 月 22 日， 保藏编号为 CCTCC No ： M209163。 0023 试验结果见表 1 所示。可以看出， 树木内生菌的发酵产。
23、物对白蚁肠道固氮菌 - 产 酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 有较好的抑制作用。 0024 表 1 树木内生菌发酵液对产酸克雷伯氏菌 HUB-IV-006 的抑菌圈大小 (mm) 0025 树木内生菌 HUB-IV-006 HUB-I-004 19.21.32 HUB-I-107 17.10.61 HUB-I-047 15.11.05 说 明 书 CN 102586131 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102586131 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102586131 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102586131 A 9 。