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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610017621.X (22)申请日 2016.01.12 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818 号 (72)发明人 潘道东 程克文 陈伟 吴振 孙杨赢 曹锦轩 曾小群 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 33226 代理人 何仲 (54) 发明名称 一种食品致病菌 PCR 扩增产物的快速检测方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种食品致病菌 PCR。
2、 扩增产物 的快速检测方法， 特点是包括以下步骤 ： 将待测 食品致病菌 PCR 扩增产物中加入 50M 血晶素溶 液后， 于 37反应 10min 后加入 TMB 显色液， 在 室温下孵育 5-10min 直至溶液颜色变成蓝色， 用 0.16M 的 H2SO4溶液终止后， 通过颜色变化确定待 测样品中是否含有食品致病菌， 其中待测食品致 病菌PCR扩增正向引物或者反向引物的5 端链接 有辣根过氧化酶互补序列， 其基因序列为 AAAAAA TTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCC CTACCC AAAAA， 优点是检测速度快、 灵敏度和特异 性高。 。
3、(51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图4页 CN 105543368 A 2016.05.04 CN 105543368 A 1.一种食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法， 其特征在于包括以下步骤： 将待测食 品致病菌PCR扩增产物中加入50 M血晶素溶液后， 于37反应10min后形成G-四联体， 然 后加入TMB显色液， 在室温下孵育5-10min直至溶液颜色变成蓝色， 用0.16M的H2SO4溶液 终止后， 通过颜色变化确定待测样品中是否含有食品致病菌， 其中所述的待测食品致病菌 PCR扩增正向引。
4、物或者反向引物的5 端链接有辣根过氧化酶互补序列， 所述的辣根过氧化 酶互补序列的基因序列为AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCC AAAAA。 2.根据权利要求1所述的一种食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法， 其特征在于： 所述的待测食品致病菌PCR扩增产物、 所述的血晶素溶液、 所述的TMB显色液与所述的H2SO4 溶液的体积比为5： 1： 4： 25。 3.根据权利要求2所述的一种食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法， 其特征在于： 所述的TMB显色液的配方为8 LHEPES缓冲液， 4 L500mM的KCl溶液。
5、， 4 LH2O2。 4.根据权利要求1所述的一种食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法， 其特征在于所 述的待测食品致病菌PCR扩增体系中致病菌DNA模板采用磁珠法提取， 具体步骤如下： （1） 取1mL待测食品致病菌菌液， 10000r/min离心5min， 去上清， 沉淀溶于1mL细菌 裂解液中， 振荡15s， 70水浴12min， 以5000r/min离心， 得到1mL细胞裂解清液； （2） 在1mL细胞裂解清液中加入10 L磁性纳米粒子， 涡旋5s， 然后再加入600 L吸附 缓冲液混匀， 振荡反应15min， 磁性分离去上清； （3） 用1mL70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次， 。
6、室温放置30min， 使乙醇挥发完全； 再加入50 L洗脱缓冲液TE， 混匀后静置10min， 65水浴10min， 磁分离， 取上清， 即为待测食品致 病菌DNA模板溶液， -20备用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543368 A 2 一种食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法 技术领域 0001 本发明涉及致病菌检测， 尤其是涉及一种致病菌PCR扩增产物的快速检测方法。 背景技术 0002 食品是人类赖以生存的根本基础， 食品安全则关乎广大人民群众的身体健康和生 命安全， 频频爆发的食品安全事件不仅给人民群众的身体健康构成了严重威胁， 而且也给 消费者和食品相关产业造成了巨大。
7、的经济损失， 给社会、 经济、 政治的稳定和国家形象带来 不利的影响。 灵敏高效的食品安全检测技术在保障食品安全、 尤其是致病菌导致的食源性 疾病控制中具有至关重要的作用， 根据美国农业部经济研究局的统计结果显示， 沙门氏菌、 致病性大肠杆菌、 弯曲杆菌、 副溶血性弧菌、 葡萄球菌及毒素、 致病性蜡样芽胞杆菌、 产气荚 膜梭菌、 变形杆菌属、 李斯特菌、 志贺氏菌等几类重要的细菌会造成巨大的经济损失， 而志 贺氏菌具有高度传染性， 是引起感染性腹泻的主要致病菌之一； 致病性蜡样芽胞杆菌多存 在于蛋白质和碳水化合物丰富的米饭及肉类食品中， 可引起腹泻综合征及呕吐综合征。 人 们在食用被上述这些细。
8、菌污染的食物后， 可引起腹泻、 恶心、 呕吐， 严重者可致腹痛、 出血性 肠炎及尿毒综合征甚至死亡。 因此， 食品安全性检测与评价逐步受到我国及其他国家的重 视与关注。 0003 针对食品微生物污染的现状， 各国已经发展和衍生了多种食品微生物检测技术， 目前， 主要的几种快速检测技术包括实时荧光PCR法、 荧光免疫检测法、 基于PCR基础的凝胶 电泳法等， 但上述方法均有应用范围的局限性， 实时荧光PCR法检测成本高， 对致病菌的检 测范围小； 基于PCR基础的凝胶电泳法操作繁琐， 易引起污染。 因此， 寻找和建立一种快速、 高效、 准确的食品微生物的检测方法十分重要。 发明内容 0004 本。
9、发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、 灵敏度和特异性高的食品致 病菌PCR产物的快速检测方法。 0005 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 一种食品致病菌PCR扩增产物的 快速检测方法， 包括以下步骤： 将待测食品致病菌PCR扩增产物中加入50 M的血晶素溶液 后， 于37反应10min后形成G-四联体， 然后加入TMB显色液， 在室温下孵育5-10min直至 溶液颜色变成蓝色， 用0.16M的H2SO4溶液终止后， 通过颜色变化确定待测样品中是否含有 食品致病菌， 其中所述的待测食品致病菌PCR扩增正向引物或者反向引物的5 端链接有辣 根 过 氧 化 酶 互 补 序 列 ，。
10、所 述 的 辣 根 过 氧 化 酶 互 补 序 列 的 基 因 序 列 为 AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAA。 0006 所述的待测食品致病菌PCR扩增产物、 所述的血晶素溶液、 所述的TMB显色液与所 述的H2SO4溶液的体积比为5： 1： 4： 25。 0007 所述的TMB显色液的配方为8 LHEPES缓冲液， 4 L500mM的KCl溶液， 4 LH2O2。 0008 所述的待测食品致病菌PCR扩增体系中致病菌DNA模板采用磁珠法提取， 具体步 说明书 1/5 页 3 CN 105543368 A 3。
11、 骤如下： （1） 取1mL待测食品致病菌菌液， 10000r/min离心5min， 去上清， 沉淀溶于1mL细菌 裂解液中， 振荡15s， 70水浴12min， 以5000r/min离心， 得到1mL细胞裂解清液； （2） 在1mL细胞裂解清液中加入10 L磁性纳米粒子， 涡旋5s， 然后再加入600 L吸附缓 冲液混匀， 振荡反应15min， 磁性分离去上清； （3） 用1mL70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次， 室温放置30min， 使乙醇挥发完全； 再加入50 L洗脱缓冲液TE， 混匀后静置10min， 65水浴10min， 磁分离， 取上清， 即为待测食品致 病菌DNA模板溶液， -。
12、20备用。 OD260/280=1.8， 相对于普通试剂盒的提取纯度提高了20%左 右。 0009 所述的细菌裂解液的配方为50 L1M的Tris-HCl， 50 L15wt%的SDS溶液， 50 L 20mg/ml的蛋白酶k， 20 L0.5M的pH=5.0的EDTA， 2 LRNA酶， 用双蒸水补足至1mL； 所述的吸 附缓冲液的由80 L9wt%的聚乙二醇20000溶液和500 L的5M的NaCl溶液混合而成； 所述 的洗脱缓冲液TE的配方成分为10mM的Tris-HCl， 1mMEDTA， pH8.0。 0010 所述的待测食品致病菌PCR扩增体系为1 M待测食品致病菌正反向引物各2.。
13、5 L， 25mMMgCl2溶液2.5 L， 200 MdNTP2 L， 1.25UTaqDNA酶0.3 L和2.5 L待测食品致 病菌DNA模版， 用双蒸水补足至25 L； 反应条件： 95预变性4min； 5变性30s， 55退火 45s， 72延伸1min， 25个循环； 最后72延伸10min； 所述的待测食品致病菌为副溶血弧菌、 大肠杆菌或者空肠弯曲杆菌。 0011 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明首次公开了一种食品致病菌PCR扩增 产物的快速检测方法， 该方法在PCR扩增反应的反向引物或者正向引物的5 端链接辣根过 氧化酶互补的序列， 随着目标条带扩增的进行， 辣根过氧。
14、化酶序列也被扩增， 待扩增结束 后， 加入血晶素形成G-四联体， 此结构具有辣根过氧化酶的催化活性， 然后再加入新鲜配制 的试剂， G-四联体氧化刚加入的试剂， 使溶液颜色产生变化， 在特定的波长下用酶标仪检 测， 其检测原理图如图1和图2所示。 该检测工作可在5min内完成并得到检测结果； 能够快 速检测致病菌， 检测灵敏度达105cfu/mL， 实现传统凝胶电泳无法实现的快速实现致病菌的 半定量检测； 本发明只需将特异性目标引物进行相应替换， 即可实现其他目标物的快速、 灵 敏检测； 本发明还具有特异性高， 稳定性好， 应用范围广， 成本低廉等优点， 易于推广应用。 附图说明 0012 图。
15、1为本发明食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法的原理示意图一； 其中辣根 过氧化酶互补的序列与PCR扩增反向引物链接； 图2为本发明食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法的原理示意图二； 其中辣根过氧 化酶互补的序列与PCR扩增正向引物链接； 图3为实施例1中磁珠法提取的副溶血性弧菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图； 图中 M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 3.4*105， 3.4*106， 2.8*107， 1.1*108， 2.2*108 cfu/mL副溶血性弧菌的DNA的电泳条带； 图4为实施例1中不同浓度副溶血弧菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼。
16、脂糖凝胶电 泳图； 图中M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 提取3.4*105， 3.4*106， 2.8*107， 1.1*108， 2.2*108cfu/mL副溶血性弧菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照电泳 说明书 2/5 页 4 CN 105543368 A 4 条带； 图5为实施例1中不同浓度副溶血弧菌DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及显 色液后的吸光度图； 图中1、 2、 3、 4、 5分别代表提取3.4*105， 3.4*106， 2.8*107， 1.1*108， 2.2* 108cfu/mL副溶血性弧菌的DNA经PCR扩。
17、增显色后的吸光度图， 6代表阴性对照的吸光度图； 图6为实施例2中磁珠法提取的大肠杆菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图； 图中M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 提取1.3*105， 1.3*106， 1.1*107， 4.3*107， 8.6*107 cfu/mL大肠杆菌的DNA的电泳条带； 图7为实施例2中不同浓度大肠杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶电泳 图； 图中M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 1.3*105， 1.3*106， 1.1*107， 4.3*107， 8.6*107cfu/mL大肠杆菌的DNA。
18、经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照电泳条带； 图8为实施例2中不同浓度大肠杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及显色 液后的吸光度图； 图中1、 2、 3、 4、 5分别代表1.3*105， 1.3*106， 1.1*107， 4.3*107， 8.6*107 cfu/mL大肠杆菌的DNA经PCR扩增后显色后的吸光度图， 6代表阴性对照的吸光度图； 图9为实施例3中磁珠法提取的空肠弯曲杆菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图； 图中 M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 提取1.3*105， 1.2*106， 1.0*107， 4.1*107， 8.。
19、2*107cfu/mL空肠弯曲杆菌的DNA的电泳条带； 图10为实施例3中不同浓度空肠弯曲杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶 电泳图； 图中M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 1.3*105， 1.2*106， 1.0*107， 4.1*107， 8.2*107cfu/mL空肠弯曲杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照电泳 条带； 图11为实施例3中不同浓度空肠弯曲杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及 显色液后的吸光度图； 图中1、 2、 3、 4、 5分别代表1.3*105， 1.2*106， 1.0*107， 4.1*。
20、107， 8.2* 107cfu/mL空肠弯曲杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照的吸光度图。 具体实施方式 0013 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 0014 实施例1 一种副溶血弧菌PCR扩增产物的快速检测方法， 具体步骤如下： （1） 磁珠法提取副溶血弧菌DNA模板 A 取1mL副溶血弧菌菌液， 10000r/min离心5min， 去上清， 沉淀溶于1mL细菌裂解液 中， 振荡15s， 70水浴12min， 以5000r/min离心， 得到1mL细胞裂解清液； 其中细菌裂解 液的配方为50 L1M的Tris-HCl， 50 L15wt%的SDS溶液， 50。
21、 L20mg/ml的蛋白酶k， 20 L0.5M的pH=5.0的EDTA， 2 LRNA酶， 用双蒸水补足至1mL； B 在1mL细胞裂解清液中加入10 L磁性纳米粒子， 涡旋5s， 然后再加入600 L吸附 缓冲液混匀， 振荡反应15min， 磁性分离去上清； 其中吸附缓冲液的由80 L9wt%的聚乙二 醇20000溶液和500 L的5M的NaCl溶液混合而成； C 用1mL70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次， 室温放置30min， 使乙醇挥发完全； 再加入50 L洗脱缓冲液TE， 混匀后静置10min， 65水浴10min， 磁分离， 取上清， 即为副溶血弧菌 DNA模板溶液， -20备用。
22、； 其中洗脱缓冲液TE的配方成分为10mM的Tris-HCl， 1mMEDTA， 说明书 3/5 页 5 CN 105543368 A 5 pH8.0； 磁珠法提取的副溶血弧菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图如图3所示， 说明磁珠法 提取的DNA效果很好， 纯度高； （2） PCR扩增： 反应体系： 1 M副溶血弧菌正反向引物各2.5 L， 25mMMgCl2溶液2.5 L， 200 MdNTP2 L， 1.25UTaqDNA酶0.3 L和2.5 L副溶血弧菌DNA模版， 用双蒸水补 足至25 L； 反应条件： 95预变性4min； 5变性30s， 55退火45s， 72延伸1min25个 。
23、循 环 ； 最 后 7 2 延 伸1 0 m i n ； 其 中 副 溶 血 弧 菌 正 向 引 物的 基 因 序 列 为 5 - GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 ， 副溶血弧菌反向引物的5 端链接辣根过氧化酶互补的序列， 其 基因序列为AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAA-5 - ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3 ； （3） 比色法检测 取步骤 （2） 得到的副溶血弧菌PCR扩增产物20 L， 加入4 L50 M血晶素溶液 （Hemin） 在37反应10min， 然后加入16 LTM。
24、B显色液， 在室温下孵育5min直至溶液颜色变成蓝 色， 最后用100 L0.16M的H2SO4溶液终止， 在配制有96孔板的的酶标仪在450nm下检测其 溶液颜色的变化 （检测其吸光度） ， 其中TMB显色液的配方为8 LHEPES （羟乙基哌嗪乙硫磺 酸） 缓冲液， 4 L500mM的KCl溶液， 4 LH2O2。 0015 图4为不同浓度副溶血弧菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶电泳图， 其中1为标准品DNA， 2、 3、 4、 5分别是提取3.4*105， 3.4*106， 2.8*107， 1.1*108， 2.2*108cfu/ mL副溶血性弧菌的DNA经PCR扩增后的。
25、电泳条带， 以及阴性对照。 图5为不同浓度副溶血弧菌 DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及显色液后的吸光度图中1、 2、 3、 4、 5分别代表 3.4*105， 3.4*106， 2.8*107， 1.1*108， 2.2*108cfu/mL副溶血性弧菌的DNA经PCR扩增显色后 的吸光度图， 6代表阴性对照的吸光度图。 阴性对照选择的是非副溶血性弧菌的其他菌种， 经多次实验证明特异性和准确性较好。 0016 实施例2 一种大肠杆菌PCR扩增产物的快速检测方法， 具体步骤如下： （1） 磁珠法提取大肠杆菌DNA模板 A 取1mL大肠杆菌菌液， 10000r/min离心5min， 去上。
26、清， 沉淀溶于1mL细菌裂解液中， 振荡15s， 70水浴12min， 以5000r/min离心， 得到1mL细胞裂解清液； 其中细菌裂解液的 配方为50 L1M的Tris-HCl， 50 L15wt%的SDS溶液， 50 L20mg/ml的蛋白酶k， 20 L 0.5M的pH=5.0的EDTA， 2 LRNA酶， 用双蒸水补足至1mL； B 在1mL细胞裂解清液中加入10 L磁性纳米粒子， 涡旋5s， 然后再加入600 L吸附缓 冲液混匀， 振荡反应15min， 磁性分离去上清； 其中吸附缓冲液的由80 L9wt%的聚乙二醇 20000溶液和500 L的5M的NaCl溶液混合而成； C 用1。
27、mL70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次， 室温放置30min， 使乙醇挥发完全； 再加入50 L洗脱缓冲液TE， 混匀后静置10min， 65水浴10min， 磁分离， 取上清， 即为大肠杆菌DNA 模板溶液， -20备用； 其中洗脱缓冲液TE的配方成分为10mM的Tris-HCl， 1mMEDTA， pH8.0； 磁珠法提取的大肠杆菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图如图6所示， 说明磁珠法提 取的DNA效果很好， 纯度高； （2） PCR扩增： 反应体系： 1 M大肠杆菌正反向引物各2.5 L， 25mMMgCl2溶液2.5 L， 200 MdNTP2 L， 1.25UTaqDNA酶0.3。
28、 L和2.5 L大肠杆菌DNA模版， 用双蒸水补足 说明书 4/5 页 6 CN 105543368 A 6 至25 L； 反应条件： 95预变性4min； 5变性30s， 55退火45s， 72延伸1min25个循 环 ； 最 后 7 2 延 伸 1 0 m i n ； 其 中 大 肠 杆 菌 正 向 引 物 的 基 因 序 列 为 5 - GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3 ， 大肠杆菌反向引物的5 端链接辣根过氧化酶互补 的序列， 其基因序列为AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCC AAAA。
29、A-5 -AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3 ； （3） 比色法检测 取步骤 （2） 得到的大肠杆菌PCR扩增产物20 L， 加入4 L50 M血晶素溶液 （Hemin） 在 37反应10min， 然后加入16 LTMB显色液， 在室温下孵育5min直至溶液颜色变成蓝色， 最后用100 L0.16M的H2SO4溶液终止， 在配制有96孔板的的酶标仪在450nm下检测其溶 液颜色的变化 （检测其吸光度） ， 其中TMB显色液的配方为8 LHEPES缓冲液， 4 L500mM的 KCl溶液， 4 LH2O2。 0017 图7为不同浓度大肠杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝。
30、胶电泳图中M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 1.3*105， 1.3*106， 1.1*107， 4.3*107， 8.6*107 cfu/mL大肠杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照电泳条带； 图8不同浓度大 肠杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及显色液后的吸光度图中1、 2、 3、 4、 5分别 代表1.3*105， 1.3*106， 1.1*107， 4.3*107， 8.6*107cfu/mL大肠杆菌的DNA经PCR扩增后显色 后的吸光度图， 6代表阴性对照的吸光度图。 阴性对照选择的是非大肠杆菌的其他菌种， 经 多次实验证。
31、明特异性和准确性较好。 0018 实施例3 同上述实施例2， 其区别在于： 待测食品致病菌为空肠弯曲杆菌， 空肠弯曲杆菌正向引 物 的 5 端 链 接 辣 根 过 氧 化 酶 互 补 的 序 列 ，其 基 因 序 列 为 AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAA-5 - AG C AG G G A T A AG C C C T C T TG - 3 ； 空 肠弯曲 杆 菌反向 引物的 基因 序 列为 5 - AGCGATCTATTTGCCATCG-3 。 0019 磁珠法提取的空肠弯曲杆菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶。
32、电泳图如图9所示， 图中 M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 提取1.3*105， 1.2*106， 1.0*107， 4.1*107， 8.2*107cfu/mL空肠弯曲杆菌的DNA的电泳条带。 0020 图10为不同浓度空肠弯曲杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶电泳 图中M、 1、 2、 3、 4、 5分别代表分子量不同的DNA片段， 1.3*105， 1.2*106， 1.0*107， 4.1*107， 8.2*107cfu/mL空肠弯曲杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照电泳条带。 图 11为不同浓度空肠弯曲杆菌DNA模版经。
33、过PCR扩增反应之后加入血晶素及显色液后的吸光 度图中1、 2、 3、 4、 5分别代表1.3*105， 1.2*106， 1.0*107， 4.1*107， 8.2*107cfu/mL空肠弯曲 杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带， 6代表阴性对照的吸光度图。 阴性对照选择的是非空肠 弯曲杆菌的其他菌种， 经多次实验证明特异性和准确性较好。 0021 除上述食源性致病菌外， 食源性致病菌还可以为金黄色葡萄球菌， 志贺氏杆菌， 沙 门氏菌， 李斯特菌， 只需替换相相应的扩增引物即可。 0022 上述说明并非对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例。 本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范。
34、围内， 作出的变化、 改型、 添加或替换， 也应属于本发明的保护 范围。 说明书 5/5 页 7 CN 105543368 A 7 0001 序列表 1/3 页 8 CN 105543368 A 8 0002 序列表 2/3 页 9 CN 105543368 A 9 0003 序列表 3/3 页 10 CN 105543368 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/4 页 11 CN 105543368 A 11 图4 图5 图6 说明书附图 2/4 页 12 CN 105543368 A 12 图7 图8 图9 说明书附图 3/4 页 13 CN 105543368 A 13 图10 图11 说明书附图 4/4 页 14 CN 105543368 A 14 。