本发明是申请号为201510435866.X、申请日为2015年7月22日、发明名称为“一种 郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法”的专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒及检测方法。
背景技术
郁金香是国际名花之一，以高贵、典雅为世界人民所宠爱，是欧亚等地区近20个国 家的国花。近年来，我国各地相继举办了郁金香花展，获得了较好的效益。虽然郁金香在我 国很早就有少量栽培，但大部分仍从荷兰等国家进口。20世纪80年代中后期以来，我国从国 外引进郁金香商品种球数量逐年成倍增长，其携带的一些有害生物也随之传入，包括真菌、 细菌、线虫和病毒等，潜在危害性很大。郁金香碎色病是种球常见感染之一，其造成种球退 化，严重影响了郁金香的生产。
引起郁金香碎色病的病原体是郁金香碎色病毒(Tulipabreakingvirus,TuBV)， 病毒粒子大小为700nm×(12-13)nm。感染TuBV的主要症状是叶片出现浅绿色或灰白色条 斑，有时形成花叶，在红花和紫花品种上产生碎色花，花瓣上形成大小不等浅色斑点或条 斑，严重时植株生长不良，还可危害百合类花卉。
目前检测郁金香病毒多使用抗血清的ELISA法或RT-PCR法，然而这两种方法均存 在不足：ELISA法须制作抗血清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而RT-PCR灵敏 度和特异性不高。因此，有必要开发一种快速、准确的TuBV检测方法，以满足产业需求。
环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH, YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplification ofDNA.NucleicAcidsRes.2000Jun15；28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板的 热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且 无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。
逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度 是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使 RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、BstDNA聚合酶和核酸染料，其中所述 引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDNO:1)
外引物B3：CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDNO:2)
内引物FIP：CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
GTTAAATCTGGAGTGT(SEQIDNO:3)
内引物BIP：ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC
AACTGCTCG(SEQIDNO:4)。
优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和所 述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。
优选地，所述反应缓冲液由10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mMMgSO4组成。
优选地，所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/μl。
优选地，所述核酸染料为SYBRGreenI。
优选地，本发明的试剂盒进一步包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
在另一个方面中，本发明还提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其包括以 下步骤：
(1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA；
(2)设计并合成引物，其中所述引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDNO:1)
外引物B3：CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDNO:2)
内引物FIP：CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
GTTAAATCTGGAGTGT(SEQIDNO:3)
内引物BIP：ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCCAACTGCTCG(SEQIDNO:4)；
(3)在PCR管中制备25μl的RT-LAMP反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、 5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP1μl、40pmol/μl的内引物BIP1μl、反应缓 冲液2.5μl、2UAMV逆转录酶1μl、8UBstDNA聚合酶1μl、模板DNA2μl，加水补充至25μl，并 以郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作为 阴性对照；
(4)LAMP反应：将步骤(3)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(5)分析判断反应产物结果：在(4)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液 颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
优选地，所述反应缓冲液由10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mMMgSO4组成。
优选地，所述核酸染料为SYBRGreenI。
本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对病毒保守区域设计 特异性和灵敏度高的四条引物，且一步完成逆转灵和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且 通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，鉴定简便，较传统的检 测方法优势显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒的制备
1.1试剂
引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；BstDNA聚合酶和10×ThermoPol反应 缓冲液购自NEB；AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBRGreenI购自Invitrogen；其余PCR试 剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。
1.2试剂盒的制备：
反应缓冲液，按照以下配方配制：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜 碱、50mMMgSO4；
引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如 SEQIDNO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，内引物BIP，其核苷酸序 列如SEQIDNO:4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmol/μl，内引物FIP和内引物 BIP的浓度为40pmol/μl。
2U的AMV逆转录酶；
8U的BstDNA聚合酶；
核酸染料：1000×SYBRGreenI；
阳性对照：郁金香碎色病毒基因组DNA；
阴性对照：100mMTris-HCl(pH8.0)和50mMEDTA。
实施例2郁金香碎色病毒特异性检测
2.1RT-LAMP特异性检测
待测样品包括从郁金香栽培基地获得的5株郁金香碎色病毒以及甜菜花叶病毒、 洋葱黄矮病毒和烟草蚀纹病毒各1株。
使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤对郁金香碎色病毒进行检测：
(1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA；
(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其中四种引物各1μl、反应 缓冲液2.5μl、2UAMV逆转录酶1μl、8UBstDNA聚合酶1μl、步骤(1)所得模板DNA2μl，加水 补充至25μl，并以郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mMTris-HClpH8.0和 50mMEDTA作为阴性对照；
(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl1000×SYBRGreen I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
2.2检测结果
5株郁金香碎色病毒的PCR管中均呈现绿色，而甜菜花叶病毒、洋葱黄矮病毒和烟 草蚀纹病毒的显色结果均为橙色，表明引物具有很强的特异性。
实施例3郁金香碎色病毒灵敏度检测
3.1RT-LAMP灵敏度检测
按照实施例2的步骤(1)提取郁金香碎色病毒RNA，并以10倍浓度系列稀释法稀释 成100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共7个梯度。
RT-LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2的步骤(2)-(4)。
3.2检测结果
除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表 明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pgDNA，灵敏度很高。