腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法.pdf

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。

1.  一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：
腺苷+水  腺苷脱氨酶  肌苷+氨
过氧化氢+氨+2-酮戊二酸  谷氨酸氧化酶  谷氨酸+氧+水
谷氨酸+水+辅酶  谷氨酸脱氢酶  氨+2-酮戊二酸+
                                          还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小测定结果。

2.  一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，主要成分包括：
缓冲液          20——500mmol/L
稳定剂          1——4000mmol/L
辅酶            1——6mmol/L
谷氨酸氧化酶    1000——80000U/L
谷氨酸脱氢酶    1000——80000U/L
腺苷            1——50mmol/L
过氧化氢        1——50mmol/L
2-酮戊二酸      1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.  根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸组成单剂试剂。

4.  根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成。辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.  根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶组成。辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.  根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。

腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，属于检验测定技术领域。
背景技术
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是：腺苷(白色结晶粉末)+水(H₂O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH₄⁺)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下：
腺苷+水 腺苷脱氨酶 肌苷+氨
过氧化氢+氨+2-酮戊二酸 谷氨酸氧化酶 谷氨酸+氧+水
谷氨酸+水+辅酶 谷氨酸脱氢酶 氨+2-酮戊二酸+
                                          还原型辅酶
这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase；EC 3.5.4.4)酶(偶)联谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase；EC 1.4.3.7EC 1.4.3.11)、谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase；EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)酶促反应连续监测法。腺苷脱氨酶作为作用酶，功能为将腺苷酶解产生氨。谷氨酸氧化酶能将氨作用成为谷氨酸；谷氨酸脱氢酶作为循环酶：它的酶促作用使谷氨酸产生氨，使氨不断地被重复循环利用，同时不断地产生谷氨酸。谷氨酸脱氢酶又作为显色酶，在谷氨酸底物作用下，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂较为理想：
缓冲液          100mmol/L
稳定剂          500mmol/L
辅酶            3mmol/L
谷氨酸氧化酶    6000U/L
谷氨酸脱氢酶    8000U/L
腺苷            6mmol/L
过氧化氢        5mmol/L
2-酮戊二酸      5mmol/L
本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。
辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶。
辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷、过氧化氢、2-酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液   100mmol/L
稳定剂                          500mmol/L
辅酶                            3mmol/L
谷氨酸氧化酶                    6000U/L
谷氨酸脱氢酶                    8000U/L
腺苷                            6mmol/L
过氧化氢                        5mmol/L
2-酮戊二酸                      5mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。
实施例二
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液  100mmol/L
稳定剂                         50mmol/L
辅酶                           3mmol/L
腺苷                           6mmol/L
过氧化氢                       5mmol/L
2-酮戊二酸                     5mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液  100mmol/L
稳定剂                         500mmol/L
谷氨酸氧化酶                   6000U/L
谷氨酸脱氢酶                   8000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。
实施例三
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液  100mmol/L
稳定剂                         50mmol/L
辅酶                           3mmol/L
腺苷                           6mmol/L
过氧化氢                       5mmol/L
2-酮戊二酸                     5mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液  100mmol/L
稳定剂                         500mmol/L
谷氨酸脱氢酶                   8000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液  100mmol/L
稳定剂                         500mmol/L
谷氨酸氧化酶                   6000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定腺苷脱氨酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0006；吸光度时间反应曲线应呈直线上升；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达500U/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.005±0.002ΔA/min/U/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。