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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510983745.9 (22)申请日 2015.12.24 C12P 33/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区上下店路 15 号 (72)发明人 吴小平 叶丽云 林强 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种提高灵芝液体发酵中三萜含 量的方法， 包括配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶 液、 菌丝液体培养、 。
2、钙离子和水杨酸诱导、 菌丝收 集、 菌丝三萜提取与检测。在灵芝液体发酵过程 中加入钙离子和水杨酸进行诱导， 能够显著提高 灵芝菌丝中三萜的含量， 菌丝的三萜含量达48.97 mg/g， 比对照组高 48.26%， 有效提高灵芝的质量， 而且操作方法简单、 成本低。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105483197 A 2016.04.13 CN 105483197 A 1.一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法， 其特征在于操作步骤如下： （1） 配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液： 用CaCl2。
3、和无菌水配制10mM钙离子水溶液； 用 水杨酸和乙醇， 配制150M水杨酸乙醇溶液； （2） 菌丝液体培养： 用9mm打孔器从长满灵芝菌丝的平板上打出8块菌丝接入100mL液 体PDA中， 28， 150rpm摇床培养6-7天， 然后再静置培养5-6天； 所述液体PDA配方为： 200g 马铃薯煮沸浸出液、 20g葡萄糖、 加水定容到1000mL， 121灭菌30min； （3） 钙离子和水杨酸诱导： 取步骤 （1） 的钙离子水溶液1-5mL和水杨酸乙醇溶液0.5- 1.5mL， 混匀， 采用滤膜除菌法加入到步骤 （2） 已接种培养的PDA培养液中， 28生化培养箱 中诱导处理1-2天； （4。
4、） 菌丝收集： 收集步骤 （3） 诱导处理后的菌丝， 并除去接种块， 用蒸馏水洗涤3-5次， 置 于60烘箱中烘干至恒重； （5） 菌丝三萜提取与检测： 取步骤 （4） 烘干的菌丝用乙醇常温浸提2h后， 150W超声0.5h， 60旋转蒸干， 用甲醇溶解定容， 并采用香草醛-冰醋酸法检测三萜含量。 2.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法， 其特征在于所述 菌丝液体培养： 用9mm打孔器从长满灵芝菌丝的平板上打出8块菌丝接入100mL液体PDA中， 28， 150rpm摇床培养7天， 然后再静置培养5天。 3.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法， 其特。
5、征在于所述 钙离子和水杨酸诱导： 取钙离子水溶液1mL和水杨酸乙醇溶液1mL， 混匀， 采用滤膜除菌法加 入到已接种培养的PDA培养液中， 28生化培养箱中诱导处理1天。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105483197 A 2 一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高食用菌液体发酵中三萜含量的方法， 具体涉及一种提高灵芝 液体发酵中三萜含量的方法。 技术背景 0002 灵芝Ganodermalucidum （Curtis： Fr.） P.Karst古称为瑞草， 又名为赤芝、 万年 蕈 、 红芝 、 灵芝草等 ,在真菌的 分类地位上 属于真菌界 （Myc。
6、ota） ， 担子菌亚门 （Basidiomycotina） ,层菌亚纲 （Hymenomycetes） ， 非褶菌目 （Aphyllophorales） ， 多孔菌科 （Polyproraceae） ， 灵芝属 （Ganoderma） 。 灵芝三萜具有良好的药理作用， 主要表现在抑制癌 细胞的生长、 保肝护肝、 降血压、 抗HIV等。 0003 灵芝品质的好坏与灵芝三萜的含量着密切相关。 目前生产上获得灵芝三萜类化合 物的来源主要是成熟子实体和液体发酵的菌丝。 通过液体发酵技术来提取灵芝的三萜的周 期较短， 且操作简单。 随着市场上灵芝产品的不断推出， 就要求更加高效地生产灵芝三萜。 因此，。
7、 探索如何有效提高灵芝液体发酵中三萜的含量， 具有广泛的应用前景。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法， 适应市场需求， 也为灵芝有效成分分析提供依据。 0005 本发明的一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法， 操作步骤如下： （1） 配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液： 用CaCl2和无菌水配制10mM钙离子水溶液； 用 水杨酸和乙醇， 配制150M水杨酸乙醇溶液； （2） 菌丝液体培养： 用9mm打孔器从长满灵芝菌丝的平板上打出8块菌丝接入100mL液 体PDA中， 28， 150rpm摇床培养6-7天， 然后再静置培养5-6天； 所述液体PDA配。
8、方为： 200g 马铃薯煮沸浸出液， 20g葡萄糖， 加水定容到1000mL， 121灭菌30min； （3） 钙离子和水杨酸诱导： 取步骤 （1） 的钙离子水溶液1-5mL和水杨酸乙醇溶液0.5- 1.5mL， 混匀， 采用滤膜除菌法加入到步骤 （2） 已接种培养的PDA培养液中， 28生化培养箱 中诱导处理1-2天； （4） 菌丝收集： 收集步骤 （3） 诱导处理后的菌丝， 并除去接种块， 用蒸馏水洗涤3-5次， 置 于60烘箱中烘干至恒重； （5） 菌丝三萜提取与检测： 取步骤 （4） 烘干的菌丝用乙醇常温浸提2h后， 150W超声0.5h， 60旋转蒸干， 用甲醇溶解定容， 并采用香草。
9、醛-冰醋酸法检测三萜含量。 0006 本发明的优点及有益之处： 在灵芝液体发酵过程中加入钙离子和水杨酸进行诱 导， 能够显著提高灵芝菌丝中三萜的含量， 提高灵芝的质量， 而且操作简单成本低。 灵芝三 萜是灵芝中主要的药理活性成分， 通过添加钙离子和水杨酸的诱导， 能够有效的提高灵芝 液体发酵中三萜的含量， 菌丝的三萜含量达48.97mg/g， 比对照组高48.26%。 说明书 1/3 页 3 CN 105483197 A 3 附图说明 0007 图1为不同培养时间菌丝的三萜含量示意图。 图中， 横坐标表示培养的天数， 纵坐 标表示三萜含量mg/g。 0008 图2为添加钙离子和水杨酸对灵芝三萜。
10、含量的影响示意图。 图中， CK为对照， Ca+SA 表示用本发明的方法添加钙离子和水杨酸进行诱导处理； *表示与对照有显著差异， P 0.05； 纵坐标表示三萜含量mg/g。 未添加钙离子和水杨酸的菌丝， 三萜含量为33.03mg/g； 添加钙离子和水杨酸的菌丝三萜含量为48.97mg/g， 比对照组高48.26%。 具体实施方式 0009 为了充分公开本发明的提高灵芝液体发酵中三萜的含量的方法， 以下结合实例加 以说明。 0010 实施例1： 一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法。 包括以下步骤： （1） 配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液： 用CaCl2和无菌水配制10mM钙离子水溶液。
11、； 用水杨酸和乙醇， 配制150M水杨酸乙醇溶液； （2） 菌丝液体培养： 采用市场购买的灵芝菌株， 在PDA斜面进行活化后接入90mm的平板， 待平板上长满菌丝后， 用9mm打孔器打出8块菌丝接入100mL液体PDA中， 28， 150rpm摇床 培养7天， 然后再静置培养5天； 所述液体PDA配方为： 200g马铃薯煮沸浸出液， 20g葡萄糖， 加水定容到1000mL， 121灭菌30min； 不同培养时间菌丝的三萜含量如图1所示； 当培养到 第13天， 菌丝中三萜含量达到最大值33.03mg/g。 0011 （3） 钙离子和水杨酸诱导： 取步骤 （1） 的钙离子水溶液1mL和水杨酸乙醇溶。
12、液1mL， 混匀， 采用滤膜除菌法， 即采用1mL无菌注射器经孔径为0.22m已灭菌的有机滤头， 加入到 步骤 （2） 已接种培养的PDA培养液中， 28生化培养箱中诱导处理1天。 添加钙离子和水杨酸 对灵芝三萜含量的影响如图2所示， 添加钙离子和水杨酸的菌丝三萜含量为48.97mg/g， 比 对照组高48.26%。 0012 （4） 菌丝收集： 收集步骤 （3） 诱导处理后的菌丝， 并除去接种块， 用蒸馏水洗涤5次， 置于60烘箱中烘干至恒重； （5） 菌丝三萜提取与检测： 称取烘干的菌丝0.2g， 用30mL85% （v/v） 乙醇常温浸提2h后， 150W超声0.5h， 60旋转蒸干， 。
13、最后用甲醇溶解定容至25mL。 采用香草醛-冰醋酸法检测三 萜含量。 0013 所述香草醛-冰醋酸法检测三萜含量： 取0.2mL的样品溶液于具塞试管中， 在60 水浴锅中蒸干， 加入0.4mL的5%香草醛-冰醋酸 （现配现用） 和1mL的高氯酸， 摇匀后60水浴 15min.冷却至室温后再加入5mL的冰醋酸， 摇匀后室温静置0.5h， 546nm进行OD值检测。 0014 实施例2： 一种提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法。 包括以下步骤： （1） 配制CaCl2水溶液和水杨酸乙醇溶液： 用CaCl2和无菌水配制10mM钙离子水溶液； 用水杨酸和乙醇， 配制150M水杨酸乙醇溶液； （2） 菌丝。
14、液体培养： 采用市场购买的灵芝菌株， 在PDA斜面进行活化后接入90mm的平板， 待平板上长满菌丝后， 用9mm打孔器打出8块菌丝接入100mL液体PDA中， 28， 150rpm摇床 培养6天， 然后再静置培养6天； 说明书 2/3 页 4 CN 105483197 A 4 （3） 钙离子和水杨酸诱导： 取步骤 （1） 的钙离子水溶液5mL和水杨酸乙醇溶液1.5mL， 混 匀， 采用滤膜除菌法加入到步骤 （2） 已接种培养的的PDA培养液中， 28生化培养箱中诱导 处理2天。 0015 （4） 菌丝收集： 用纱布收集步骤 （3） 诱导处理后的菌丝， 并除去接种块， 用蒸馏水洗 涤3次， 置于60烘箱中烘干至恒重。 0016 （5） 菌丝三萜提取与检测： 称取烘干的菌丝0.2g， 用30mL85% （v/v） 乙醇常温浸提2h 后， 150W超声0.5h， 60旋转蒸干， 最后用甲醇溶解定容25mL， 并采用香草醛-冰醋酸法检 测三萜含量。 0017 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 3/3 页 5 CN 105483197 A 5 图1 图2 说明书附图 1/1 页 6 CN 105483197 A 6 。