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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510927370.4 (22)申请日 2015.12.14 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 林瑞庆 许家园 翁亚彪 胡会朋 李国良 何茜 吕梦娜 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 单香杰 (54) 发明名称 兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 检测引物和 试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及检测技术领域， 具体。
2、公开了兔中 型艾美耳球虫荧光定量 PCR 检测引物和试剂盒， 所述引物为 Me-F 和 Me-R， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 2 所示， 基于所述引物优化反应体系和反应 条件， 研制出一种基于荧光染料法的定量检测兔 中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 试剂盒， 试剂盒操 作简单程序化， 方法特异性强， 敏感性高， 结果判 定客观。该方法可实现对兔球虫病的流行病学调 查及临床诊断， 为兔球虫的诊断和防治技术， 临床 快速而准确的检测兔球虫的感染情况提供技术支 持。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 。
3、附图2页 CN 105420362 A 2016.03.23 CN 105420362 A 1/1 页 2 1.一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量 PCR 检测引物对， 其特征在于， 所述引物 对为 Me-F 和 Me-R， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 2 所示。 2.一种检测兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于， 含有权利要求1 所述的检测引物对和荧光定量检测试剂。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中 Me-F 和 Me-R 的浓度分 别为 25 pmol/uL。 4.根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 试剂盒还包括 。
4、DNA 提取试剂。 5. 根据权利要求 4 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光定量检测试剂为 SYBR Green Primix Ex Taq， 所述 DNA 提取试剂为 QIAamp DNA Stool Mini Kit。 6. 根据权利要求 5 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的荧光定量 PCR 反应体系 为 ： SYBR Green Primix Ex Taq 10 L， Me-F 和 Me-R 各 0.25 L， 模板 DNA 2 L， dd H2O 7.5 L， 共 20 L。 7. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的荧光定量 PCR 反应条件 。
5、为 ： 95 预变性 30 s ； 95 变性 5 s， 59 退火 30 s， 72 延伸 30 s 共运行 40 个循环。 权 利 要 求 书 CN 105420362 A 2 1/7 页 3 兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 检测引物和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及检测技术领域， 更具体地， 涉及兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 检测 引物和试剂盒。 背景技术 0002 兔球虫病是一类由兔艾美耳球虫寄生于家兔肝胆管和肠道上皮细胞内所引起的 一种最常见的原虫性疾病。该病危害严重， 流行广泛， 感染率高， 对养兔业的危害极大， 每 年造成巨大的经济损失， 呈世界分布， 据报道 1 3。
6、 月龄的幼兔感染率可达 100， 患病后 幼兔的死亡率高达 70左右， 在我国很多地区也均有感染报道。该病病原种类多达 11 个 种， 分别是斯氏艾美耳球虫 (Eimeria stiedai)、 穿孔艾美耳球虫 (Eimeria perforans)、 大型艾美耳球虫 (Eimeria magna)、 梨型艾美耳球虫 (Eimeria piriformis)、 肠艾美耳 球虫 (Eimeria intestinalis)、 维氏艾美耳球虫 (Eimeria vejdovskyi)、 中型艾美耳球 虫 (Eimeria media)、 无残艾美耳球虫 (Eimeria irresidua)、 小。
7、型艾美耳球虫 (Eimeria exigua)、 黄艾美耳球虫 (Eimeria flsvescens) 和盲肠艾美耳球虫 (Eimeria coecicola)。 其中流行病学调查显示中型艾美耳球虫流行广泛。 0003 目前常用的诊断方法是饱和盐水漂浮法， 浮卵后通过显微镜检测粪便中的卵囊。 兔球虫呈混合感染， 各个虫种卵囊之间的形态特征不是十分明显， 增加了临床操作人员鉴 别诊断的难度。因此建立一种准确、 简便、 快速的兔球虫鉴别诊断方法意义重大。 0004 实时定量PCR(Real-time PCR)技术在PCR反应体系中加入荧光基团， 以荧光信号 的强度实时监测整个 PCR 反应的进程。
8、， 最后达到对未知模板进行定量分析的方法。反应体 系中加入荧光基团后， 随着反应的每一步扩增荧光信号逐渐增强， 这些荧光信号可以被仪 器设备实时地采集、 分析， 同时绘制出一条循环反应数与荧光信号强度的标准曲线。PCR 反 应初期产生的荧光信号弱， 当 DNA 扩增进入指数期， 产生的荧光信号越来越强， 达到能被检 测到的水平， 因此选取DNA指数扩增期的某一点来检测PCR产物的量， 由此来推断模板最初 的含量， 达到对模板的定量检测。常用的有 SYBR Green I 染料法和 TaqMan 探针法， SYBR Green I 法成本低、 操作简便， 虽然其特异性不如 TaqMan 探针法，。
9、 但使用特异性高的引物， 优化反应体系与条件， 消除非特异性扩增和二聚体的生成， 也能达到很高的特异性。SYBR Green I 能结合到 dsDNA 小沟部位， 是一种具有绿色激发波长的染料， 它只有与 dsDNA 结合 才会发出荧光， 在变性时， DNA 双链分开， 不产生荧光， 在复性和延伸时， 形成 dsDNA， SYBR Green I 发出荧光。与普通 PCR 相比， 荧光定量 PCR 具有灵敏、 精确、 简单、 快速等优点， 在 PCR 的扩增及分析过程均在同一封闭系统下完成， 只需一次打开 PCR 反应管， 避免交叉污染 导致假阳性的产生， 被广泛的应用于各种临床病原的检测。 。
10、0005 ITS序列是位于核糖体DNA序列中的一段内转录间隔区序列， ITS序列不同于其两 端的大小亚基基因， ITS 区不加入成熟的核糖体， 功能上不受限制， 受到的选择压力较小， 导 致其在核苷酸长度和序列上出现了很大的变异。特别适合作为种间分类鉴定的分子标记， 已广泛应用于寄生虫病原的分类鉴定研究上。 说 明 书 CN 105420362 A 3 2/7 页 4 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中兔球虫病检测所存在的缺陷， 提供 一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量 PCR 检测引物对。 0007 本发明的第二个目的是提供含有所述检测引物的检测试剂盒。 0008。
11、 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的 ： 0009 一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对， 所述引物对为Me-F和 Me-R， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 2 所示。 0010 本研究首先对兔中型艾美耳球虫广西玉林分离株兔球虫的核糖体 ITS 序列进行 PCR扩增、 测序分析， 与GenBank中公布的序列进行序列分析， 发现ITS序列表现出种内相对 保守而种间差异较大的特征。适合作为种间分子鉴定的分子标记序列。发明人通过设计多 对引物， 最终筛选获得一对能特异性检测兔中型艾美耳球虫病的引物。 0011 本发明还提供检测兔中型艾美耳球虫病的荧光定量 PCR 试剂。
12、盒， 所述试剂盒含有 所述的检测引物对和荧光定量检测试剂。 0012 优选地， 所述试剂盒中 Me-F 和 Me-R 的浓度分别为 25pmol/uL。 0013 优选地， 所述试剂盒还包括 DNA 提取试剂。 0014 优选地， 所述荧光定量检测试剂为 SYBR Green Primix Ex Taq II， 所述 DNA 提取 试剂为 QIAamp DNA Stool Mini Kit。 0015 更优选地， 所述 QIAamp DNA Stool Mini Kit 为 100 个反应的 140mL 的 ASL Buffer、 1.5mL 的 proteinase K、 20mL 的 Bu。
13、ffer AL、 50mL 的 Buffer AW1、 50mL 的 Buffer AW2、 10mL 的 Buffer AE、 20mL 的 96 100酒精。 0016 优选地， 所述试剂盒的荧光定量 PCR 反应体系为 ： SYBR Green Primix Ex Taq II 10L， Me-F 和 Me-R 各 0.25L， 模板 DNA 2L， dd H2O 7.5L， 共 20L。 0017 优选地， 所述试剂盒的荧光定量 PCR 反应条件为 ： 95预变性 30s ； 95变性 5s， 59退火 30s， 72延伸 30s 共运行 40 个循环。 0018 与现有技术相比， 本。
14、发明具有以下有益效果 ： 0019 本发明通过设计筛选获得一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量 PCR 检测引 物对， 所述引物对为Me-F和Me-R， 其序列如SEQ ID NO ： 12所示， 基于所述引物优化反应 体系和反应条件， 研制出一种基于荧光染料法的定量检测兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 试剂盒， 试剂盒操作简单程序化， 方法特异性强， 敏感性高， 结果判定客观。 该方法可实现对 兔球虫病的流行病学调查及临床诊断， 为兔球虫的诊断和防治技术， 临床快速而准确的检 测兔球虫的感染情况提供技术支持。 附图说明 0020 图 1 为兔中型艾美耳球虫的荧光定量 PCR 特异性扩增图及溶。
15、解曲线 ； 其中 1 4 分别为中型艾美耳球虫、 大型艾美耳球虫、 肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫。 0021 图 2 为兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 扩增曲线及标准曲线 ； 1 5 分别为兔中 型艾美耳球虫 DNA 原液按 10 105倍稀释得到的五个稀释度 DNA， 其中， 图 2A 是兔中型艾 美耳球虫荧光定量 PCR 扩增曲线， 图 2B 是兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 标准曲线。 说 明 书 CN 105420362 A 4 3/7 页 5 0022 图 3 为兔中型艾美耳球虫荧光定量检测方法的敏感性试验扩增图 ； 1 6 分别为 兔中型艾美耳球虫 DNA 原液按 10 106倍。
16、稀释得到的 6 个稀释度 DNA。 具体实施方式 0023 下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对 本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤、 条件所作的修 改或替换， 均属于本发明的范围。 若无特别说明， 实施例中所用的实验方法均为本领域技术 人员所熟知的常规方法和技术， 所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。 0024 实施例 1 引物设计和筛选 0025 首先对兔中型艾美耳球虫广西玉林分离株兔球虫的核糖体 ITS 序列进行 PCR 扩 增、 测序分析， 与 GenBank 中公布的序列进行序列分析， 发现 ITS 序列表现。
17、出种内相对保守 而种间差异较大的特征， 适合作为种间分子鉴定的分子标记序列。在种内保守的区域设计 特异性引物， 并参考国外已报到的特异性引物， 通过实验验证筛选出最为合适的引物， 用于 定量实验。 0026 表 1 兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 引物设计 0027 0028 由表 1 所设计的序列进行荧光定量 PCR， 结果表明 ： 只有引物组 1 能够特异性的扩 增。 0029 为了验证引物的特异性， 将 4 种艾美耳球虫 ( 中型艾美耳球虫、 大型艾美耳球虫、 肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫 ) 分别作为模板做荧光定量 PCR 实验， 检测中型艾美耳球虫 引物特异性， 同时设无模板阴性对照。
18、。反应体系和反应条件同上， 扩增完做熔解曲线， 结果 显示本发明所述引物的荧光定量检测方法特异性强， 见图 1。 0030 实施例 2 试剂盒的制备和使用方法 0031 试剂盒内含粪便DNA提取试剂(QIAamp DNA Stool Mini Kit)， 其中含100个反应 说 明 书 CN 105420362 A 5 4/7 页 6 的140mL的ASL Buffer、 1.5mL的proteinase K、 250mL的Buffer AL、 50mL的Buffer AW1、 50mL 的 Buffer AW2、 10mL 的 Buffer AE、 20mL 的 96 100酒精 ； 荧光定。
19、量 PCR 反应液 为 100 个反应的 SYBR Green Primix Ex Taq II 试剂、 终浓度为 25pmol/L 的中型艾美耳 球虫特异性引物。 0032 一、 上述试剂盒的使用方法， 包括以下步骤 ： 0033 (1) 粪便 DNA 的提取 ： 0034 参照 QIAamp DNA Stool Mini Kit 的使用说明， 具体操作步骤如下 ： 0035 a. 称取 200mg 粪便放置在 2mL 的离心管。 0036 b. 加入 1.4mL ASL Buffer 和 0.4g 玻璃珠 (1mm)， 震荡 1 2h。 0037 c. 将悬浮液放置 70， 5min。 0。
20、038 d. 漩涡震荡 15s， 然后离心样品 15000rpm， 1min。 0039 c. 吸取 1.2mL 悬浮液到 2mL 离心管中。 0040 e. 加入 1 个 InhibitEx Tablet 到离心管中， 立即漩涡震荡 1min， 直到 InhibitEx Tablet 完全悬浮， 室温下静置 1min。 0041 f. 离心样品 15000rpm， 3min。 0042 g. 吸取所有上清液到新的 1.5mL 离心管中， 离心样品 15000rpm， 3min。 0043 h. 吸取 15L proteinase K 到新的 1.5mL 离心管中。 0044 i. 吸取步骤 。
21、g 中的 200L 上清液到乘有 proteinase K 中的 1.5mL 离心管中。 0045 j. 加入 200L Buffer AL， 漩涡震荡 15s。 0046 k. 瞬时离心， 70水浴 10min。 0047 l. 加入 200L 酒精 (96 -100 )， 漩涡震荡混匀， 瞬时离心。 0048 m.小心地将步骤l中的液体加入到QiAamp Mini Spin Column中， 盖上盖子， 离心 15000rpm， 1min。将 QiAamp Spin Column 放入一个新的 2mL 的 Collection Tube。( 注 ： 如 果离心完后， 看到 QiAamp S。
22、pin Column 中仍有液体， 再离心一次。) 0049 n. 小心打开 QiAamp Spin Column， 加入 500L Buffer AW1， 盖上盖子， 离心 15000rpm， 1min。将 QiAamp Spin Column 放入新的 2mL Collection Tube。 0050 o. 小心打开盖子， 加入 500L Buffer AW2。盖上盖子离心 15000rpm， 3min。 0051 建议 ： 将 QiAamp Spin Column 放入一个新的 2mL 的 Collection Tube， 离心 15000rpm， 1min。 0052 p. 将 Qi。
23、Aamp Spin Column 放入一个新的 1.5mL 离心管中， 小心打开 QiAamp Spin Column 盖子， 加入 50L Buffer AE 在 QiAamp Spin Column 膜上。盖上盖子， 在室温下静 置 1min， 然后离心 15000rpm， 1min， 离心管里即为 DNA。 0053 (2) 荧光定量 PCR 反应体系与扩增条件 ： 0054 反应体系为 ： SYBR Green Primix Ex Taq II 10L， 上下游引物(25pmol/L)各 0.25L， 模板 DNA 2L， dd H2O 7.5L， 共 20L。 0055 PCR扩增条。
24、件 ： 95预变性30s ； 95变性5s， 59退火30s， 72延伸30s(40个循 环 )。 0056 (3) 荧光定量 PCR 结果分析 ： 从终端电脑上读取荧光定量 PCR 扩增结果。 0057 二、 试剂盒的标准曲线 说 明 书 CN 105420362 A 6 5/7 页 7 0058 吸取含 106个卵囊的兔中型艾美耳球虫进行 DNA 提取， 提取得到的 DNA 称为 DNA 原液， 将 DNA 原液做 1 ： 10 1 ： 105倍比稀释， 得到的 5 个梯度的 DNA 样品相当于卵囊数分 别为 105、 104、 103、 102、 101所提取得到的 DNA， 将这 5 。
25、个梯度的 DNA 样品进行实时荧光定量 PCR， 反应体系和条件同上， 根据荧光定量 PCR 的动力学曲线结果， 检测仪系统自动生成标 准曲线 ( 图 2B) 以及回归方程 ( 表 2) ； 本发明用兔中型艾美耳球虫种特异性引物对未知模 板 DNA 进行 SYBRGreen 染料荧光定量 PCR 扩增， 阳性结果会出现 “S” 扩增曲线， 阴性结果则 不会出现。将得到的 CT 值代入标准方程即可求得未知样品的卵囊含量。 0059 表 2 兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 标准方程 0060 样品CT 值 (105、 104、 103、 102、 101)标准方程R2阈值 E.media15.2。
26、5、 19.28、 22.41、 26.40、 29.57CT -3.576*log10X+33.313 0.9980.1 0061 注 ： x 卵囊量， CT 值为荧光信号达到设定阈值时的循环数。 0062 实施例 3 试剂盒的敏感性试验 0063 将兔中型艾美耳球虫 106个卵囊 DNA 原液做 1 ： 10 1 ： 10 6倍比稀释， 用实施例 2 所建立的real-time PCR方法进行检测， 分析敏感性结果见图3， 最低能检测到10个卵囊的 DNA。 0064 实施例 4 试剂盒的稳定性试验 0065 将兔中型艾美耳球虫 DNA 原液分别做 1 ： 10 1 ： 105倍比稀释形成。
27、 5 个梯度， 进行 3 次组内和组间重复试验， 用实施例 2 所述荧光定量 PCR 体系和反应条件进行 PCR 扩增， 根 据检测结果计算 CT 平均值和变异系数 (CV)， 评价这些方法的稳定性， 结果见表 3。结果显 示所建立的几种方法组内组间重复性变异系数CV为0.11.8， 均小于2。 说明该方 法具有良好的稳定性。 0066 表 3 中型艾美耳球虫实时荧光定量 PCR 的组内和组间重复性实验结果 0067 0068 实施例 5 实施例 2 所述试剂盒对临床样品的检测 0069 采集佛山芦苞地区几个规模化的兔场粪便样品共计32份， 其中种兔12份， 幼兔20 份， 对每份样品分别称取。
28、 200mg 的粪便进行粪便 DNA 提取 (QIAGEN 粪便 DNA 提取试剂盒 )， 再用实施例 2 建立的荧光定量方法检测， 得到每个样品的 CT 值， 通过标准方程计算出卵囊 说 明 书 CN 105420362 A 7 6/7 页 8 含量， 再推算出 OPG( 每克粪便中的卵囊含量 ) 大小， 计算兔中型艾美耳球虫球虫的感染情 况。定量检测结果及显微镜计数 ( 显微镜计数结果是 11 种球虫混合卵囊的量 ) 结果如表 4(1 12 号样品为种兔， 13 32 号为幼兔 )。 0070 表 4 临床样品荧光定量检测结果及镜检结果 (OPG) 0071 0072 说 明 书 CN 1。
29、05420362 A 8 7/7 页 9 0073 由上表可以看出， 传统的显微镜检查有一定局限性， 不易定种， 且只有当 OPG 在 100 以上才能被检测出， 而荧光定量 PCR 检测方法的精确度更高， 能检测出显微镜检测为阴 性的样品。 说 明 书 CN 105420362 A 9 1/2 页 10 SEQUENCE LISTING 华南农业大学 兔中型艾美耳球虫荧光定量 PCR 检测引物和试剂盒 10 PatentIn version 3.3 1 24 DNA Me-F 1 gttttgggag ttcgtgcttt ttgg 24 2 23 DNA Me-R 2 tggtggtgac。
30、 ctatgggcga aag 23 3 23 DNA F2 3 gcatcacatt atccgtcgct tca 23 4 27 DNA R2 4 ctgcctcact cctactactc accacaa 27 5 23 DNA F3 5 cattgtgctg tgttgttggc ttg 23 6 23 序 列 表 CN 105420362 A 10 2/2 页 11 DNA R3 6 atttttcccc accaccgtat ctc 23 7 21 DNA F4 7 tcctgttttg ggagttcgtg c 21 8 21 DNA R4 8 gtggtgacct atgggcgaaa g 21 9 25 DNA F5 9 tgttttggga gttcgtgctt tttgg 25 10 24 DNA R5 10 tggtgaccta tgggcgaaag atgc 24 序 列 表 CN 105420362 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105420362 A 12 2/2 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 105420362 A 13 。