技术领域
本发明涉及一种生产2R,3R-丁二醇的方法，特别涉及到一种克雷伯氏 肺炎杆菌生产2R,3R-丁二醇的方法。
背景技术
克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，用于生产1,3-丙二醇、 2,3-丁二醇、乙偶姻和2-酮基-D-葡萄糖酸等工业产品。
2,3-丁二醇是一种大宗化学品，其可用于合成塑料和橡胶等行业，同 时也被认为是一种潜在的生物燃料，2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇由于凝 固点较低，可用于防冻剂（CelinskaE,GrajekW,Biotechnologicalproduction of2,3-butanediol-Currentstateandprospects.BiotechnolAdv,2009,27, 715-725）。2,3-丁二醇有两个手性碳，形成内消旋-2,3-丁二醇，2S,3S-丁 二醇和2R,3R-丁二醇三种立体异构体。2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇是对 映异构体，结晶点和沸点等性质相同。
有多种微生物可以合成2,3-丁二醇，其中多粘芽孢杆菌、克雷伯氏肺 炎杆菌、克雷伯氏产酸杆菌和粘质沙雷氏菌具有较高的2,3-丁二醇生产性 能，是具有工业应用前景的菌株。目前报道芽孢杆菌主要生成2R,3R丁二 醇，伴随少量内消旋-2,3-丁二醇；而克雷伯氏菌属细菌主要生成内消旋-2,3- 丁二醇并伴随少量2S,3S-丁二醇（UiS,MasudaT,MasudaH,MurakiH, Mechanismfortheformationof2,3-butanediolstereoisomersinBacillus polymyxa.JFermentTechnol,1986,64,481-486）。
在克雷伯氏菌属中，2,3-丁二醇合成途径始于丙酮酸，两分子丙酮酸 脱羧形成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸在脱羧酶的催化下脱羧形成R-乙偶姻 （3-羟基-2-丁酮），乙偶姻在丁二醇还原酶的催化下消耗NADH形成内消 旋-2,3-丁二醇。乙酰乳酸可以通过非酶催化形成双乙酰，双乙酰在丁二醇 脱氢酶的催化下还原形成S-乙偶姻，S-乙偶姻进一步在丁二醇脱氢酶的催 化下还原形成2S,3S-丁二醇（XiaoZ,XuP,Acetoinmetabolisminbacteria. CritRevmicrobial,2007,33,127-140）。
微生物生产的2,3-丁二醇是两种异构体的混合物，目前有相关报道利 用基因工程菌株来生产单一立体构型的2,3-丁二醇。
在克雷伯氏菌属中，丁二醇脱氢酶由budC基因编码，该酶具有将乙 偶姻还原成丁二醇的能力，也具有将双乙酰还原成S-乙偶姻的能力，其对 底物的酮基还原后形成S构型羟基；因此该酶还原R-乙偶姻形成内消旋 -2,3-丁二醇，还原S-乙偶姻形成2S,3S-丁二醇。通过在大肠杆菌中表达来 源于克雷伯氏肺炎杆菌的丁二醇脱氢酶基因，同时表达解糖短杆菌的丁二 醇脱氢酶，获得的工程菌株可以利用双乙酰生产2S,3S-丁二醇（UiS.etal., Productionofl‐2,3‐butanediolbyanewpathwayconstructedin EscherichiacoliLett.Appl.Microbiol.,2004,39,533–537）。
通过在大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸 脱羧酶基因，再表达枯草杆菌等来源的丁二醇脱氢酶基因，获得的基因工 程菌株可以利用葡萄糖为碳源合成2R,3R-丁二醇（YanY,LeeC,LiaoJ, Enantioselectivesynthesisofpure(R,R)-2,3-butanediolinEscherichiacoli withstereospecificsecondaryalcoholdehydrogenases.2009,OrgBiomol Chem7,3914）。
目前并无利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产2R,3R-丁二醇的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生产2R,3R-丁二醇的方法。通过 该方法，能利用甘油为碳源发酵生产高光学纯度的2R,3R-丁二醇。
为解决上述技术问题，本发明中利用克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）生产2R,3R-丁二醇的方法，是在氧限制条件下，通过丁二醇 脱氢酶酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌，以甘油为碳源，发酵生产 2R,3R-丁二醇。
本发明中，所述丁二醇脱氢酶，也称为双乙酰还原酶和乙偶姻还原酶， 可以催化双乙酰与乙偶姻之间的氧化还原反应，也能催化乙偶姻与2,3-丁 二醇之间转化的氧化还原反应。在克雷伯氏肺炎杆菌中budC基因阅读框 由771个碱基构成，编码256个氨基酸残基。
本发明中，利用克雷伯氏肺炎杆菌生产2R,3R-丁二醇的方法，其具体 步骤包括：
（1）构建丁二醇脱氢酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株；
（2）将甘油、氮源、磷源、金属离子及微量元素和水，配制成培养 基；
（3）在步骤（2）配制的培养基中，接入丁二醇脱氢酶基因budC失 活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株，在氧限制条件下进行发酵培养，丁二醇脱 氢酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株将甘油转化成2R,3R-丁二 醇和1,3-丙二醇等代谢产物，并积累于发酵液中。即在培养过程中克雷伯 氏肺炎杆菌突变株消耗甘油的同时在发酵液中积累2R,3R-丁二醇。
所述步骤（2）中，氮源选自：有机氮源和无机氮源。其中，有机氮 源选自：玉米浆、酵母粉、蛋白胨和豆饼粉；无机氮源选自：铵盐、硝酸 及其盐类、亚硝酸及其盐类和尿素。
所述步骤（2）中，磷源是含有磷元素的物质，选自：磷酸和磷酸盐。
所述步骤（2）中，金属离子包括：钾、镁、铁和锰；微量元素包括： 锌、钙、钼、钴、铜、镍和硼。
所述步骤（3）中，氧限制条件为：供氧量小于菌体最大需氧量，其 中在菌体生长对数期和稳定期溶解氧浓度控制在5%以下。所述氧限制条 件也称微氧条件。
所述步骤（3）中，发酵培养的温度为28～42℃，培养pH为pH5.5-7.5； 发酵培养的时间为10～70小时。
所述的克雷伯氏肺炎杆菌是克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366。
本发明的有益效果如下：
1.所用的原料为可再生资源甘油。
2.产品2R,3R-丁二醇具有很高的光学纯度，发酵产物中不含2S,3S- 丁二醇（如实施例2、3、4），同时2R,3R-丁二醇在总丁二醇中所占比例 高（如实施例4中2R,3R-丁二醇在总丁二醇中所占比例为91%）。
3.在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的过程中，提高 2,3-丁二醇产品的附加值，从而提高整个发酵过程中的总体经济效益。
具体实施方式
以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
本实施例中的CGMCC1.6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中 心保藏，具有氨苄青霉素抗性。
1）配制种子培养基
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，用自来水配制，分装到 250mL锥形瓶中，装液量50mL，灭菌。
2）将甘油、氮源、磷源和其他组分配制成发酵培养基
甘油30g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾0.69g/L，磷酸二氢钾0.25g/L， 硫酸镁0.2g/L，酵母粉1.5g/L，微量元素1.0ml/L，铁溶液1.0ml/L。
其中，微量元素为：硫酸锰100mg/L，氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L， 硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L，浓 盐酸（37%）0.9ml/L。
铁溶液为：每升水中加入硫酸亚铁5.0g，37%的浓盐酸4ml。
3）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入野生型克雷伯氏肺炎杆菌 CGMCC1.6366菌苔，37℃摇床好氧培养，转速为180转每分钟，培养12 小时。
4）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，通风 量1L每分钟，搅拌转速250转每分钟，温度37℃，利用氢氧化钠溶液控 制发酵过程的pH为6.0，当甘油浓度降低到3g/L时，流加甘油，控制甘 油浓度在3-40g/L范围，发酵培养48小时。
利用气相色谱对发酵液中的产物和底物检测，采用日本岛津公司GC2012气相色谱仪，装备RESTEK公司手性色谱柱，进样口温度设定225℃，检测器采用FID（氢火焰）检测器，检测器温度设定225℃，柱温箱程序升温，初始50℃，以5℃每分钟速率升温到75℃，保留8分钟，以20℃每分钟速率升温到200℃，保留2分钟。
检测结果为：甘油21.7g/L，1,3-丙二醇59.0g/L，2R,3R-丁二醇5.5g/L， 内消旋-2,3-丁二醇14.2g/L，2S,3S-丁二醇1.0g/L。2R,3R-丁二醇在总丁二 醇中所占的比例为26%。
实施例2
一、克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366budC突变株的构建
步骤如下：
1、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌丁二醇脱氢酶（budC）和上下游 相邻序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578（Genbank:CP000647）基因组信息， 设计丁二醇脱氢酶PCR引物，上游引物budC-s： GCCATCCAGGAAGAGAAAAAATATCA（SEQIDNO.1所示），下游引 物budC-a：AGACGTTTGTACGCCTGGGTAGAAG（SEQIDNO.2所示）。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366基因组DNA为 模板，经PCR扩增，获得丁二醇脱氢酶（budC）基因片段，通过TA克隆 方法连接到pMD-18Tsimple质粒（商业产品）上，命名为pMD18T-budC 质粒，序列测定结果如下：
budC基因相邻上游部分序列为：
GCCATCCAGGAAGAGAAAAAATATCAGCGCCTGTCCGGCGTCG AGTTCGGGCCGATGGATTTTAAAGCCTATGCCGAGTCCTTCGGCGCC AAAGGGTTTGCCGTGGAAAGCGCTGAGGCGCTGGAGCCGACCCTGC GCGCGGCGATGGACGTCGACGGCCCGGCGGTAGTGGCCATCCCGGT GGATTATCGCGATAACCCGCTGCTGATGGGTCAGCTGCATCTGAGTC AGATTCTGTAAGTCATCACAATAAGGAAAGGAAA（SEQIDNO.3所 示）。
budC基因阅读框为：
ATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACCGGCGCCGGCCAGGGGATTGG TAAAGCTATCGCCCTTCGTCTGGTGAAGGATGGATTTGCCGTGGCCA TTGCCGATTATAACGACGCCACCGCCAAAGCGGTCGCCTCCGAAATC AACCAGGCCGGCGGCCGCGCCATGGCGGTGAAAGTGGATGTCTCCG ACCGCGATCAGGTGTTTGCCGCCGTCGAACAGGCGCGCAAAACGCTG GGCGGCTTCGACGTCATCGTCAACAACGCCGGCGTGGCGCCGTCCAC GCCGATCGAGTCCATTACCCCGGAGATTGTCGATAAAGTTTACAATA TCAACGTTAAAGGGGTGATCTGGGGCATTCAGGCGGCGGTCGAGGC CTTTAAGAAAGAGGGGCACGGCGGGAAAATCATTAACGCCTGTTCCC AGGCCGGCCACGTCGGCAACCCGGAGCTGGCGGTGTATAGCTCCAGT AAATTCGCCGTACGCGGCTTAACCCAGACCGCCGCTCGCGACCTCGC GCCGCTGGGCATCACGGTCAACGGCTACTGCCCGGGGATCGTCAAAA CGCCGATGTGGGCCGAAATTGACCGCCAGGTGTCCGAAGCTGCCGGT AAACCGCTGGGTTACGGTACCGCCGAGTTCGCCAAACGCATCACCCT TGGTCGTCTGTCCGAACCGGAAGATGTCGCCGCCTGCGTCTCCTATCT TGCCAGCCCGGATTCTGATTACATGACCGGTCAGTCATTGCTGATCG ACGGCGGGATGGTATTTAACTAA（SEQIDNO.4所示）。
budC基因相邻下游部分序列为：
TAAATAATAAGCTCTGACATGGCTTGCCCCTGCTGATATGCAGG GGCTTTTTTTGGTTTGGGTGTGAGCATCGTGCAAAACGCAGCAACGA TATTTGAAGGTCTCTGGCACGACGTGGGCAATCTGACTGGGTTGAAG GCCTGCTTTGAGCGAGGAGCATGTATTTTTCTTCACCCTCTACTTCGT CCATTCTTTATGCAGTAACGCATAGATGTATGTGTCGTCATACCTTGC CTTACCATCGTCGTTTTCAAAGGAGACAAACTCTTTAAAACAACCTT CCTGTCGCATATGCAAACGTTCACAGAGTTTTTGAGAGGCCAGGTTG TAAACTTCTACCCAGGCGTACAAACGTCT（SEQIDNO.5所示）。
2、利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有同源臂中间连接抗 性盒的DNA片段。
本步骤中，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有同源臂连接 抗性盒的DNA片段与pMD18T-budC质粒进行同源重组，获得 pMD18T-budC质粒上重组失活的budC基因，利用该质粒作为模板通过 PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budC基因上下 游序列同源的序列，中间连接抗性盒。
本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见（Weiet.al.Red recombinaseassistedgenereplacementinKlebsiellapneumoniaeJournalof IndustrialMicrobiology&Biotechnology2012），具体步骤如下：
a.pMD18T-budC质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5 α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-budC。
制备DH5α-pMD18-budC感受态细胞，在菌体培养1个小时后，添加 10mmol/L的阿拉伯糖，诱导pIJ790质粒中Red重组酶的表达。
b.设计引物budC-s2和budC-a2，序列分别为：
AGATAGGAGACGCAGGCGGCGACATCTTCCGGTTCGGACATTCC GGGGATCCGTCGACC（SEQIDNO.6所示）和 CAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCATGTAGGC TGGAGCTGCTTC（SEQIDNO.7所示）。
引物budC-s2的
“AGATAGGAGACGCAGGCGGCGACATCTTCCGGTTCGGAC”序列与 budC基因相应序列同源，引物budC-a2的
“CAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCA”序列与 budC基因相应序列同源。
利用引物budC-s2和budC-a2，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1491bp 的DNA片段A。该片段的两端分别具有与budC序列同源的同源臂，中间 包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。
c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-budC感受态细胞。 利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素 用量为50mg/L。
DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budC上的budC同源部 分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-C质粒。
d.利用引物budC-s（SEQIDNO.1所示）和budC-a（SEQIDNO.2 所示），以pMD18T-C质粒为模板进行PCR扩增，获得2394bp的DNA 片段B。
DNA片段B两端分别具有516bp和466bp的budC基因和相邻序列， 该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片 段B用于进行CGMCC1.6366染色体上budC基因重组的线性DNA片段。
3、利用转化或结合方法将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆 菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的丁二醇脱氢酶基因进行 同源重组，筛选获得菌株染色体丁二醇脱氢酶基因重组失活的菌株，具体 步骤如下：
a.将pDK6-red质粒转化到CGMCC1.6366中，获得CGMCC 1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株。
b.重组菌的验证，设计验证引物Yanzheng778z：
AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG（SEQIDNO.8所示），其序列对 应链霉素抗性基因aadA中间的一段序列。
利用引物budC-s（SEQIDNO.1所示）和Yanzheng778z，以长出的菌 株总DNA为模板进行PCR扩增，产物DNA片段为1274bp，而以出发菌 株CGMCC1.6366总DNA为模板进行PCR无特异性条带，表明获得的重 组菌正确，命名为CGMCC1.6366-budC-。该菌株的丁二醇脱氢酶基因通 过同源重组而失活。
二、利用丁二醇脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366-budC-发酵生产2R,3R-丁二醇
1）配制种子培养基和发酵培养基
按照实施例1配制种子培养基和发酵培养基。
2）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入制备的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366-budC-菌苔，28℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小 时。
3）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有4L发酵培养基的5L发酵罐中，通风 量2L每分钟，搅拌转速200转每分钟，温度28℃，利用30%氢氧化钠溶 液控制发酵过程pH5.5，发酵培养10小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：甘油3.2 g/L，1,3-丙二醇13.8g/L，2R,3R-丁二醇1.1g/L，内消旋-2,3-丁二醇0.3g/L， 2S,3S-丁二醇0.0g/L。2R,3R-丁二醇在总丁二醇中所占的比例为78%。
实施例3
1）配制种子培养基和发酵培养基
按照实施例1配制种子培养基和发酵培养基。
2）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入实施例2制备的克雷伯氏肺炎杆菌 CGMCC1.6366-budC-菌苔，42℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培 养12小时。
3）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有4L发酵培养基的5L发酵罐中，通风 量1L每分钟，搅拌转速150转每分钟，温度42℃，利用氢氧化钠溶液控 制发酵过程pH7.5，当甘油浓度降低到5g/L时，流加甘油，控制甘油浓度 在5-40g/L范围，发酵培养70小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：甘油33.3 g/L，1,3-丙二醇65.9g/L，2R,3R-丁二醇19.2g/L，内消旋-2,3-丁二醇3.9 g/L，2S,3S-丁二醇0.0g/L。2R,3R-丁二醇在总丁二醇中所占的比例为83%。
实施例4
1）配制种子培养基和发酵培养基
按照实施例1配制种子培养基和发酵培养基。
2）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入实施例2制备的克雷伯氏肺炎杆菌 CGMCC1.6366-budC-菌苔，37℃摇床好氧培养，转速为180转每分钟，培 养12小时。
3）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，通风 量1L每分钟，搅拌转速250转每分钟，温度37℃，利用氢氧化钠溶液控 制发酵过程pH6.0，当甘油浓度降低到3g/L时，流加甘油，控制甘油浓度 在3-40g/L范围，发酵培养48小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：甘油18.3 g/L，1,3-丙二醇55.3g/L，2R,3R-丁二醇24.6g/L，内消旋-2,3-丁二醇2.3 g/L，2S,3S-丁二醇0.0g/L。2R,3R-丁二醇在总丁二醇中所占的比例为91%。
实施例5
野生菌株利用葡萄糖为碳源的发酵。
1）配制种子培养基
按照实施例1配制种子培养基。
2）配制成发酵培养基
葡萄糖50g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾0.69g/L，磷酸二氢钾0.25 g/L，硫酸镁0.2g/L，酵母粉1.5g/L，微量元素1.0ml/L，铁溶液1.0ml/L。
其中，微量元素为：硫酸锰100mg/L，氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L， 硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L，浓 盐酸（37%）0.9ml/L。
铁溶液为：每升水中加入硫酸亚铁5.0g，37%的浓盐酸4ml。
3）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入野生型克雷伯氏肺炎杆菌 CGMCC1.6366菌苔，37℃摇床好氧培养，转速为180转每分钟，培养12 小时。
4）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，通风 量1L每分钟，搅拌转速250转每分钟，温度37℃，利用氢氧化钠溶液控 制发酵过程pH6.0，当葡萄糖浓度降低到10g/L时，流加葡萄糖，控制甘 油浓度在3-40g/L范围，发酵培养48小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：2R,3R- 丁二醇0.3g/L，内消旋-2,3-丁二醇41.1g/L，2S,3S-丁二醇2.2g/L。2R,3R- 丁二醇在总丁二醇中所占的比例为0.7%。
实施例6
丁二醇脱氢酶突变株利用葡萄糖为碳源的发酵。
1）配制种子培养基和发酵培养基
按照实施例5配制种子培养基和发酵培养基。
2）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入实施例2制备的克雷伯氏肺炎杆菌 CGMCC1.6366-budC-菌苔，37℃摇床好氧培养，转速为180转每分钟，培 养12小时。
3）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，通风 量1L每分钟，搅拌转速250转每分钟，温度37℃，利用氢氧化钠溶液控 制发酵过程pH6.0，当葡萄糖浓度降低到10g/L时，流加葡萄糖，控制甘 油浓度在3-40g/L范围，发酵培养48小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：2R,3R- 丁二醇0.8g/L，内消旋-2,3-丁二醇3.9g/L，2S,3S-丁二醇0.2g/L。2R,3R- 丁二醇在总丁二醇中所占的比例为16%。
<110>中国科学院上海高等研究院
<120>克雷伯氏肺炎杆菌生产2R,3R-丁二醇的方法
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>26
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<213>人工序列
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<213>克雷伯氏肺炎杆菌
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