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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610064633.8 (22)申请日 2016.01.30 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 令世鑫 地址 730000 甘肃省兰州市城关区西北新村 1 号西北民族大学生物工程实验室 申请人 马忠仁 马祺 乔自林 (72)发明人 令世鑫 马祺 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代理人 吕玉博 (54) 发明名称 一种全悬浮培养 MDCK 细胞的低血清培养基 (57) 摘要 本 发 明 提 供 一 种 全 悬 浮 培 养 MDCK 细 胞 的 低 血 清 培 养 基， 所 述。
2、 培 养 基 由 含 氯 化 钠 5000-6500mg/L 的 DMEM/F12 培 养 基 和 以 下 组 分 组 成 ： 氯 化 镍 NiCl26H2O、 七 钼 酸 铵 (NH4)6Mo7O24.4H2O、 氯化亚锡 SnCl22H2O、 偏钒酸 铵 NH4VO3、 硅酸钠 Na2SiO39H2O、 维生素 A、 维生素 E、 人转铁蛋白、 重组胰岛素、 谷胱甘肽、 亚硒酸钠、 植物蛋白水解物、 重组人血白蛋白、 PF68。在本发 明的培养基中加入体积百分含量为 3-5% 的新生 牛血清， 接种 MDCK 细胞， 能提高细胞密度， 使其增 至 4.21106/ml， 此时， 细胞活力仍。
3、达 92.3%。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 105567628 A 2016.05.11 CN 105567628 A 1.一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基， 其特征在于： 所述培养基由含氯化钠 5000-6500mg/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成： 氯化镍NiCl26H2O0.000195mg/L 七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O0.00124mg/L 氯化亚锡SnCl22H2O0.000095mg/L 偏钒酸铵NH4VO30.000585mg/L 硅酸钠Na2。
4、SiO39H2O 0.061mg/L 维生素A0.1-0.2mg/L 维生素E0.05-0.1mg/L 人转铁蛋白5-10mg/L 重组胰岛素10-20mg/L 谷胱甘肽0.1-0.5mg/L 亚硒酸钠0.003-0.006mg/L 植物蛋白水解物2000-2500mg/L 重组人血白蛋白200-300mg/L PF68800-1200mg/L。 2.权利要求1所述的一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方法， 其特征在 于： 是将脂溶性原料乳化冻干后与其它原料混合， 磨细即得。 3.权利要求1所述的一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方法， 其特征在 于： 将脂溶性原料乳化。
5、后 （不需要冻干） 与其它原料依次溶解于注射用水， 然后每升加入 2200mgNaHCO3， 最后用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2。 4.权利要求1所述的培养基在MDCK细胞全悬浮培养中的应用。 5.应用权利要求1所述的培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法， 其特征在于： 在配制好的 培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清。 6.MDCK细胞全悬浮培养的方法， 其特征在于： 是在权利要求1的培养基中加入体积百分 含量为3-5%的新生牛血清， 接种MDCK细胞， 在37， 110rpm的转速下摇床培养。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105567628 A 2 一种全悬。
6、浮培养MDCK细胞的低血清培养基 技术领域 0001 本发明属于生物制品技术领域， 具体涉及一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养 基。 背景技术 0002 近几年流感 （禽流感） 大面积爆发， 严重影响了人和禽类动物的健康， 接种疫苗仍 是目前预防流感 （禽流感） 的最主要手段。 传统流感疫苗的生产运用鸡胚培养法， 该方法存 在培养过程微生物污染几率高、 产品内毒含量高、 注射副反应大、 废物有环境污染处理成本 高、 流感大流行爆发时鸡胚供应困难和生产周期长等工艺缺点， 开发动物细胞基质的疫苗 流感势在必行。 0003 MDCK细胞(Madin-Darbycaninekidneycells)。
7、是从犬肾组织中分离培养获得 的上皮样贴壁传代细胞， 该细胞培养工艺相对简单、 生长快且对流感病毒敏感， 是目前生产 流感疫苗常用的细胞系之一。 传代细胞的规模化培养方式经历了转瓶培养、 微载体培养、 片 状载体培养和单细胞悬浮培养等过程。 0004 悬浮培养一般指的是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式， 是细胞经过驯化后可完 全悬浮于培养基中生长或维持。 由于细胞本身的特性， 有的细胞有很容易驯化成悬浮培养 型的， 也有部分细胞是很难驯化成功的。 由于MDCK细胞已具有商业前景， 近年来研究人员进 行了大量驯化研究， 1997年， 美国AlbrechtGroner等人将MDCK细胞接种入转瓶中并调。
8、整转 速为16rpm(正常速率为3rpm)， 使细胞不能有效的贴附到瓶壁上而悬浮于培养基中生长， 利 用此法连续传代培养便可得到MDCK悬浮细胞系， 且该细胞对流感病毒敏感， 此后有关MDCK 悬浮培养的研究和应用的报道很多， 欧洲诺华公司和美国医学免疫学公司已经有MDCK细胞 基质的流感疫苗上市， 取代了传统鸡胚工艺。 据报道， 在我国已有多株驯化的可全悬浮培养 的MDCK细胞， 但是批培养的密度都不高， 大多在2.0106/mL左右， 其主要原因还是没有相 应配套的全悬浮培养的培养基， 实际应用中许多用户高价买来的无血清培养中加3-5%的新 生牛血清才能正常培养细胞。 无血清培养基配方中要。
9、添加大量血清替代物如： 重组人表皮 细胞生长因子、 氢化可的松、 胰岛素、 前列腺素和甲状腺素等激素， 这些添加物的价格通常 是血清价格的好多倍。 本发明提供一种以DMEM/F12为基础的低血清培养基， 使用时添加3- 5%新生牛血清， 价格低， 配制简单， 能很好的支持MDCK细胞的全悬浮培养。 发明内容 0005 本发明提供了一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基， 价格低廉， 配制方法简 单， 应用其培养MDCK细胞， 细胞密度能够大大提高。 0006 本发明的第一个目的是提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基， 本申请人 经试验发现， 在DMEM/F12培养基中直接添加支持MD。
10、CK细胞低血清培养的添加物时会增加培 养基的渗透压， 从而影响细胞生长。 因此， 本申请人以DMEM/F12培养基配方 （Gibco公司,货 号： 12500） 为基础培养基， 在此基础上添加添加物， 并在pH缓冲盐碳酸氢钠2200mg/L的情况 说明书 1/8 页 3 CN 105567628 A 3 下， 将基础培养基中氯化钠含量由6996mg/L降至5000-6500mg/L， 此时渗透压为280- 310mmol/kg， 具体的添加物如下：（mg/L） 氯化镍NiCl26H2O0.000195 七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O0.00124 氯化亚锡SnCl22H2O0.00。
11、0095 偏钒酸铵NH4VO30.000585 硅酸钠Na2SiO39H2O0.061 维生素A0.1-0.2 维生素E0.05-0.1 人转铁蛋白5-10 重组胰岛素10-20 谷胱甘肽0.1-0.5 亚硒酸钠0.003-0.006 植物蛋白水解物 （HyPep1510） 2000-2500 重组人血白蛋白200-300 PF68800-1200。 0007 其中， 氯化镍、 七钼酸铵、 氯化亚锡、 偏钒酸铵、 硅酸钠和亚硒酸钠为细胞补充微量 元素， 细胞在低血清时增加细胞的代谢功能， 维持细胞的活性。 0008 维生素A和维生素E为脂溶性维生素， 维生素A有增强细胞免疫功能的作用， 维生 。
12、素E的主要作用是作为抗氧化剂， 它能阻止游离基的积累， 增加细胞代谢， 提高细胞活性。 0009 转铁蛋白能结合铁离子， 减少其毒性和被细胞生长所利用。 0010 重组胰岛素可促进糖和氨基酸的转运， 提高合成代谢降低分解代谢， 刺激细胞生 长。 0011 谷胱甘肽由谷氨酸、 半胱氨酸和甘氨酸结合， 含有巯基的的三肽， 具有抗氧化作用 和整合解毒作用， 还参与生物转化作用， 从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质， 增加 细胞活性。 0012 植物蛋白水解物主要是小分子肽和氨基酸组成， 为细胞的主要营养物质。 0013 重组人血白蛋白作为细胞的营养物质， 也是激素、 脂类等物质的转运载体， 还有。
13、调 节pH值和维持渗透压的作用。 0014 PF68为表面活性剂， 主要是提高细胞悬浮培养时的抗剪切力， 增加细胞活性。（在 脂溶性物质溶解乳化时起乳化剂的作用， 量少在总配方中忽略此量） 。 0015 本发明的第二个目的是提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方 法， 是将脂溶性原料乳化冻干后与其它原料混合， 磨细即得。 0016 使用时， 用注射用水溶解,每升加2200mgNaHCO3， 用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值 至7.1-7.2。 0017 本发明的第三个目的是提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方 法， 将脂溶性原料乳化后 （不需要冻干） 与其它原料依。
14、次溶解于注射用水， 然后每升加入 2200mgNaHCO3， 最后用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2。 0018 本发明的第四个目的是提供上述培养基在MDCK细胞全悬浮培养中的应用。 说明书 2/8 页 4 CN 105567628 A 4 0019 本发明的第五个目的是提供应用上述的培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法， 在配 制好的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清。 0020 本发明的第六个目的是在权利要求1的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生 牛血清， 接种MDCK细胞， 在37， 110rpm的转速下摇床培养。 0021 本发明的培养基价格低廉， 配制方。
15、法简单； 在本发明的培养基中加入体积百分含 量为3-5%的新生牛血清， 接种MDCK细胞， 能提高细胞密度， 使其增至4.21106/ml， 此时， 细 胞活力仍达92.3%。 附图说明 0022 附图用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与本发明的实 例一起用于解释本发明， 并不构成对本发明的限制。 在附图中： 图1为应用本发明的培养基悬浮培养MDCK细胞， 细胞生长情况图； 其中， 图A为MDCK细胞 初培养时细胞生长情况图； 图B为MDCK细胞培养96小时后的细胞生长情况图。 具体实施方式 0023 以下的实例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的。
16、实验方 法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为市 售。 0024 材料来源： 培养基和血清： DMEM/F12(Gibco公司,货号： 12500)； 新生牛血清 （兰州民海生物工程有 限公司， 批号： 20141028） ； 氨基酸： L-丙氨酸， L-精氨酸， L-天冬酰胺， L-天冬氨酸， L-胱氨酸， L-谷氨酸， L-谷氨酰 胺， 甘氨酸， L-组氨酸， L-异亮氨酸， L-亮氨酸， L-赖氨酸， L-蛋氨酸， L-苯丙氨酸， L-脯氨酸， L-丝氨酸， L-苏氨酸， L-色氨酸， L-酪氨酸， L-缬氨酸， L-胱氨酸， 以上均采购。
17、自Solarbio公 司； 维生素： 氯化胆碱， 次黄嘌呤钠， 烟酰胺， 泛酸， 盐酸腐胺， 盐酸吡哆醇， 盐酸硫胺素， 胸 苷， 维生素B12， D-生物素， 叶酸， 核黄素， 维生素A， 维生素E， 亚油酸， 硫辛酸， 均为Sigma公司 生产； 碳水化合物： D-葡萄糖， 购自国药集团； 生长因子/激素： 重组胰岛素， 人转铁蛋白， 均为Sigma公司生产； 植物蛋白水解物： HyPep1510， Sheffield公司生产； 其它： 谷胱甘肽， 吐温-80 （均为Sigma公司生产） ； PF-68 （Gibco生产， 89-5080IP） ； 化学试剂为国产分析纯。 0025 实施例。
18、1 本发明的全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的配方如下， 默认单位： mg/L； 其中， 下 划线部分为DMEM/F12培养基成分： 1） 无机盐和微量元素： 氯化钙CaCl2116.6 氯化钾KCl 311.8 说明书 3/8 页 5 CN 105567628 A 5 硫酸镁MgSO4 48. 84 无水磷酸氢二钠Na2HPO4 71.02 磷酸二氢钠NaH2PO4-H2O 62.5 氯化镁MgCl2 28.64 硫酸铜CuSO45H2O 0.0013 硝酸铁Fe(NO3)39H2O 0.05 硫酸亚铁FeSO47H2O 0.417 硫酸锌ZnSO47H2O 0.432 丙酮酸钠C3H3。
19、NaO3 55 氯化镍NiCl26H2O 0.000195 七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.00124 氯化亚锡SnCl22H2O 0.000095 偏钒酸铵NH4VO3 0.000585 硅酸钠Na2SiO39H2O 0.061 亚硒酸钠Na2SeO30.005 氯化钠NaCl6400 2） 氨基酸 L-丙氨酸4.45 L-精氨酸147.5 L-天冬酰胺7.5 L-天冬氨酸6.65 L-胱氨酸盐酸盐31.29 L-半胱氨酸17.56 L-谷氨酸7.35 L-谷氨酰胺365 甘氨酸18.75 L-组氨酸盐酸盐31.48 L-异亮氨酸54.47 L-亮氨酸59.05 L-赖氨酸盐。
20、酸盐91.25 L-蛋氨酸17.24 L-苯丙氨酸35.48 L-脯氨酸17.25 L-丝氨酸26.25 L-苏氨酸53.45 L-色氨酸9.02 L-酪氨酸55.79 L-盐缬氨酸52.86 3） 水溶性维生素：（直接添加） 说明书 4/8 页 6 CN 105567628 A 6 D-生物素 0.0035 泛酸钙 2.24 氯化胆碱 8.89 叶酸 2.65 肌醇 12.6 烟酰胺 2.02 吡哆醇盐酸盐 2.013 核黄素 0.219 硫胺素盐酸盐 2.17 维生素B1 0.68 4)脂溶性材料：（通过乳化后使用， 配制1000L干粉） 亚油酸0.042mg/L1000L=42mg 硫辛。
21、酸0.105mg/L1000L=105mg 腐胺0.081mg/L1000L=81mg 维生素A 0.14mg/L1000L=140mg 维生素E 0.06mg/L1000L=60mg 脂溶性材料乳化方法： 取2.5ml吐温-80至50ml无水乙醇中， 充分搅拌至完全溶解， 将配 方量的亚油酸、 硫辛酸、 腐胺、 维生素A、 维生素E依次加入， 待每种物质完全溶解后再加入另 一种物质， 得到脂溶性维生素混合物。 另取一烧杯中加入60ml注射用水， 先打开磁力搅拌 器， 缓慢加入10gPF68干粉， 保证加入的完全溶解后再加入少量继续搅拌至10g完全溶解。 溶 解过程中搅拌速度不要太快， 尽量避。
22、免产生太多泡沫。 PF68干粉全部加完后， 定容至100ml， 混合均匀。 将配制好的脂溶性维生素混合物与PF68超声波乳化， 冻干后按所配干粉的比例 加入。 0026 5)其它添加物： 胸苷 0.365 次黄嘌呤 2.39 葡萄糖 3151 人转铁蛋白7.5 重组胰岛素10 谷胱甘肽0.5 植物蛋白水解物2000 重组人血白蛋白250 PF681000 酚红8.1 （pH指示剂） 将上述组分制备粉剂培养基： 将所有材料 （脂溶性材料乳化后冻干） 混合后磨细即得。 使用时按常规方法用注射用水溶解， 加NaHCO32200mg/L， 调pH值至所需值、 除菌过滤即可使 用。 0027 将上述组分。
23、制备液体培养基： 将上述所有材料依次溶解， 脂溶性材料乳化后不需 要冻干可直接使用， 最后加入NaHCO32200mg/L， 调pH值至所需值、 除菌过滤即可使用。 说明书 5/8 页 7 CN 105567628 A 7 0028 实施例2 本实施例与实施例1的不同之处在于： 培养基中： 亚硒酸钠0.004mg/L 氯化钠NaCl6500mg/L 维生素A0.1mg/L 维生素E0.1mg/L 人转铁蛋白5mg/L 重组胰岛素20mg/L 谷胱甘肽0.3mg/L 植物蛋白水解物2250mg/L 重组人血白蛋白200mg/L PF68800mg/L。 0029 培养基其余组分和培养基的制备方法。
24、均与实施例1相同。 0030 实施例3 本实施例与实施例1的不同之处在于： 培养基中： 亚硒酸钠0.003mg/L 氯化钠NaCl 5000mg/L 维生素A0.2mg/L 维生素E0.08mg/L 人转铁蛋白10mg/L 重组胰岛素15mg/L 谷胱甘肽0.1mg/L 植物蛋白水解物2500mg/L 重组人血白蛋白300mg/L PF681200mg/L。 0031 培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。 0032 实施例4 本实施例与实施例1的不同之处在于： 培养基中： 亚硒酸钠 0.006mg/L 氯化钠NaCl 5500mg/L 维生素A0.12mg/L 维生素E0.05m。
25、g/L 人转铁蛋白6mg/L 重组胰岛素12mg/L 谷胱甘肽0.2mg/L 植物蛋白水解物2400mg/L 说明书 6/8 页 8 CN 105567628 A 8 重组人血白蛋白260mg/L PF68900mg/L。 0033 培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。 0034 实施例5 本实施例与实施例1的不同之处在于： 培养基中： 亚硒酸钠 0.005mg/L 氯化钠NaCl 5800mg/L 维生素A0.18mg/L 维生素E0.07mg/L 人转铁蛋白9mg/L 重组胰岛素17mg/L 谷胱甘肽0.4mg/L 植物蛋白水解物2100mg/L 重组人血白蛋白230mg/L。
26、 PF681100mg/L。 0035 培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。 0036 实施例6应用本发明的培养基悬浮培养MDCK悬浮细胞的实验 一、 材料 1细胞 MDCK悬浮细胞， 甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。 0037 2设备 CO2培养箱 （美国Thermo3111） ， 普通显微镜 （日本Olympus， CX21） ， 倒置相差显微镜 (日本OLYMPUSCKX41+DP72)， 细胞计数仪 （美国， INNOVATIS， CASYTT） ， 摇床 （上海智诚分 析仪器制造公司， ZHWY-2102C） 和电子天平 （上海， 梅特勒托利多上海总公司， AR21。
27、40） 等。 0038 二、 细胞培养测试 在配制好的液体培养基中加入3-5%新生牛血清 （V/V） 进行MDCK悬浮测试,细胞以75 104/ml密度接种， 摇床37， 110rpm， 每24小时抽样计数。 表1-5为测试结果。 0039 表1实施例1配方细胞培养测试结果 （加5%新生牛血清） 表2实施例2配方细胞培养测试结果 （加5%新生牛血清） 说明书 7/8 页 9 CN 105567628 A 9 表3实施例3配方细胞培养测试结果 （加4%新生牛血清） 表4实施例4配方细胞培养测试结果 （加3%新生牛血清） 表5实施例5配方细胞培养测试结果 （加3%新生牛血清） 由表1-5可以看出，。
28、 本发明的培养基能够很好的支持MDCK细胞的全悬浮生长， 生长96小 时后， 细胞密度最高可达4.21106/ml， 此时细胞活力为92.3%。 0040 最后应说明的是： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的 保护范围之内。 说明书 8/8 页 10 CN 105567628 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 105567628 A 11 。