水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌的PADLOCK探针及多重检测方法.pdf

本发明用于检测水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的padlock探针及其多重检测方法属于农作物防病治病及植物检疫范畴。水稻白叶枯病菌的padlock探针序列：P-x.o.o：GGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTACTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC。水稻细菌性条斑病菌的padlock探针序列：P-x.o.oc：CCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC。以此探针为基础结合Macroaary技术能够同时检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌，这种多重检测方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。图为Padlock探针结合Macroaary技术同时检测水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌结果。

1、  用于检测水稻白叶枯病菌的padlock探针序列：
P-x.o.o：5’-GGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTAP_IP₂^＊GAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC-3’

2.  用于检测水稻细菌性条斑病菌的padlock探针序列：
P-x.o.oc：5’-CCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGP_IP₂^＊GCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC-3’

3、  权利要求Padlock探针结合Macroarray技术检测方法，包括如下步骤：
(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用两条探针P-x.o.o、P-x.o.oc经地高辛标记的通用引物对连接产物进行扩增。(3)Macroaary多重检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些病原物。

水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌的padlock探针及多重检测方法
(一)技术领域
本发明涉及检测水稻白叶枯病菌(Xanthomonas.oryzae pv.oryzae)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas.oryzae pv.oryzicole)的padlock探针以及能够同时检测这两种植物病原菌的多重检测方法，属于生物技术领域。适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
(二)背景技术
水稻白叶枯病是一个世界性病害，每年给水稻生产造成的损失轻则10％，重则30％，甚至可达50％以上。自1884年在日本发生以来，相继在亚洲、欧洲、大洋洲、非洲和北美洲均有发现(Mew T.1989)，目前其发生范围已遍及全球水稻栽培地区(Ou SH.1985；Mew TW 1987；Swing J M.1990)。水稻细菌性条斑病亦是危害水稻的重要细菌病害，其危害仅次于水稻白叶枯病，属国内植物检疫性病害。在国外，俄罗斯、韩国、澳大利亚、美国等均把它列为检疫性有害生物。在热带亚洲各国均有发现，在非洲中部亦有发生。中国主要分布在华南稻区，近年来在长江流域杂交稻上亦有发现。水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌均借种子调运做远距离传播。因此，在国内调种引种前，尽量到产地实地考察进行产地检验，十分有效且完全必要。检测技术先进、可靠，外来有害生物传入的风险就可以降低。
目前已有很多不同的PCR检测技术应用于水稻白叶枯和细菌性条斑病菌的检测和鉴定。Sakthivel等(2001)利用IS1113序列设计了一对引物TXT和TXT4R，通过PCR对水稻白叶枯病菌进行扩增，得到片段大小为964bp的扩增引物。该方法可以快速简便的从受侵染的稻种和稻株上检测到白叶枯病菌，但是引物的转化性不够强，不能很好的区分出条斑病菌。廖晓兰等(2003)成功建立了水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。结果表明，两个特异性探针能分别特异性检测到病原菌产生的荧光信号而其他参试菌不产生荧光信号，检测灵敏度为10³cfu/ml-10⁵cfu/ml，该方法可以有效地避免传统PCR方法无法避免的非特异性扩增和假阳性现象。
近年来的调查研究发现，水稻白叶枯病和条斑病在同一稻田可以同时发生，甚至在同一叶片上出现两种病害的症状(黄瑞荣等，1996)。已有许多研究者通过设计专化性引物来检测白叶枯病菌和条斑病菌，但是由于这两种病菌是水稻黄单胞菌的不同致病变种，在生理生化等方面比较类似，还存在不同程度的交互抑制作用(王长方等，1999)，通过PCR扩增往往产生交叉反应，因而很难把白叶枯病菌和条斑病菌完全区分开来。虽然，在实时定量PCR应用到植物病原菌检测以后，通过在实时定量PCR的反应体系中加入不同的荧光染料，根据不同染料发出荧光颜色的差异来区分不同的病原物(Heid et al，1996)。但是，这种方法仍存在缺陷，由于受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪光源是单一光源问题(Martin et al，2000)，因此不能同时检测非常多的病原物。所以我们极有必要建立能够同时检测这两种病原菌的多重检测方法。
Padlock探针(PLPs)的发明为植物病原菌的高通量分子检测提供了一条新的思路。Padlock探针是一条长度为100bp左右的单核苷酸探针(图1)，包括磷酸化的5’端和羟基化的3’端，这两端能够识别特定目标物的DNA序列(Nilsson et al，1994)，我们通常称之为T1端和T2端。在T1端和T2之间，存在着一段通用序列和一段特异序列，我们称之为P1、P2端和ZipCode。在进行反应时，首先将padlock探针和要检测的目标DNA进行连接，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的T1端和T2端通过和特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’端和3’端连成环状。由于TaqDNA连接酶的特性，只有DNA序列和探针的T1端和T2端完全互补时，探针才能形成环状，否则，探针以线性存在。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针，然后采用所有探针的通用端T1端和T2端的引物对切除后的产物进行滚环扩增。然后将扩增后的产物与固定在膜上或者Microarray上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交(Shoemaker etal，1996)。通过膜上的地高辛标记信号或者Microarray上的荧光来判断检测样品中是否有特定的病原物。由于padlock探针可与Macroarray或者Microarray技术相结合，因此能够在检测的过程中实现高通量(Hardenbol et al，2003)。目前，padlock探针独特的设计多与基因芯片相结合应用于病毒性疾病分子的检测(Baner J et al，2007)和单核苷酸突变检测当中(Baner J et al，2003)。目前尚未有将padlock探针应用于植物病原菌实际检测的实例。
参考文献
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廖晓兰等。2003。水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR快速检测鉴定。微生物学报43(5)：626-634。
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(三)发明内容
技术问题
本发明的目的是解决现有技术中对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的分子检测方法难以实现多重检测等问题，提供分别用于检测水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的padlock探针以及同时检测这两种病原菌的分子检测方法，对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌进行检测，灵敏度高、特异性强。
技术方案
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足，提供快速、可靠、灵敏度高、特异性强的检测水稻白叶枯病菌的padlock探针和检测水稻细菌性条斑病菌的padlock探针以及能够同时检测这两种病原菌的分子检测方法。
实现上述目的的技术方案：
1)用于检测水稻白叶枯病菌的padlock探针序列：
P-x.o.o：5’-GGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTAP_IP₂^＊GAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC-3’
2)用于检测水稻细菌性条斑病菌的padlock探针序列：
P-x.o.oc：5’-CCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGP_IP₂^＊GCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC-3’
探针的靶标识别序列(即5’末端和3’末端)取自待测病原菌16S-23S rDNA(ITS)区域特异的核酸序列。探针中间P_IP₂(CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGT)为通用引物结合区，加下划线的碱基序列(即Zipcode序列)用于识别固定在尼龙膜上的cZipcode探针。
3)Padlock探针是一种长寡核苷酸探针，其两端的序列可通过核酸间的互补与靶标DNA结合。通过和靶标DNA的杂交，padlock探针的两端在连接酶的作用下连成环状，具有非常高的特异性。Padlock探针可与Macroarray技术结合进行多重检测。Padlock探针结合Macroarray技术检测方法，包括如下步骤：(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用两条探针P-x.o.o、P-x.o.oc经地高辛标记的通用引物对连接产物进行扩增。(3)Macroaary多重检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些病原物。
有益效果采用上述技术方案，突出的技术进步在于：
(1)本发明设计了分别适用于水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌检测的padlock探针。(2)本发明利用padlock探针结合Macroaary技术，实现了对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的多重检测，检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。(3)采用padlock探针作为分子检测工具，有效地避免传统PCR检测方法的假阳性现象。传统的基于PCR扩增的分子检测通常只能检测单种病原物，荧光定量PCR的出现在一定程度上解决了这一问题，通过在反应的体系中添加不同荧光染料，可以同时检测1种以上的病原物。但是由于荧光染料种类的限制和彼此之间的干扰，采用这种方法对多种病原物进行检测时候效果往往不好。采用padlock探针作为分子检测工具，结合Macroaary技术弥补了实时定量PCR检测因受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪光源是单一光源等问题而不能同时检测非常多的病原物的不足。
(四)说明书附图
图1.Padlock探针结构示意图及检测原理。
图2A.水稻白叶枯病菌特异性验证结果。
M为DNA Maker DL2000，1～10为水稻白叶枯病菌，11～21为其他细菌，22为阴性对照。
图2B.水稻细菌性条斑病菌特异性验证结果
M为DNA Maker DL2000，1～10为水稻细菌性条斑病菌，11～22为其他细菌，23为阴性对照。
图3水稻白叶枯和水稻细菌性条斑的灵敏度验证结果。
M为DNA Maker DL2000，1-6为病原菌DNA依次为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg7为阴性对照。分别以十倍梯度稀释的DNA为模板，利用padlock探针检测，最低可检测到1pg。
图4水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的多重检测结果。
A.Xanthomonas oryzae pv.oryzae；B.Xanthomonas oryzae pv.oryzicola；
C.Xanthomonas oryzae pv.oryzae and Xanthomonas oryzae pv.oryzicola；D.Layout ofmulti-chamber universal tag array on nylon membrane.cZip control＝TATGGTCGGCAATTCCCTGC。
结果表明，利用padlock探针结合Macroaary技术可以成功地对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌进行多重检测。
图5利用Padlock探针结合Macroaary技术对田间发病的水稻样品检测结果。
结果表明，利用padlock探针结合Macroaary技术可以成功地对田间发病的水稻样品进行检测。
(五)具体实施方式
实施例1：一种利用padlock探针结合Macroaary技术的多重检测方法，用于同时检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。
用于检测水稻白叶枯病菌的padlock探针序列：
P-x.o.o：5’-GGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTAP_IP₂^＊GAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC-3’用于检测水稻细菌性条斑病菌的padlock探针序列：
P-x.o.oc：5’-CCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGP_IP₂^＊GCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC-3’
(1)连接反应液包括：20mM Tris-HCL，pH 9.0，25mM KCH₃COO，10mMMg(CH₃COO)₂，10mM DTT，1mM NAD，0.1％Triton X-100，2.4U Taq DNA连接酶，1μl待测模板，探针P-x.o.oc、P-x.o.oc各100pm。连接的反应程序为：95℃预变性5分钟；然后进入循环，95℃变性30秒，65℃连接5分钟，反应共进行20个循环；然后95℃灭活15分钟。采用核酸外切酶切除自连和错连的探针：在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶I和2个单位的核酸外切酶III，37℃反应2个小时，然后将反应后的产物95℃灭活3小时。
(2)采用经地高辛标记的通用引物P1-F(5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’)P2-R(5’-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3’)对连接产物进行PCR扩增，反应液包括：0.5μMP1-F和P2-R，4种dNTP各50μM，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2mMc Mg²⁺2.5μl1％BSA，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，3μl经核酸外切酶处理后的连接产物。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。
(3)Macroaary多重检测。各取1μL cZipcode探针点于尼龙膜上，，每条cZipcode探针重复4次，经紫外交联30s固定。将固定好的膜放入杂交管中，加入预杂交液(0.02％SDS、5×SSC、50％去离子甲酰胺、0.1％N-laurysarosine、50mmol·L^-1磷酸钠、pH 7.02％封闭剂)于杂交炉中42℃预杂交1h，弃预杂交液，将经地高辛标记的扩增产物沸水浴中变性10min，迅速移至冰上，5分钟后加入预杂交液中，42℃杂交过夜后，用大量2×SSC、0.1％SDS室温洗膜2次，每次5min，再用0.5×SSC、0.1％SDS于68℃洗膜2次，每次15min。洗膜后把膜加入洗涤液(0.1mol·L^-1马来酸、0.15mol·L^-1NaCl，pH 7.5、0.3％吐温)中洗膜2min，弃去，用封闭液(1％封闭剂、0.1mol·L^-1马来酸、0.15mol·L^-1NaCl，pH 7.5)封闭30min后，加入用封闭液稀释了5000倍的Anti-DIG-AP，轻摇30min。最后，将结合完抗体的膜用洗涤液洗膜2次，每次15min，加入检测液(0.1mol·L^-1Tris-HCl、0.1mol·L^-1NaCl、pH 9.5)平衡3min，再加入NBT/BCIP溶液，黑暗中静止显色2h，待观察到理想的显色后，用无菌水浸泡10min终止反应，进行拍照。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些病原物。
实例1从安徽发病的水稻中检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌：
上述水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的padlock检测探针及其多重检测方法用于检测安徽的发病水稻，方法包括：
1)将安徽发病的水稻样品分别从其根部(R)、茎杆(S)以及叶片(L)提取DNA作为检测模板，提取方法参照Mc Mcouch S R(1988)。
2)参照上述技术方案利用padlock检测探针P-xoo、P-xooc结合Macroaary检测样品。检测结果见图5。结果表明从安徽发病的60份水稻样品中共检测出19份带有白叶枯病菌，17分带有细菌性条斑病菌。证明了上述技术方案能够应用于水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的实际检测。