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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610062308.8 (22)申请日 2016.01.29 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 250100 山东省济南市历城区桑园路 8 号 (72)发明人 张琳 胡北侠 刘伟杰 张秀美 杨少华 黄艳艳 许传田 黄庆华 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 刘丽 (54) 发明名称 一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定 量 PCR 引物及鉴别方法 (57) 摘要 本发。
2、明涉及分子生物学和分子病毒学领域的 病毒检测技术， 特别涉及一种快速鉴别新城疫强 毒株的逆转录荧光定量 PCR 引物及使用 PCR 引物 快速鉴别新城疫强毒株的方法， 提取待鉴别毒株 RNA， 进行 RT-qPCR 扩增， 当病毒核酸成功扩增时， 则待鉴别病毒为 NDV 强毒株 ； 当病毒核酸不能扩 增时， 则待鉴别病毒不是NDV强毒株。 本发明的鉴 别方法只需要进行一次 RT-qPCR 扩增， 就能判断 待检病毒是否是 NDV 强毒株， 检测方法简便、 灵活 易操作 ； 检测出的RNA最低浓度为1拷贝/L， 检 测灵敏度高 ； 设计的引物只能扩增 NDV 强毒株， 而 对弱毒株和其他毒株都没。
3、有扩增， 特异性强。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 105525041 A 2016.04.27 CN 105525041 A 1.一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物， 其特征在于碱基序列如下： NDVFrealtime-1:5 -AGGACGGAGACARAARCGCT-3 ， NDVFrealtime-2:5 -AGTCGGAGGATGTTGGCAGC-3 。 2.一种使用权利要求1所述的逆转录荧光定量PCR引物快速鉴别新城疫强毒株的方法， 其特征在于提取待鉴别毒株。
4、RNA， 以此为模板,进行RT-qPCR扩增， 当病毒核酸成功扩增时， 则待鉴别病毒为NDV强毒株； 当病毒核酸不能扩增时， 则待鉴别病毒不是NDV强毒株。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于RT-qPCR扩增反应体系为20 L， 其中2One StepSYBRRT-PCRBuffer10 L； ExTaqHS0.4 L； Primescriptrtenzymemix 0.4 L;NDVFrealtime-1引物10 M1 L、 NDVFrealtime-2引物10 M0.4 L； Rnase FreedH2O5.2 L;待鉴别毒株RNA2 L。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征。
5、在于RT-qPCR扩增反应条件为： 42反转录5 min;95预变性3min;9410s,5310s,7220s， 进行40个循环的扩增。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于以NDVFrealtime-T7-1、 NDVFrealtime- 2为引物经RT-PCR扩增得到的目的条带作为体外转录模板， 进行体外转录,制作RNA标准 品， 选择108、 107、 106、 105、 104、 103拷贝/ L6个浓度梯度的RNA标准品作为模板进行RT- qPCR扩增， 得到各自的动力学曲线， 进而获得标准曲线， 以用于对NDV强毒株进行定量检测， NDVFrealtime-T7-1:5 -。
6、TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGGAGACARAARCGCT-3 。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于RT-PCR反应体系为： PrimeScript1step enzymemix2 L， 2*1stepbuffer25 L， NDVFrealtime-T7-1引物100pmol/ L1 L， NDV Frealtime-2引物100pmol/ L1 L， RNA模板2 L， RNasefree水补足50 L。 7.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于RT-PCR反应条件为:50反转录30min; 95预变性2min;94变性1min,53退火30s,72延伸1。
7、min,共32个循环;72 延伸10min。 8.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于检测出的RNA最低浓度为1拷贝/ L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105525041 A 2 一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物及鉴 别方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学和分子病毒学领域的病毒检测技术， 特别涉及一种快速鉴别新 城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物， 还涉及使用所述引物的鉴别方法。 背景技术 0002 新城疫 （Newcastledisease,ND） 是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)引起 的一种急性、 高度接触性禽类传染病， 。
8、是世界动物卫生组织 （OIE） 规定的法定报告疫病， 给 许多国家的养禽业造成巨大的经济损失。 NDV又称禽副黏病毒1型， 在分类上属于单链负股 病毒目、 副黏病毒科、 副黏病毒亚科的禽腮腺炎病毒属。 NDV基因组包含6个开放阅读框， 从 5 到3 依次编码L-HN-F-M-P-NP6种结构蛋白， 其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一， 病毒毒 力的强弱与其裂解位点区的氨基酸序列相关， 强毒株氨基酸序列一般为112R/K-R-Q-K/R-R- F117， 而弱毒株则改变为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117， 氨基酸序列的变化导致了NDVF0蛋白不 易被裂解， 从而降低了病毒囊膜与宿主细胞。
9、膜的融合活性， 使病毒感染性降低或者无感染 性， 这也是在基因水平上区分NDV强、 弱毒株的把点， 因此， 可以以此进行NDV强弱毒株的区 分。 0003 目前， 我国对于新城疫的防控依赖于疫苗， 有效的疫苗和合理的免疫程序很大程 度上控制了该病的爆发和流行。 但由于我国养殖环境复杂， 标准化、 规模化养殖水平不足， 致使新城疫疫情时有发生， 并常以非典型病症呈现， 所以必须经实验室诊断进行病例的确 诊和病毒的分离、 鉴定。 NDV检测主要使用PCR技术和血清学技术， 而分离鉴定则主要采用鸡 胚接种传代方法。 然而， 由于疫苗 （灭活疫苗和弱毒苗） 的广泛使用和一些天然弱毒株的存 在,从免疫鸡。
10、群中检测到的NDV可能是被接种的疫苗病毒或者是不至于引起发病的弱毒 株,所以即使检测和分离到了NDV,也不能确定鸡群感染了野毒， 发生了新城疫疫情。 所 以， 准确掌握NDV的感染情况， 首先要排除疫苗毒的干扰。 建立快速、 准确区分NDV强、 弱毒株 的方法， 可以第一时间确定是否发生了新城疫疫情， 以便有效控制危害性大的NDV强毒对鸡 群的感染。 0004 黄淑坚等 （养禽与禽病防治， 2009， 4:18-21） 设计了两对特异性引物建立了区分 NDV强、 弱毒的PCR方法 （检测敏感性为10pg， 换算成拷贝数大概为105拷贝） ； 岳华等 （中国 兽医学报， 2007,27 （3） 。
11、： 300-304） 建立了基于TaqMan探针的检测中、 强毒力新城疫病毒RNA 的荧光定量方法 （TaqMan探针造价高， 检测敏感性为60拷贝） ， 但前者在操作的简便性和灵 敏度方面有所欠缺， 后者则在检测成本和灵敏度方面有提升空间。 公开号为CN101153343A 的中国发明专利申请， 公开了一种特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR 引物及方法， 来鉴别强毒型和中毒型鸡新城疫病毒， 但灵敏度方面依然不够理想。 说明书 1/4 页 3 CN 105525041 A 3 发明内容 0005 为了解决以上鉴别强弱毒鸡新城疫病毒技术中存在的成本高、 敏感性差的问题， 本发 明。
12、提供了一种快速、 灵敏、 低成本的区分NDV强弱毒株的方法。 本发明基于NDV强、 弱毒基因 序列的分析， 通过特异性引物的设计， 建立标准曲线， 最终构建了基于SYBRGreen 嵌合荧 光的鉴别NDV强毒的逆转录荧光定量PCR(reversetranscriptionfluorescence quantitativePCR， RT-qPCR)方法。 0006 本发明是通过以下步骤得到的： 本发明所述的特异性引物的设计， 是根据GenBank中登录的所有NDVF基因序列， 筛选 与强弱毒裂解位点关联一致的序列， 然后根据强毒的序列特征设计一对特异性引物， 从而 达到只扩增强毒而不扩增弱毒的目。
13、的。 引物序列如下： NDVFrealtime-1:5 -AGGACGGAGACARAARCGCT-3 NDVFrealtime-2:5 -AGTCGGAGGATGTTGGCAGC-3 扩增产物长度为131bp。 另设计合成了含T7启动子的上游序列NDVFrealtime-T7-1: 5 -TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGGAGACARAARCGCT-3 ， 用于体外转录模板的制备。 0007 本发明所述的鉴别NDV强毒的RT-qPCR方法的建立， 首先需要进行强毒NDVRNA的 提取和体外转录模板的制备。 经TRizol法提取强毒株NDV的RNA， 以提取的RNA为模板,。
14、以 NDVFrealtime-T7-1、 NDVFrealtime-2为引物经一步法RT-PCR扩增得到的目的条带 作为体外转录模板。 优选的一步法RT-PCR反应体系为： PrimeScript1stepenzymemix2 L， 2*1stepbuffer25 L， NDVFrealtime-T7-1引物100pmol/ L1 L， NDVFrealtime- 2引物100pmol/ L1 L， RNA模板2 L， RNasefree水补足50 L。 优选的一步法RT-PCR反应条 件为:50反转录30min;95预变性2min;94变性1min,53退火30s,72 延伸1min,共32。
15、个循环;72延伸10min。 0008 其次进行RNA标准品的合成， 取1 L体外转录模板进行T7RNA聚合酶进行体外转 录,按体外转录试剂盒说明书 （T7RNAPolymerase,TaKaRa） 进行操作， 产物最终溶解于 DEPC水中,并用紫外分光光度计测其浓度。 通过公式将得到的RNA换算为拷贝数,并用 RNaseFreeWater进行10倍倍比稀释,将稀释的RNA作为标准品,-80保存。 0009 对RT-qPCR的引物浓度、 退火温度等条件经行摸索， 以得到最佳的反应条件， 反应 体系为20L， 其中2OneStepSYBRRT-PCRBuffer10L； ExTaqHS0 .4L。
16、； Primescriptrtenzymemix0.4 L;NDVFrealtime-1、 NDVFrealtime-2引物 （10 M） 各1 L； RnaseFreedH2O5.2 L;TotalRNA2 L。 反应条件确定为： 42反转录5 min;95预变性3min;9410s,5310s,7220s， 进行40个循环的扩增, 每个循环收集荧光信号。 0010 最后根据反应条件的优化， 确定反应的检测方法的标准曲线。 选择108、 107、 106、 105、 104、 103拷贝/ L6个浓度梯度的RNA标准品作为模板进行RT-qPCR扩增， 每个浓度的标 准品做3个重复， 从而得到。
17、各自的动力学曲线， 进而获得标准曲线， 并最终完成鉴别和定量 检测NDV强、 弱毒的RT-qPCR方法的建立。 0011 一种使用上述的PCR引物快速鉴别新城疫强毒株的方法， 提取待鉴别毒株RNA， 以 说明书 2/4 页 4 CN 105525041 A 4 此为模板,进行RT-qPCR扩增， 当病毒核酸成功扩增时， 则待鉴别病毒为NDV强毒株； 当病毒 核酸不能扩增时， 则待鉴别病毒不是NDV强毒株。 0012 有益效果： 本发明的鉴别方法只需要进行一次RT-qPCR扩增， 就能判断待检病毒是否是NDV强毒 株， 检测方法简便、 灵活易操作； 检测出的RNA最低浓度为1拷贝/ L， 检测灵。
18、敏度高； 设计的 引物只能扩增NDV强毒株， 而对弱毒株和其他毒株都没有扩增， 特异性强。 附图说明 0013 图1.反应条件的筛选 图2.最佳反应条件的溶解曲线 图3.RT-qPCR扩增动力学曲线 （单位： 拷贝/ L） 其中1： 1108； 2： 1107； 3： 1106； 4： 1105； 5： 1104； 6： 1103 图4.qPCR标准曲线 图5.RT-qPCR敏感性试验 （单位： 拷贝/ L） 其中： 1： 1106； 2： 1105； 3： 1104； 4： 1103； 5： 1102； 6： 1101； 7： 1100 图6特异性试验 其中： 1.NDV强毒株； 2.ARV。
19、； 3.其他病毒 （NDV弱毒株、 ARV、 IBV、 DHV、 ILTV、 TMUV） 。 具体实施方式 0014 下面结合具体实施例， 进一步阐明本发明有关内容。 下列实例中未注明的具体试 验方法， 通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件， 或按照制造厂商提供的条件。 0015 快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物， 碱基序列如下： NDVFrealtime-1:5 -AGGACGGAGACARAARCGCT-3 ， NDVFrealtime-2:5 -AGTCGGAGGATGTTGGCAGC-3 。 0016 使用逆转录荧光定量PCR引物快速鉴别新城疫强毒株的方法： 提取待鉴别。
20、毒株RNA， 以此为模板,进行RT-qPCR扩增， 当病毒核酸成功扩增时， 则待鉴 别病毒为NDV强毒株； 当病毒核酸不能扩增时， 则待鉴别病毒不是NDV强毒株。 0017 实施例1： RT-qPCR反应条件的优化 反应条件的确定主要进行引物浓度和退火温度的优化。 反应体系为20 L， 其中2One StepSYBRRT-PCRBuffer10 L； ExTaqHS0.4 L； Primescriptrtenzymemix 0.4 L;NDVFrealtime-1、 NDVFrealtime-2引物 （5-100 M） 各1 L； RnaseFreedH2O 5.2 L;TotalRNA2 L。
21、。 反应条件为： 42反转录5min;95预变性3min;9410 s,51-5710s,7220s， 进行40个循环的扩增,每个循环收集荧光信号。 其中引物浓 度取10 M、 20 M、 30 M、 40 M、 50 M5个浓度梯度， 而退火温度则选择51、 53、 54、 55 、 575个反应温度， 每个反应条件均进行3个重复。 结果根据反应的扩增曲线和溶解曲 线进行判定。 最终， 当反应引物浓度为10 M、 退火温度为53时， 扩增曲线重复性最好、 效率 最高 （图1） 且溶解曲线重复性最好 （图2） 。 0018 实施例2： 建立标准曲线 根据确定的反应最佳条件， 以108、 107。
22、、 106、 105、 104、 103拷贝/ L6个浓度梯度的RNA 说明书 3/4 页 5 CN 105525041 A 5 标准品为模板践行RT-qPCR标准曲线的建立。 每个样品的反应体系相同， 均为20 L， 其中2 OneStepSYBRRT-PCRBuffer10 L； ExTaqHS0.4 L； Primescriptrtenzymemix 0.4 L;NDVFrealtime-1、 NDVFrealtime-2引物 （10 M） 各1 L； RnaseFreedH2O 5.2 L;TotalRNA2 L。 0019 反应条件确定为： 42反转录5min;95预变性3min;9。
23、410s,53 10s,7220s， 进行40个循环的扩增,每个循环收集荧光信号， 每个样品进行3个重复， 得到各自的动力学曲线， 如图3。 然后获得标准曲线， 标准曲线的线性方程为Y=-3.307X+ 2.657， 如图4。 结果显示： 各个稀释度之间重复性良好， 建立的标准曲线合格。 0020 实施例3： 敏感性试验 分别以106、 105、 104、 103、 102、 101、 100拷贝/ L的标准品作为模板， 其他条件同实施例 2， 进行RT-qPCR扩增， 能有效扩增的最低稀释度的拷贝数检测方法的检测极限值。 结果显 示， 荧光定量PCR能检测出的模板最低浓度为100拷贝/ L(。
24、图5)， 这表明RT-qPCR的检测极限 值为1拷贝/ L。 0021 实施例4： 特异性试验 以NDV强毒株、 NDV弱毒株 （lasota、 克隆30、 V4） 和其他禽类常见病毒禽呼肠孤病毒 （ARV） 、 禽传染性支气管炎病毒 （IBV） 、 鸭病毒性肝炎病毒 （DHV） 、 鸡传染性喉气管炎病毒 （ILTV） 、 禽坦布苏病毒 （TMUV） 的核酸为模板进行RT-qPCR检测， 以确定该方法的特异性， 反 应体系和条件同实施例2。 结果显示， 仅NDV强毒株成功扩增， 而NDV弱毒株 （lasota、 克隆30、 V4） 、 ARV、 IBV、 DHV、 ILTV、 TMUV则没有扩。
25、增。 0022 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受实施例的限 制， 其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、 修饰、 组合、 替代、 简化均应为 等效替换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 105525041 A 6 序列表 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物及鉴别方法 2 1 20 DNA 人工合成 1 AGGACGGAGACARAARCGCT20 2 20 DNA 人工合成 2 AGTCGGAGGATGTTGGCAGC20 序列表 1/1 页 7 CN 105525041 A 7 图1 图2 说明书附图 1/3 页 8 CN 105525041 A 8 图3 图4 说明书附图 2/3 页 9 CN 105525041 A 9 图5 图6 说明书附图 3/3 页 10 CN 105525041 A 10 。