甲壳素脱乙酰酶的制备新方法.pdf

本发明涉及甲壳素脱乙酰酶(Chitin deacetylase，E.C.3.5.1.41，CDA)的制备新方法，以虾壳培养土为筛选原材料，用抗真菌药抑制真菌的生长，依次采用平板涂布、平板划线等方法进行纯化，同时用N-对硝基乙酰苯胺(PN)-酪蛋白平板进行CDA活性验证，分离得到能分泌CDA的蜡样芽胞杆菌。通过液体发酵制备CDA，发酵液上清的CDA活力为0.598-0.912U/ml；该CDA具有与文献报道不一样的酶学性质。利用蜡样芽胞杆菌分泌CDA至胞外，产物较易获得，而且细菌适合于大规模工业发酵，无需加工改造即可应用。

1.  甲壳素脱乙酰酶(Chitin deacetylase，E.C.3.5.1.41，CDA)的制备新方法，通过蜡样芽胞杆菌胞外分泌CDA的方法进行制备，其特征在于以虾壳培养土为筛选原材料，用抗真菌药抑制霉菌等真菌的生长，依次采用平板涂布、平板划线等方法进行纯化，同时用N-对硝基乙酰苯胺(PN)-酪蛋白平板(0.5％酪蛋白，0.1％K₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄，2％琼脂，0.1％PN)进行CDA活性验证；将分离得到的蜡样芽胞杆菌液体发酵培养(0.5％酪蛋白，0.1％K₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄)，分泌CDA。

2.  如权利要求1所述的CDA的制备新方法，其特征在于筛选得到的能分泌CDA的菌株为蜡样芽胞杆菌，其菌落菌体形态及生化反应特征均符合蜡样芽胞杆菌的特点。

3.  如权利要求1所述的CDA的制备新方法，其特征在于分泌的CDA最适pH为8.2，最适温度约为58℃，Zn²⁺，Fe²⁺，Pb²⁺，Fe²⁺，Zn²⁺，Pb²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Na⁺均可增强酶活力，而NH4⁺，LI⁺，Ba²⁺，Cu²⁺则抑制酶活力；在一定浓度范围内(0.1-0.3mmol/L)，Cl^-随浓度的增加，对酶活力的促进作用增强；对甲壳素及其衍生物(如乙酰化乙二醇壳聚糖)，N-乙酰氨基-D-葡萄糖，丙烯酰胺等都表现出明显的活性。

甲壳素脱乙酰酶的制备新方法
技术领域
本发明涉及的是一种甲壳素脱乙酰酶(Chitindeacetylase，E.C.3.5.1.41，CDA)的制备新方法，具体而言是通过蜡样芽胞杆菌胞外分泌CDA。
背景技术
甲壳素由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β-1，4-糖苷键连接而成，是一种数量丰富、简单易得、可更新循坏的天然高分子聚合物，常见于无脊椎动物的外壳或角质层，在许多真菌和一些藻类的细胞壁中也有发现。甲壳素由于溶解性差，应用范围受到限制；而甲壳素的脱乙酰化产物——壳聚糖的降解产物壳寡糖不仅水溶性好、易吸收，而且具有抗肿瘤、抗细菌、免疫激活及保湿吸湿等特点。因此，甲壳素的脱乙酰化对于甲壳素的开发应用具有非常重要的意义。
甲壳素脱乙酰化的方法主要有化学法和酶法两种。在化学法脱乙酰基反应中，影响脱乙酰度的因素很多，同时会伴随甲壳素主链的降解，从而影响产品的粘度和分子量，而且其排放水还会对环境造成严重污染。与化学法相比，酶法是一种节能、高效、无污染的有效途径。酶法中常用的酶有甲壳素酶、壳聚糖酶、CDA，其中CDA的作用最彻底，效果也最好。利用CDA的催化作用，可以制备出脱乙酰度高且性能独特的壳聚糖产品(如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄的壳聚糖产品，以及具有特定乙酰化位置的壳聚糖等)。
目前，文献报道的微生物来源的CDA有两大特点。第一，CDA多来源于真菌，主要来自于接合菌纲(如Mucor rouxii)和半知菌纲(如Colletotrichum lindemuthianum)。这些菌株产CDA能力低下，酶活力不高，加之真菌难以用于工业大规模发酵，因此必须利用基因工程的方法加以改造后才能应用。第二，目前文献报道能产生CDA的细菌仅2株(Colletotrichum lindemuthia-num ATCC56676、Colletotrichumlindemuthianum DSM63144)，都为产碱杆菌属，其CDA对底物要求较严格，只能以甲壳素、壳聚糖及其衍生物为底物。
发明内容
本发明首次利用蜡样芽孢杆菌胞外分泌CDA。综合比较以上能产生CDA的微生物，该蜡样芽孢杆菌产酶能力稳定、容易通过发酵方式获得产物，适合用于工业大规模发酵，具有潜在工业应用价值。
本发明所述蜡样芽孢杆菌分泌CDA的研究内容如下：
1菌种的筛选及纯化：
1.1平板涂布：将虾壳培养土(南瓜地中埋入淡水虾壳、自然腐化25-35天后所得)用3倍体积的无菌生理盐水(含抗真菌剂)浸泡6h后过滤取清液，涂布于牛肉膏蛋白胨平板(0.9％牛肉膏，3％蛋白胨，0.15％NaCl，2％琼脂，pH 7.2)，37℃恒温培养36h。
1.2平板划线：从牛肉膏蛋白胨平板上选取不同菌落形态的单一菌落，分别于牛肉膏蛋白胨平板上连续划线分离。
1.3CDA活性验证：从划线平板上选取不同菌落形态的单一菌落，分别接种于N-对硝基乙酰苯胺(PN)-酪蛋白平板(0.5％酪蛋白，0.1％K₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄，2％琼脂，0.1％PN)上，37℃恒温培养48h。挑选使培养基变黄(无色的PN乙酰基被去掉后转化为黄色对硝基苯胺)的菌落为具有潜在分泌CDA能力的菌株。
重复平板划线和CDA活性验证，获得具有潜在分泌CDA能力的纯培养菌株。
2液体发酵及CDA活力测定
2.1液体发酵：将纯化得到的菌株接种至酪蛋白培养液(0.5％酪蛋白，0.1％K₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄)，37℃振摇培养48h后，离心(3000g×15min)收集上清液。
2.2CDA活力验证：将适量上清液转至PN-酪蛋白平板上的小孔内，37℃恒温培养48h后发现小孔四周形成黄色。
2.3CDA活力测定：参照Araki and Ito(1975)方法测定上清液CDA活力：1个酶活力单位定义为每分钟从乙酰化的乙二醇壳聚糖(EGC)脱去1μmol乙酰基所需的酶量，相当于每分钟产生1μmol氨基葡萄糖所需的酶量。结果表明，该菌株的培养液上清具有CDA活力，为0.598-0.912U/ml，这说明分离得到的菌能分泌CDA至胞外。与能产生CDA的真菌相比较，该菌株能分泌CDA至胞外，产物较易获得，而且细菌适合于大规模工业发酵，无需加工改造即可应用。
3菌种的鉴定：分离所得的菌株，在培养液中生长浑浊、有菌膜、振摇乳化。在牛肉膏蛋白胨平板上生长的菌落较大，直径3-10mm，灰白色不透明，表面似融蜡状，在光学显微镜(革兰氏染色后)下观察，其形态特征为呈短链或长链。菌落菌体形态及生化反应特征(表1和表2)表明本发明所分离的细菌为蜡样芽孢杆菌。
表1.菌落及菌体形态

注1+：阳性反应；-：阴性反应
注2参考文献：刘锡光主编现代诊断微生物学，人民卫生出版社，2002(1)：570-576
本发明的上述方法分离得到了一种可分泌CDA的细菌，根据菌落菌体形态及生化反应特征，此菌株为蜡样芽胞杆菌。目前有关该菌属的性质及功能记载中，尚未见到具有上述分泌CDA的特性。
4菌株分泌的CDA性质研究：以乙酰化EGC为底物进行研究，该CDA的最适pH为8.2(图2)，最适温度约为58℃(图3)，Zn²⁺，Fe²⁺，Pb²⁺，Fe²⁺，Zn²⁺，Pb²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Na⁺均可增强酶活力，而NH4⁺，LI⁺，Ba²⁺，Cu²⁺则抑制酶活力(表3)；在一定浓度范围内(0.1-0.3mmol/L)，Cl^-随浓度的增加，对酶活力的促进作用增强(图4)。底物专一性为相对专一，对甲壳素及其衍生物(如乙酰化EGC)，N-乙酰氨基-D-葡萄糖，丙烯酰胺等都表现出明显的活性(表4)。
表4.酶对不同底物的作用

注：所用酶为培养液上清所含粗酶
表3不同离子对酶活力的影响

ΔCDA活性为离子加入后酶活与未加入离子前酶活的差值。加入的盐溶液均以Cl^-为阴离子，且Cl^-浓度均为100mmol/L。酶活力测定时采用最适pH条件，同时用未加乙酰化EGC底物作空白对照组，以消除离子对光的吸收在比色时可能带来的干扰。
与文献报道的真菌来源CDA相比较，本发明分离的蜡样芽胞杆菌分泌的CDA的最适pH与Colletotrichum lindemuthianum DSM63144产生的CDA接近，但最适温度较所有的真菌来源CDA高约8℃，且底物作用专一性与真菌来源CDA的绝对专一性不同。与文献报道的细菌(Baci Luu)来源CDA相比较，本发明分离的蜡样芽胞杆菌分泌的CDA也具有不同的酶学性质(最适pH高，最适温度高，Cu²⁺对酶活力有抑制作用而非激活作用)，而且被分泌到胞外而非周质空间，但对底物的专一性都是相对专一。
以下结合附图所示的试验结果，通过若干实例的具体实施方法，再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主体的范围仅局限于下述的实例。凡给予本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是菌株在PN-酪蛋白平板上的生长形态
图2是pH对酶活力的影响
图3是温度对酶活力的影响
图4是不同浓度NaCl对酶活力的影响
具体实施方式
实例1：(1)平板涂布：将虾壳培养土(南瓜地中埋入淡水虾壳、自然腐化31天后所得)用3倍体积的无菌生理盐水(含有300ppm多菌灵)浸泡6h后过滤取清液，涂布于牛肉膏蛋白胨平板(0.9％牛肉膏，3％蛋白胨，0.15％NaCl，2％琼脂，pH 7.2)，37℃恒温培养36h。
(2)平板划线：从牛肉膏蛋白胨平板上选取不同菌落形态的单一菌落，于牛肉膏蛋白胨平板上进行划线分离。
(3)CDA活性验证：从划线平板上选取不同菌落形态的单一菌落至PN-酪蛋白平板(0.5％酪蛋白，0.1％K₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄，2％琼脂，0.1％PN)上，37℃恒温培养48h。挑选使培养基变黄(无色的PN乙酰基被去掉后转化为黄色对硝基苯胺)的菌落为具有潜在分泌CDA能力的菌株，继续用平板划线的方法分离纯化。重复CDA活性验证和平板划线4次，获得一个具有潜在分泌CDA能力的纯培养菌株。
实例2：(1)液体发酵：将纯化得到的菌株接种至酪蛋白培养液(0.5％酪蛋白，0.1％K₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄)，37℃振摇培养48h后，离心(3000g×15min)收集上清液。
(2)CDA活性验证：将适量上清液转至PN-酪蛋白平板上的小孔内，37℃恒温培养48h后发现小孔四周形成黄色。
(3)CDA活力测定：参照Araki and Ito(1975)方法测定上清液CDA活力：1个酶活力单位定义为每分钟从乙酰化的EGC脱去1μmol乙酰基所需的酶量，相当于每分钟产生1μmol氨基葡萄糖所需的酶量；以氨基葡萄糖盐酸盐作标准曲线，定量测定培养液上清液催化产生氨基葡萄糖的能力，即CDA活力。结果表明，该菌株的培养液上清具有CDA酶活力，为0.755U/ml。