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1、(10)申请公布号 CN 102719413 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102719413 A *CN102719413A* (21)申请号 201210132277.0 (22)申请日 2012.04.28 C12N 9/18(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 刘玉焕 姚健 范新炯 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限。
2、公司 44202 代理人 郝传鑫 (54) 发明名称 一种新型单宁酶及其应用 (57) 摘要 本发明公开一种新型单宁酶， 其氨基酸序列 如 SEQ ID NO.3 所示 ； 本发明还公开了所述新型 单宁酶的cDNA， 所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。本发明还公开了含有上述新型单宁酶 cDNA 的表达载体、 重组单宁酶及其制备方法， 以 及所述重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、 单宁酸、 素儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素没食子酸 酯、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。所 述新型单宁酶及重组单宁酶在大肠杆菌表达体系 中具有高效的可溶性表达， 且该重组单宁酶对单 宁酸。
3、、 表儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素没食 子酸酯、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯等具有高 效降解作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种新型单宁酶， 其特征在于， 所述单宁酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。 2. 如权利要求 1 所述的新型单宁酶的 cDNA， 其特征在于， 所述 cDNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 3. 如权利要求 1 所述新型。
4、单宁酶的宏基因组学克隆方法， 其特征在于， 包含以下步骤 ： 提取海洋淤泥总 DNA 并纯化， 将纯化后的总 DNA 经 BamHI 酶切处理后， 连接到 pUC118 载体 上， 电击转化导入大肠杆菌 DH5 中建立宏基因组文库， 通过高通量筛选得到阳性克隆子， 经测序和 BLAST 比较并设计引物， 从而克隆到目的片段。 4. 一种包含如权利要求 2 所述的新型单宁酶的 cDNA 的表达载体。 5. 一种重组单宁酶的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 用权利要求 4 所述的表达 载体转化寄主细胞， 培养转化体， 从培养物中获得重组单宁酶。 6. 如权利要求 5 所述的重组单宁酶的制。
5、备方法， 其特征在于， 所述寄主细胞是大肠杆 菌。 7. 如权利要求 6 所述的重组单宁酶的制备方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤 ： 用权 利要求 4 所述的目的片段经 BamHI 和 HindIII 双酶切， 与 pET-28a(+) 载体连接， 转化至大 肠杆菌 BL21， 经 IPTG 诱导， 得到高效可溶性表达。 8. 如权利要求 7 所述的重组单宁酶的制备方法， 其特征在于， 所述的 IPTG 终浓度为 0.4mM， 诱导温度为 25。 9. 一种采用如权利要求 5 所述方法制备得到的重组单宁酶。 10. 如权利要求 9 所述的重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、 单宁酸、 素儿茶素。
6、没食子酸 酯、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102719413 A 2 1/7 页 3 一种新型单宁酶及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 具体涉及一种从海底淤泥宏基因组文库中分离筛选到 的一个新型单宁酶基因、 异源表达及其应用。 背景技术 0002 在茶饮料的生产过程中， 茶叶的高温提取液冷却后会变浑浊， 并产生絮状沉淀 (茶乳酪)， 这严重影响了茶饮料的口感和香气。 茶乳酪的形成过程为 ： 温度较高时， 茶提取 液中的茶多酚及其氧化物、 咖啡碱、 蛋白质以及脂质等物质均以游离态存在， 随着温度的降 低， 。
7、茶汤中多酚类 ( 尤其是茶黄素、 茶红素及没食子酸酯等 ) 分别与咖啡碱的酮氨基、 蛋白 质的肽基氢键结合形成络合物， 逐渐发生凝聚而沉淀下来。 在茶饮料生产过程中， 需要采取 物理、 化学或酶处理的方法来消除茶乳酪或使之形成可溶物。用来去除 “茶乳酪” 的方法有 物理法、 化学法和酶法。其中， 由于酶法较物理法和化学法具有经济、 高效和无二次污染等 优点， 成为当今的主要研究热点。 0003 近些年来， 利用纯培养技术已从环境中筛选到能产生单宁酶的微生物， 但种类非 常有限， 主要集中在真菌类的曲霉属、 青霉属和根霉属， 并且筛选到的这些微生物酶量极 少， 酶活性也不高， 造成生产成本的增加。
8、。于是， 有研究者从已筛选到的这些微生物中 ( 如 米曲霉和植物乳酸杆菌 ) 克隆单宁酶基因， 然后将其在工程菌中表达。但是， 这些重组降解 酶的稳定性较差， 在实际应用中有一定的局限性。 到目前为止， 所有的关于单宁酶的研究都 是针对于环境中可培养微生物来展开的。 我们知道， 环境中蕴藏着大量的微生物资源， 并且 这些微生物中超过 99的微生物难以通过传统的微生物分离培养的方式进行研究， 所以， 传统的微生物分离培养技术已经大大的限制了人们对可产生单宁酶的微生物自愿的利用 和开发。 宏基因组学的出现， 则解决了这方面的问题， 因为它避开了环境微生物分离培养的 难题， 直接从环境样品中提取基因。
9、组总 DNA， 建立宏基因组文库， 进而从中筛选新的基因或 生物活性物质。宏基因组文库包含了环境中所有的 ( 可培养的和不可培养的 ) 微生物遗传 信息， 因此， 在挖掘和利用环境中那些不可培养微生物资源方面， 有着巨大的潜力， 已成为 当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。 至今国内外学者已经通过该技术从环境中成 功的筛选到了如淀粉酶、 木聚糖酶、 蛋白酶、 纤维素酶、 酯酶 / 脂肪酶等新基因， 并且这些酶 具有一些新酶学特性及工业应用潜力。到目前为止， 尚未利用宏基因组技术从环境中筛选 单宁酶基因的研究报道。 发明内容 0004 本发明的第一个目的提供一种新型单宁酶及所述新型单宁酶的 。
10、cDNA。 0005 本发明的第二个目的是提供一种上述新型单宁酶的宏基因组学的克隆方法。 0006 本发明的第三个目的是提供一种含有上述单宁酶 cDNA 的表达载体。 0007 本发明的第四个目的是提供一种利用上述表达载体构建的重组单宁酶及其制备 方法， 以及所述重组单宁酶的应用。 说 明 书 CN 102719413 A 3 2/7 页 4 0008 为实现本发明的第一个目的， 采取的技术方案为 ： 一种新型单宁酶， 所述单宁酶的 氨基酸序列如如 SEQ ID NO.3 所示。 0009 一种上述新型单宁酶的 cDNA， 所述 cDNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 001。
11、0 为实现本发明的第二个目的， 采取的技术方案为 ： 一种上述新型单宁酶的宏基 因组学克隆方法， 包含以下步骤 ： 提取南海海洋淤泥总 DNA 并纯化， 将纯化后的总 DNA 经 BamHI酶切处理后， 连接到pUC118载体上， 电击转化导入大肠杆菌DH5中建立宏基因组文 库， 通过高通量筛选得到阳性克隆子， 经测序和 BLAST 比较并设计引物， 从而克隆到目的片 段。 0011 为实现本发明的第三个目的， 采取的技术方案为 ： 一种包含如上所述的新型单宁 酶的 cDNA 的表达载体。 0012 为实现本发明的第四个目的， 采取的技术方案为 ： 一种重组单宁酶的制备方法， 包 括以下步骤 。
12、： 用权利要求 4 所述的表达载体转化寄主细胞， 培养转化体， 从培养物中获得重 组单宁酶。 0013 优选地， 上述所述重组单宁酶的制备方法中， 所述寄主细胞是大肠杆菌。 0014 优选地， 所述重组单宁酶的制备方法具体包括以下步骤 ： 用权利要求 4 所述的目 的片段经BamHI和HindIII双酶切， 与pET-28a(+)载体连接， 转化至大肠杆菌BL21， 经IPTG 诱导， 得到高效可溶性表达。 0015 优选地， 上述所述重组单宁酶的制备方法中， 所述的 IPTG 终浓度为 0.4mM， 诱导温 度为 25。 0016 一种采用如上所述方法制备得到的重组单宁酶。 0017 一种上。
13、述所述的重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、 单宁酸、 素儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。 所述重组单宁酶对 儿茶素及其它底物有降解作用。 0018 本发明的有益效果为 ： 0019 (1) 本发明从海底淤泥宏基因组文库中筛选到一个单宁酶基因， 通过基因工程技 术对其功能研究， 发现该基因在大肠杆菌中高效可溶表达， 经蛋白纯化及 SDS-PAGE 电泳， 得到一条单一的蛋白条带， 减去融合蛋白， 初步确定该单宁酶的分子量约为 54kDa。 0020 (2)本发明将SEQ ID NO.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上， 转化大肠杆菌 感受态。
14、细胞， 通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白， 研究其酶学性质， 结果如下 ： 0021 在大肠杆菌表达体系中， 该重组蛋白具有高效可溶性表达。 0022 以没食子酸丙酯为底物， 测的重组蛋白的最适反应温度为 30， 在温度低于 45时较为稳定， 45保温12h仍保有75的相对酶活性 ； 最适反应pH为6.4， 在中性或弱 酸性条件下保存稳定 ； 4M 的 NaCl 对其酶活性没有影响， 表现出较高的耐盐性 ； 测定金属离 子和生化试剂对酶活力影响时发现， 1mMCa2+、 Cd2+和 Mg2+对其酶活性有激活作用， 1mM Mn2+、 Cu2+、 Zn2+、 Co2+、 A13+、 EDT。
15、A、 尿素和 Triton X-100 对其酶活性没有明显的影响， 而 1mM Ag+、 Cr2+、 - 巯基乙醇、 Tween 80 和 PMSF 对其的酶活性有强烈的抑制作用。 0023 (3) 本发明在研究重组单宁酶以 0.5mg/mL 没食子酸丙酯、 单宁酸、 表儿茶素没食 子酸酯、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯为底物的降解作用 时， 经 HPLC 分析发现， 30条件下， 经过 40min 后， 单宁酸、 表儿茶素没食子酸酯、 表没食子 说 明 书 CN 102719413 A 4 3/7 页 5 儿茶素没食子酸酯、 绿原酸和阿魏酸乙酯已经完全水解， 大。
16、约有 88的迷迭香酸被水解。 附图说明 0024 图 1 为本发明实施例 1 中的 SDS-PAGE 电泳图。 0025 图 1 中， M 为标准蛋白分子量 maker， 1 为重组蛋白粗提物， 2 为纯化的重组蛋白。 0026 图 2 为温度对重组单宁酶酶活性的影响图。 0027 图 3 为温度对重组单宁酶稳定性的影响图 ( 代表 25 ； 代表 35 ； 代表 45 ； 代表 50 ； 代表 55 )。 0028 图 4 为 pH 对重组单宁酶酶活性的影响图。 0029 图 5 为 pH 对重组单宁酶稳定性的影响图 ( 代表 pH 为 5.0 ； 代表 pH 为 6.0 ； 代表pH为7.。
17、0 ； 代表pH为8.0 ； 代表pH为9.0 ； 代表pH为10.0 ； 代表pH为11.0)。 0030 图 6 为 NaCl 对 Tan410 酶活性的影响图。 0031 图 7 为没食子酸丙酯、 单宁酸、 表儿茶素没食子酸酯 (ECG)、 表没食子儿茶素没食 子酸酯 (EGCG)、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯降解的 HPLC 分析图。 具体实施方式 0032 为更好的说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面结合附图和具体实施例对本 发明作进一步描述。 0033 实施例 1 宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、 基因克隆与表达 0034 1、 基因组 DNA 的提取 0035 (。
18、1) 取海底淤泥样品 4g， 放入 50ml 无菌离心管中 ； 0036 (2) 加入 13.5ml DNA 提取液 buffer， 37， 220r/min 摇床震荡 30min ； 0037 (3) 加入 1.5ml 20 SDS ； 0038 (4)65水浴 2h， 期间每隔 20min 上下轻轻颠倒离心管几次， 混匀 ； 0039 (5)6000g， 4离心 10min ； 0040 (6) 取上清， 加入等体积的氯仿， 上下轻轻颠倒几次 ； 0041 (7)16000g， 4离心 10min ； 0042 (8) 重复 (6)、 (7) 步骤两次 ； 0043 (9) 取上清， 加入。
19、 0.6v 的异丙醇， 轻轻混匀后， 室温放置 1-2h ； 0044 (10)16000g， 4离心 20min ； 0045 (11)75的乙醇洗涤两次 ； 0046 (12) 风干后 ddH2O 重悬。 0047 2、 试剂盒法纯化 DNA ： 按照胶回收试剂盒说明书进行。 0048 3、 宏基因组电泳检测 ： 用 1琼脂糖凝胶电泳检测总 DNA 的纯度和质量 0049 4、 酶切基因组总DNA ： 用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA， 回收3-10kb的酶切 片段， 方法同试剂盒法纯化 DNA。 0050 5、 酶切片段的电泳检测 ： 方法同宏基因组电泳检测。 0051 6、 克。
20、隆载体的构建及转化 ： 将回收得到的酶切片段和 pUC118/BamHI(BAP) 载体连 接过夜， 连接产物用 PCR 产物纯化试剂盒进行纯化后与电转化感受态细胞混合， 冰上放置 说 明 书 CN 102719413 A 5 4/7 页 6 5min， 转移 DNA/ 细胞混合物至预冷的 2mm 电穿孔容器 ( 无泡 ) 中， 对电穿孔容器进行脉冲 (2， 500V)( 检查时间常数， 应该在 4 以上 )， 立即添加 900L 的 LB 至电穿孔容器中， 37， 200r/min， 震荡培养 45min， 转化产物涂布到含有 100g/mL 氨苄青霉素 (Amp)， 0.5mM 异丙 基 。
21、-D- 硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG) 和 100M 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 半乳糖苷 (X-Gal) 的平板上， 平板倒置放入 37培养箱中， 培养 16-20h。由此构建了一个库容量达 96000 个转化子、 多样性好的宏基因组文库。 0052 7、 文库筛选和阳性克隆子的鉴定 0053 (1) 单宁酶基因的初步筛选 0054 将文库中的所有白色转化子转移到含有底物 (X-caprylate) 筛选培养基上 ； 37 培养 48h 后， 挑取在筛选培养基上产生蓝色水解圈的克隆子。 0055 (2) 单宁酶基因的复筛 0056 挑取在筛选培养基上产生蓝色水解圈的克隆子，。
22、 接种到 10ml 含有 100g/mLAmp、 0.5mM IPTG 的 LB 培养基中， 37， 220r/min 过夜培养， 12000g， 离心 1min 收集菌体， 磷酸 盐缓冲液 (100mM， pH 6.8) 洗涤菌体一次， 离心收集菌体， 磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体， 超 声波破碎菌体， 离心收集上清 ( 粗酶液 ) 用作单宁酶活性的检测。取 200L 粗酶液， 加入 200L 15mM 的没食子酸丙酯， 37， 水浴 5min， 接着加入 200L 甲醇绕单宁 (0.667 )， 37放置5min后加入200L KOH(0.5M)， 37放置5min， 能够使没食子酸丙酯溶液由。
23、橘黄 色变为紫红色的为阳性克隆。通过筛选得到一个阳性克隆子 (pUC118-13B)。 0057 将阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序， 测序结果显示， 单宁酶基因的核苷 酸序列由 1476 个碱基组成， 其核酸序列如 SEQ ID NO.1 所示， 该 DNA 编码的多肽， 含 491 个 氨基酸， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示， 将其命名为 Tan410。其中 SEQ ID NO.2 为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.3 的对照图。 0058 8、 基因片段的克隆 ： 根据测序结果设计引物 ： F1 和 F2， 引物两端引入能插入 pET-28a(+) 。
24、载体的 HindIII 和 BamHI 酶切位点， 引物序列如下 ： 0059 P1 ： 5 -CGCGGATCCATGCTGCCCGCCTTCTGCCGC-3， 下划线为 BamHI 酶切位点序 列 ； 0060 P2 ： 5 -CCCAAGCTTATAAGTCTTGGGTTCGTAGG-3， 下划线为 HindIII 酶切位点序 列。 0061 利用两条引物， 以质粒 pUC118-13B 为模板进行 PCR 扩增反应， PCR 体系如下 ： 说 明 书 CN 102719413 A 6 5/7 页 7 0062 0063 PCR 反应条件为 ： 94预变性 4min， 循环条件为 94，。
25、 1min ； 60， 1min ； 72， 1.5min， 共 5 个循环， 94， 1min ； 52.5， 1min ； 72， 1.5min， 共 24 个循环， 最后 72延伸 10min。PCR 产物用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后用 BamHI、 HindIII 双酶切 24h， 与经过同样 处理的 pET-28a(+)(Invitrogen) 表达载体进行连接， 转化 Escherichia coli BL21(DE3)， 转化液涂布在含卡那霉素 (50g/mL) 的 LB 固体培养基， 37培养过夜， 随机挑取 10 株单 菌落接种提取质粒 DNA， 双酶切验证后， 送交测序。
26、。 0064 10、 重组单宁酶 Tan410 粗酶液的获得及分子量检测 0065 将含有经测序验证正确质粒的菌株划线至含卡那霉素(50g/mL)的LB固体培养 基中， 37培养过夜， 随机挑取重组菌接种至含卡那霉素 (50g/mL) 的 LB 液体培养基中， 37、 220r/min 摇床培养过夜， 按 1 100 的接种量转接至 50mL 的含卡那霉素 (50g/mL) 的 LB 液体培养基中， 当生长至 OD600 0.7 时加入 IPTG 至终浓度 0.4mM， 25、 200r/min 培 养 12 小时 (OD600 3)， 14000g 离心 5min， 弃上清， 将菌体重悬于 。
27、50mL， 0.1M 的磷酸盐缓 冲液 (pH 6.4) 中， 用超声波破碎仪 (Sonics 公司 ) 破碎细胞， 4， 14000g 离心 20min， 收集上清， 得到粗重组蛋白， 将粗重组蛋白用 Ni-NTAAgerose(QIAGEN) 亲和柱纯化重组蛋 白， 亲和柱具体操作步骤按 QIAGEN 公司产品说明书进行。 0066 将获得的粗酶液和纯化后的蛋白酶液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳分析， SDS-PAGE 电 泳结果表明， SEQ ID NO.1 所述核苷酸序列所编码的多肽在 Escherichia coli BL21(DE3) 中得到高效表达， 且所有重组蛋白均是可溶的，。
28、 无包涵体形成， 初步估计重组蛋白 Tan410 的分子量大小约为 54kDa。( 如附图 1 所示 )。 0067 实施例 2 重组单宁酶 Tan410 的酶学性质研究 0068 取 200L 粗酶液， 加入 200L 15mM 的没食子酸丙酯， 37， 水浴 5min， 接着加入 200L 甲醇绕单宁 (0.667 )， 37放置 5min 后加入 200L KOH(0.5M)， 37放置 5min， 同时以灭活的粗酶液做对照， 520nm 测定光吸收值， 吸收值越大表明酶活力越高。 0069 1、 重组单宁酶 Tan410 最适反应温度及热稳定性 0070 在反应温度为 20-60的条件。
29、下按上述方法测定其酶活性， 得到其最适反应温度 (以酶活力最高时记为100)。 在25、 35、 45、 50、 55条件下分别将酶保温0.25h、 0.5h、 1h、 2h、 4h、 12h， 30测定剩余酶活， 得到酶的热稳定性。结果如图 2 和 3 所示， Tan410 的最适反应温度为 30 ； 温度低于 45时， Tan410 是稳定的， 45保温 12h 仍保有 75的 说 明 书 CN 102719413 A 7 6/7 页 8 相对酶活性， 随着温度的升高， 酶的温度稳定性迅速降低， 在 55条件下处理 12h， 酶的相 对酶活性迅速降至 15。 0071 2、 重组单宁酶 T。
30、an410 最适反应 pH 及 pH 稳定性 0072 分别在 pH4.0-9.0 缓冲液中按上述方法测定其酶活性， 得到其最适反应 pH。30 下条件， 将酶液在 pH 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0 和 11.0 的缓冲液中分别保存 0.25h、 0.5h、 1h、 2h、 4h 和 12h， 30测定剩余酶活， 得到酶的 pH 稳定性 ( 以酶活力最高时记为 100 )。结果如图 4 和 5 所示， Tan410 的最适反应 pH 为 6.4 ； Tan410 在 pH 6.0-7.0 的范 围内是稳定的， 低于 pH 6.0 或高于 pH7.0， Tan41。
31、0 的酶活力随着保育时间的延长而迅速下 降。 0073 3、 化学试剂对酶活力的影响 0074 在反应体系中加入 CaCl2、 MgCl2、 MnCl2、 CuCl2、 ZnSO4、 AlCl3、 CdCl2、 CoCl2、 AgNO3、 Hg(NO3)2、 Cr(NO3)2、 EDTA、 尿素、 - 巯基乙醇、 PMSF、 TritonX-100 和 Tween 80， 使其终浓 度为 1mM， 在标准条件下测酶活力， 以不加化学试剂的酶液活力为 100。结果如表 1 所示， Ca2+， Cd2+和 Mg2+对 Tan410 的酶活性有激活作用， Mn2+、 Cu2+、 Zn2+、 Co2+。
32、、 Al3+、 EDTA、 尿素和 Triton X-100 对 Tan410 的酶活性没有明显的影响， 而 Ag+、 Cr2+、 - 巯基乙醇、 Tween 80 和 PMSF 对 Tan410 的酶活性有强烈的抑制作用， Hg2+则完全抑制 Tan410 的酶活性。 0075 表 1 化学试剂对 Tan410 酶活性的影响 0076 Chemical(1mM) Relative activity( ) Control 100 CaCl2 126 MgCl2 120 MnCl2 90 CuCl2 108 ZnSO4 100 AlCl3 97 CdCl2 121 CoCl2 100 AgNO3。
33、 51 Hg(NO3)2 0 Cr(NO3)2 52 说 明 书 CN 102719413 A 8 7/7 页 9 EDTA 86 urea 106 -mercaptoethanol 63 PMSF 32 TritonX-100 100 Tween 80 47 0077 0078 4、 NaCl 对 Tan410 酶活性的影响 0079 在酶液中加入 NaCl 使其终浓度为 1M、 2M、 3M、 4M 和 5M， 30条件下放置 24h， 然后 在标准条件下测酶活力， 以没加 NaCl 的酶液的活力为 100。结果如图 6 所示， 高浓度的 NaCl 对 Tan410 的酶活力没有明显的影响。
34、， NaCl 浓度到达 5M 时， Tan410 仍有 80的相对酶 活力。 0080 实施例3重组单宁酶Tan410对没食子酸丙酯、 单宁酸、 表儿茶素没食子酸酯、 表没 食子儿茶素酸酯、 绿原酸、 迷迭香酸和阿魏酸乙酯降解的 HPLC 分析 0081 取 6 支 2ml 离心管， 分别加入 200L 的酶液， 接着分别加入 0.5mg/mL 的 200L 的没食子酸甲酯、 单宁酸、 表儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素没食子酸酯、 绿原酸、 迷迭 香酸和阿魏酸乙酯， 30放置 40min 后上机进行 HPLC 分析。 0082 色谱条件为 ： Diamonsil C18 色谱柱 (2504。
35、.6mm， 5m)， 柱温 30， 没食子酸的 紫外检测波长为 260nm， 阿魏酸和咖啡酸的紫外检测波长为 320nm。进样量为 0.5L， 以峰 面积外标法定量。 0083 流动相A ： 乙腈B ： pH 3.5的磷酸缓冲盐溶液， AB6040， 流速0.8L/min。 结果见图 7， 在 30条件下， 经过 40min 后， 单宁酸、 表儿茶素没食子酸酯、 表没食子儿茶素 没食子酸酯、 绿原酸和阿魏酸乙酯已经完全水解， 大约有 88的迷迭香酸被水解， 46的没 食子酸甲酯被水解。这说明 Tan410 对天然底物有更强的亲和力。 0084 综上所述， 本发明 SEQ ID NO.1 所述的。
36、来源于海底淤泥的 DNA 序列在大肠杆菌表 达体系中可获得高效可溶的表达， 其重组蛋白可以水解单宁酸、 表儿茶素没食子酸酯、 表没 食子儿茶素没食子酸酯、 迷迭香酸、 绿原酸和阿魏酸乙酯， 其中对迷迭香、 绿原酸和阿魏酸 乙酯的水解作用是 Tan410 所特有的性质， 意味着除了在茶饮料中有应用潜力外， 在工农业 废弃物处理等方面也有重要的应用潜力。 0085 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的。
37、实质 和范围。 说 明 书 CN 102719413 A 9 1/4 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102719413 A 10 2/4 页 11 0003 序 列 表 CN 102719413 A 11 3/4 页 12 0004 序 列 表 CN 102719413 A 12 4/4 页 13 序 列 表 CN 102719413 A 13 1/4 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102719413 A 14 2/4 页 15 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102719413 A 15 3/4 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 102719413 A 16 4/4 页 17 图 7 说 明 书 附 图 CN 102719413 A 17 。