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1、(10)申请公布号 CN 102586165 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586165 A *CN102586165A* (21)申请号 201210036210.7 (22)申请日 2012.02.17 CGMCC No. 5516 2011.11.30 C12N 1/21(2006.01) C12P 19/48(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街镇大 学城学园路 2 号福州大学新区 (72)发明人 洪文荣 林玉双 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 3。
2、5100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用 (57) 摘要 本发明属于医药技术领域， 涉及一种灭 活tobS1-C基 因 功 能 的 产 阿 泊 拉 霉 素 的 工 程 菌 及 其 应 用， 所 述 工 程 菌 为 黑 暗 链 霉 菌 （Streptomycestenebrarius） T103， 已 于 2011 年 11 月 30 日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心登记保藏， 保藏编号为 CGMCCNo.5516， 所述的工程菌用于制备抗菌药物。 本发明获得了主产阿泊拉霉素， 不再产生氨甲酰 妥布霉素的工程菌， 简化了生产工艺、 降低了生产。
3、 成本， 同时还方便了产品的质量控制。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 6 页 1/1 页 2 1.一株产阿泊拉霉素的工程菌， 其特征在于， 所述工程菌为黑暗链霉菌 （Streptomyces tenebrarius） T103， 已于 2011 年 11 月 30 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心登记保藏， 保藏编号为 CGMCC No. 5516。 2. 根据权利要求 1 所述的。
4、一株产阿泊拉霉素的工程菌， 其特征在于， 所述黑暗链霉菌 （Streptomyces tenebrarius） T103 是通过灭活妥布霉素生物合成基因簇中tobS1-C基因 功能， 且不产生氨甲酰妥布霉素。 3. 一种如权利要求 1 所述的工程菌的发酵方法， 其特征在于， 菌株 T103 发酵前先用 稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基， 37培养 37d， 挖块接种于种 子培养基， 37摇床培养 18 h， 转速为 180-350rpm ； 然后按 1-10% 接种量转接于发酵培养 基， 37摇床培养 120 h， 转速为 250rpm ； 所述种子培养基 ： 葡萄糖 1-5g。
5、， 玉米淀粉 10-20g， 黄豆饼粉 5-30g， 磷酸二氢钾 0.5-1.0g， 氯化钾 1-5g， 氯化钙 0.5-5.0g， 硫酸镁 0.5-5.0g， 加自来水至 1L ； 发酵培养基 ： 葡萄糖 10-30g， 玉米粉 10-30g， 黄豆饼粉 10-35g， 硫酸镁 1.0-11g， 碳酸钙 1-7g， 鱼粉 4-8g， 硫酸锌 0.1-0.5g， 硫酸铵 1-7g， 玉米淀粉 10-50g， 淀粉酶 0.01-0.50g， 加自来水至 1L， 用氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.0-7.2。 4. 根据权利要求 3 所述的工程菌的发酵方法， 其特征在于， 所述种子培养基 ： 葡萄。
6、糖 5g， 玉米淀粉 10g， 黄豆饼粉 15g， 磷酸二氢钾 0.5g， 氯化钾 1g， 氯化钙 0. 5g， 硫酸镁 5g， 加 自来水至 1L ； 所述发酵培养基 ： 葡萄糖 15g， 玉米粉 20g， 黄豆饼粉 35g， 硫酸镁 11g， 碳酸钙 7g， 鱼粉 6g， 硫酸锌 0.1g， 硫酸铵 7g， 玉米淀粉 20g， 淀粉酶 0.5g， 加自来水至 1L， 用氢氧化 钠溶液调节 pH 至 7.0-7.2。 5. 如权利要求 1 所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102586165 A 2 1/5 页 3 一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用 技术领域 0。
7、001 本发明属于抗生素制药领域， 涉及一种工程菌及其应用， 具体地说， 本发明涉及一 株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用。 背景技术 0002 黑暗链霉菌 （Streptomyces tenebrarius） 是 1967 年美国礼莱公司研究人员从土 壤中分离得到， 该菌株能产生一组抗生素， 称之为暗霉素复合物 （Nebramycins） ， 组分 2 ： 阿 泊拉霉素、 组分 4 ： 氨甲酰卡那霉素 B 和组分 5 ： 氨甲酰妥布霉素三个组分为主组分， 在对各 个因子进行生物学研究时发现这三个组分均有良好的抗菌作用， 且都是重要的原料药。其 中， 阿泊拉霉素是一种对猪痢疾以及沙门氏菌病有效的畜。
8、用氨基糖苷类抗生素。阿泊拉霉 素含有独特的辛二糖结构， 对多种氨基糖苷钝化酶具有灭活作用， 对氨基糖环上不同位置 修饰后所得的衍生物， 可增加母体的抗菌活性， 是黑暗链霉菌产生的特色化合物。 0003 目前， 阿泊拉霉素的生产是从黑暗链霉菌发酵液中层析分离而得。由于暗霉素三 个组分理化性质相近， 要从发酵液中对该三种组分进行逐一分离， 不但层析分离周期长， 收 率低， 料耗大， 污染严重， 工艺复杂， 而且产品质量不稳定。 因此， 长期困扰企业生产， 阻碍了 企业产品生产技术的升级换代， 成了产业化生产的技术瓶颈， 结果是生产成本高， 环境污染 严重， 价格居高不下。 0004 若能获得主产阿。
9、泊拉霉素的稳定菌， 则以上所有问题将迎刃而解， 其所带来的直 接经济效益， 间接社会效益和环境效益等是极其巨大的， 更重要的是给清洁生产， 安全用 药， 提供了可靠保障。 0005 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一株主产阿泊拉霉素的工程菌及其应用。 0007 本发明提供的一株产阿泊拉霉素的工程菌， 所述工程菌为黑暗链霉菌 （Streptomyces tenebrarius） T103， 已于 2011 年 11 月 30 日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心登记保藏， 保藏编号为 CGMCC No. 5516。所述黑暗链霉菌 （Streptomyces tenebrari。
10、us） T103 是通过灭活妥布霉素生物合成基因簇中tobS1-C基因 功能， 且不产生氨甲酰妥布霉素。 0008 本发明还提供了所述工程菌的发酵方法， 具体方法为 ： 菌株 T103 发酵前先用稀释 平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基， 37培养37d， 挖块接种于种子培养 基， 37摇床培养 18 h， 转速为 180-350rpm ； 然后按 1-10% 接种量转接于发酵培养基， 37 摇床培养120 h， 转速为250rpm ； 所述种子培养基 ： 葡萄糖1-5g， 玉米淀粉10-20g， 黄豆饼粉 5-30g， 磷酸二氢钾0.5-1.0g， 氯化钾1-5g， 氯化钙0. 2。
11、5-5.0g， 硫酸镁0.5-5.0g， 加自来水 至1L ； 发酵培养基 ： 葡萄糖10-30g， 玉米粉10-30g， 黄豆饼粉10-35g， 硫酸镁1.0-11g， 碳酸 钙 1-7g， 鱼粉 4-8g， 硫酸锌 0.1-0.5g， 硫酸铵 1-7g， 玉米淀粉 10-50g， 淀粉酶 0.01-0.50g， 说 明 书 CN 102586165 A 3 2/5 页 4 加自来水至 1L， 用氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.0-7.2。 0009 优选地， 所述种子培养基 ： 葡萄糖 5g， 玉米淀粉 10g， 黄豆饼粉 15g， 磷酸二氢钾 0.5g， 氯化钾1g， 氯化钙0.25g，。
12、 硫酸镁5g， 加自来水至1L ； 所述发酵培养基 ： 葡萄糖15g， 玉 米粉 20g， 黄豆饼粉 35g， 硫酸镁 11g， 碳酸钙 7g， 鱼粉 6g， 硫酸锌 0.1g， 硫酸铵 7g， 玉米淀粉 20g， 淀粉酶 0.5g， 加自来水至 1L， 用氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.0-7.2。 0010 本发明还提供了所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。 0011 菌株 T103 的筛选， 主要包括以下几个步骤 ： A.tobS1-C基因置换质粒的构建 ； B. 置换质粒转化黑暗链霉菌 ； C. 转化子的筛选 ； D. 工程菌代谢产物组分的鉴定。 0012 基因置换的方法是， 采用 P。
13、CR 法分别获得tobS1-C基因上下游长度约 1000bp 的片 段， 作为同源交换臂， 将两者同时连接到穿梭载体上， 如 pKC1139 等， 交换臂外插入红霉素 抗性等基因， 如ermE， 作为筛选标记， 便于黑暗链霉菌 DNA 重组后工程菌的筛选， 最终得到 置换质粒 pSH6（图 1） 。 0013 其中转化是以E.coli ET12657(pUZ8002) 介导的结合转移方法。工程菌筛选过程 是首先筛选红霉素抗性 （ermER） 菌株， 获得单交换突变株 （图 1， II， III） ， 无药 （不含红霉素） 传代后再从中筛选红霉素敏感 （ermES） 菌株， 进一步筛选重组的转化。
14、子 T103， 获得双交换突 变株 （图 1， V） 。经发酵， 采用薄层层析法 （TLC 法） 对发酵代谢产物进行初步分析， 锁定目标 菌株， 最后经 HPLC-MS 法对目标工程菌代谢产物的组分进行精确确认。 0014 本发明得到的目标菌株为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius) T103菌株， 已于 2011 年 11 月 30 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏， 简称 CGMCC， 地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏编号为 CGMCC No. 5516。 0015 本发明获得了一株精确阻断了妥布霉素生物合成， 主产阿泊拉霉。
15、素的工程菌， 大 大简化了阿泊拉霉素的生产工艺， 并降低生产成本， 减少环境污染， 同时提高了产品质量， 达到了可大规模生产阿泊拉霉素的目标。 附图说明 0016 图 1 是tobS1-C基因功能同源交换灭活示意图 ： I ： 染色体上基因位置 ； II ： 与染色体上的 B2 端单交换 ； III ： 与染色体上的 B1 端单 交换 ； IV ： 染色体上发生了回复突变 ； V ： 染色体上发生了双交换。 0017 图 2 pSH6 构建流程图。 0018 图 3 是亲株黑暗链霉菌 Tt49 与工程菌黑暗链霉菌 T103 发酵代谢产物的 TLC 比较 分析结果 ： 1为阿泊拉霉素标准品AM 。
16、； 2为野生型菌株黑暗链霉菌Tt49的发酵代谢产物 ； 3为突变 株黑暗链霉菌 T103 发酵代谢产物 ； 4 为氨甲酰妥布霉素标准品 TOB。 0019 图 4 是亲株黑暗链霉菌 Tt49 代谢产物的 HPLC-MS 分析图谱 ： 峰 2 对应分子量 540.2， 是阿泊拉霉素 ； 峰 4 对应分子量为 511.2， 是氨甲酰妥布霉素。 0020 图 5 是工程菌黑暗链霉菌 T103 代谢产物的 HPLC-MS 分析图谱。 说 明 书 CN 102586165 A 4 3/5 页 5 0021 峰2对应的分子量540.2， 是阿泊拉霉素。 未见分子量511.2的氨甲酰妥布霉素。 0022 图。
17、 6 是提取精制得到的阿泊拉霉素产品。峰 3 为阿泊拉霉素， 分子量为 540.3。 0023 具体实施方式 实施例 1 ： 试剂来源 ： pMD19-T 和限制性内切酶等购自 TaKaRa 公司， 质粒 pAGe（含抗性 基因 ermE） 由上海医药工业研究所邵雷博士惠赠， 质粒 pBR322（含有四环素抗性基因） 为 本实验室保存。 0024 本发明主要包括以下主要步骤 ： 1构建tobS1-C基因置换质粒 以 Piepersberg 等公布的妥布霉素生物合成基因簇序列 (GenBank Accession Number AJ810851) 作为参考， 确认出发菌株黑暗链霉菌 Tt49 （。
18、林玉双， 洪文荣， 林烨等氨甲酰妥布 霉素高产菌株选育及其发酵特性研究 J中国抗生素杂志， 2008， 33（7） ： 442-445） 染色 体 DNA 上妥布霉素生物合成基因簇的相似性。然后分别在tobS1-C基因上下游设计两对引 物 P1/P2 和 P3/P4， 以黑暗链霉菌 Tt49 的总 DNA （DNA 提取方法见 ： 白林泉 . 链霉菌基因组 中 DNA 大片段的基因置换与克隆 D. 武汉 ： 华中农业大学， 1998.） 为模板进行 PCR 扩增， 获得两个片段B1和B2， 其长度分别为1165 bp(tobS1基因上游DNA序列)和1200 bp(tobC 基因下游 DNA 。
19、序列 )， 扩增产物依次克隆至 pMD19-T 上， 得重组质粒 pSH1 和 pSH2。 0025 以质粒 pAGe 为模板， P5 和 P6 为引物， 扩增得到红霉素抗性基因 （ermE） ， 克隆到 pMD19-T 上， 得到重组质粒， 命名为 pSH3。 0026 pSH1 经HindIII/XbaI 双酶切， 回收交换臂 B1 片段， 与 pKC1139 经HindIII/XbaI 双酶切回收的大片段进行连接， 筛选得到阳性克隆子， 命名为 pSH4。 0027 pSH2经XbaI/BamHI双酶切， 回收交换臂B2片段， 与pSH4经XbaI/BamHI双酶切回 收的大片段进行连接。
20、， 筛选得到阳性克隆子， 命名为 pSH5。 0028 pSH3经EcoRI单酶切后回收红霉素抗性基因 （ermE）（1748bp） ， 插入pSH5的EcoRI 位点， 筛选得到目标重组阳性克隆子， 命名为 pSH6。构建策略见图 2。 0029 表 1 实施例所涉及的引物 说 明 书 CN 102586165 A 5 4/5 页 6 a Restriction enzyme site are indicated by single underlines. 2置换质粒 pSH6 转化黑暗链霉菌 Tt-49 将置换质粒 pSH6 导入E.coli ET12567 (pUZ8002) 中， 得到。
21、供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002， pSH6)。然后通过结合转移的方法转化黑暗链霉菌 Tt49（林玉双， 洪文荣， 林 烨， 等氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究 J中国抗生素杂志， 2008， 33 （7） ： 442-445） 孢子， 37培养 18h 后， 用含红霉素和萘啶酸 （终浓度分别为 50g mL 和 25g mL） 的水溶液覆盖， 37继续培养 4-5 天长出转化子， 将所获得的ermER转化子在 含有红霉素 (50g mL) 的斜面培养基上 37培养， 筛选红霉素抗性转化子， 挑取一株命 名为黑暗链霉菌 TE49（ pSH6） 。 0030 3双交。
22、换菌株筛选与发酵代谢产物变化的定性检测 将黑暗链霉菌 TE49（ pSH6） 在不含抗生素的平板上连续传三代后， 挑取单菌落分别 点种到无药平板和含药 ( 红霉素 50g/mL) 平板， 筛选到 28 个红霉素敏感erm S 菌株。分 别提取其染色体， 以该染色体作为模板， 设计双交换验证引物 （P7/P8） 进行 PCR 验证后， 得 到 1 株双交换菌株， 命名为黑暗链霉菌 T103（tobS1C） 。对该菌株进行发酵， 过滤收集发 酵液， 滤液通过硅胶GF254薄层层析发现， 该菌株能正常产生阿泊拉霉素， 但未检测到氨甲酰 妥布霉素 （图 3） 。该滤液通过 HPLC-MS 定性检测， 。
23、其 HPLC-MS 图谱见图 5， 峰 2 为阿泊拉霉 素， 分子量为 540.2， 同样未检测到氨甲酰妥布霉素、 氨甲酰卡那霉素 B 组分 ； 亲株黑暗链霉 菌 Tt49 代谢产物的 HPLC-MS 图谱见图 4， 峰 2 是阿泊拉霉素， 分子量为 540.2 ； 峰 3 和峰 4 是氨甲酰妥布霉素， 分子量为 511.2。比较图 4 和图 5 可以看出， 工程菌 T103 不再产生氨甲 酰妥布霉素， 主要产生阿泊拉霉素。 0031 实施例 2 ： 黑暗链霉菌 T103 代谢产物阿泊拉霉素的制备 本发明提供的工程菌 T103 可直接用于生产阿泊拉霉素， 工程菌经发酵后提取代谢产 物， 制备阿。
24、泊拉霉素， 作为抗菌药物。 0032 1. 黑暗链霉菌 T103 工程菌的发酵培养 说 明 书 CN 102586165 A 6 5/5 页 7 种子培养基 ： 葡萄糖 5g， 玉米淀粉 10g， 黄豆饼粉 15g， 磷酸二氢钾 0.5g， 氯化钾 1g， 氯 化钙 0. 5g， 硫酸镁 5g， 加自来水至 1L。 0033 发酵培养基 ： 葡萄糖 15g， 玉米粉 20g， 黄豆饼粉 35g， 硫酸镁 11g， 碳酸钙 7g， 鱼粉 6g， 硫酸锌 0.1g， 硫酸铵 7g， 玉米淀粉 20g， 淀粉酶 0.5g， 加自来水至 1L， 用氢氧化钠溶液调 节 pH 至 7.0-7.2。 003。
25、4 将实例1中步骤3获得的基因工程菌黑暗链霉菌T103进行摇瓶发酵。 发酵前先用 稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基， 37培养 5 天， 挖块接种于种子 培养基 （装量为 30mL 250mL 三角瓶） ， 37摇床培养 18 h( 转速为 250rpm)。按 10% 接种 量转接到发酵培养基 （装量为50mL/250mL三角瓶） ， 37摇床培养120 h(转速为250rpm)。 0035 2. 代谢产物提取精制 A、 粗提 将上述发酵液加 10% 自来水稀释， 再加入盐酸， 酸化至 pH2.03.0， 充分搅拌 4 小时 ； 然 后用氢氧化钠溶液回调至 pH5.06.5， 。
26、投入 732NH4+树脂静态吸附 68 小时。树脂投放量按 5 万 u/mL 左右计算。收集吸附饱和树脂， 用自来水漂洗干净 （无漂浮菌丝体为止） 。饱和树 脂装柱， 用两倍饱和树脂体积的0.5M HCl溶液酸洗饱和树脂， 再用无离子水洗涤至中性， 然 后改用 0.01% 氨水进行碱洗， 当流出液达 pH 9.0 左右时， 串联到等体积的 711 树脂柱上， 改 用 4% 的氨水进行洗脱， 氨水用量为饱和树脂体积的 810 倍， 洗脱时间控制在 810 小时， 收 集洗脱液， 浓缩到原体积的 1/10， 然后于 100水解 4 小时， 过滤， 得水解液。 0036 B、 精制与结晶 水解液用硫。
27、酸调至 pH5.56.0（浓度控制在 2530 万单位 /mL） ， 活性炭脱色至透光度 达 92% 以上， 在搅拌下， 缓慢向浓缩液中滴加入 95% 以上乙醇， 进行结晶， 时间 34 小时， 之 后经固液分离， 85%乙醇溶液淋洗干净， 即得湿成品。 湿成品经真空干燥 （真空度500mmHg以 上， 温度 600， 干燥 6 小时） ， 即得硫酸阿泊拉霉素成品， 收率 80% 以上。经 HPLC-MS 分析， 与阿泊拉霉素同质， 其结果见图 6。 0037 说 明 书 CN 102586165 A 7 1/3 页 8 福州大学 一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用 8 PatentIn ver。
28、sion 3.3 1 24 DNA 人工序列 1 aagcttggag ctggtcggca aggt 24 2 25 DNA 人工序列 2 ttctagatcg gtcgtgatct cctca 25 3 25 DNA 人工序列 3 tctagatgct catcgtggac ggcca 25 4 24 DNA 序 列 表 CN 102586165 A 8 2/3 页 9 人工序列 4 ggatccttga ggcagacggg gtcg 24 5 26 DNA 人工序列 5 gaattcccta ggcctattaa tattcc 26 6 26 DNA 人工序列 6 gaattcatag。
29、 ttctagaggt accagc 26 7 21 DNA 人工序列 7 gagcgcctac tacttctccg g 21 8 18 DNA 人工序列 8 序 列 表 CN 102586165 A 9 3/3 页 10 ttcggagaag gcgtgcac 18 序 列 表 CN 102586165 A 10 1/6 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102586165 A 11 2/6 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586165 A 12 3/6 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102586165 A 13 4/6 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 102586165 A 14 5/6 页 15 图 5 说 明 书 附 图 CN 102586165 A 15 6/6 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 102586165 A 16 。