无机磷磷酸根诊断/测定试剂盒及无机磷磷酸根浓度测定方法.pdf

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。

1.  一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)浓度测定方法，其方法原理如下：
磷酸根+草酰乙酸  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶  二氧化碳+
                                     磷酸烯醇式丙酮酸+水
二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢  丙酮酸氧化酶  磷酸根+丙酮酸
                                               +氧+水
丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+
                                                   辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小测定结果。

2.  一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液                    20——500mmol/L
稳定剂                    1——4000mmol/L
还原型辅酶                0.1——0.35mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶    1000——80000U/L
丙酮酸氧化酶              1000——80000U/L
苹果酸脱氢酶              1000——80000U/L
草酰乙酸                  1——50mmol/L
乙酰磷酸                  1——50mmol/L
过氧化氢                  1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.  根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢组成单剂试剂。

4.  根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶组成。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.  根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶组成。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.  根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。

无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
人体内磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，＞70时，可发生转移性钙化。当乘积＜35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、[Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H₂PO₄^1-，HPO₄^2-)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下：
磷酸根+草酰乙酸  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶  二氧化碳+
                                      磷酸烯醇式丙酮酸+水
二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢  丙酮酸氧化酶  磷酸根+丙酮酸
                                              +氧+水
丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶(脱羧化)  苹果酸+
                                                    辅酶
这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase；EC4.1.1.31)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.3.3)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase(decarboxylating)；EC 1.1.1.38；EC 1.1.1.39；EC 1.1.1.40；EC 1.1.1.83)酶促反应连续监测法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸根)酶解产生二氧化碳。丙酮酸氧化酶作为循环酶，它的酶促作用将二氧化碳等再次变回无机磷(磷酸根)，使无机磷(磷酸根)不断地被重复循环利用，同时不断地循环重复产生丙酮酸。苹果酸脱氢酶作为显色酶，在丙酮酸等反应下，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液                            100mmol/L
稳定剂                            500mmol/L
还原型辅酶                        0.25mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶            6000U/L
丙酮酸氧化酶                      8000U/L
苹果酸脱氢酶                      10000U/L
草酰乙酸                          16mmol/L
乙酰磷酸                          9mmol/L
过氧化氢                          6mmol/L
本发明的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢。
试剂2
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶。
还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                        500mmol/L
还原型辅酶                    0.25mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶        6000U/L
丙酮酸氧化酶                  8000U/L
苹果酸脱氢酶                  10000U/L
草酰乙酸                      16mmol/L
乙酰磷酸                      9mmol/L
过氧化氢                      6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实施例二
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
草酰乙酸                         16mmol/L
乙酰磷酸                         9mmol/L
过氧化氢                        6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液   100mmol/L
稳定剂                          500mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶          6000U/L
丙酮酸氧化酶                    8000U/L
苹果酸脱氢酶                    10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实施例三
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
草酰乙酸                         16mmol/L
乙酰磷酸                         9mmol/L
过氧化氢                         6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
丙酮酸氧化酶                     8000U/L
苹果酸脱氢酶                     10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶           6000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定无机磷(磷酸根)浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0008；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达16mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤3％；试剂的灵敏度可达0.0012±0.0006ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。