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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510995113.4 (22)申请日 2015.12.25 C12N 15/113(2010.01) (71)申请人 华侨大学 地址 362000 福建省泉州市丰泽区城东 (72)发明人 谢晨 张光亚 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 张松亭 姜谧 (54) 发明名称 一种基于 miRNA/shRNA 转录加工机制转录 sgRNA 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于 miRNA/shRNA 转录加 工机制转录 sgRNA 的方法， 包括如下步骤 ： (1) 根 据目的选取基因，。
2、 分别设计至少二 miRNA/shRNA 的基因序列和至少一sgRNA的基因序列 ； (2)将该 至少二 miRNA/shRNA 的基因序列顺序排列， 并将 一sgRNA的基因序列连接于二miRNA/shRNA之间， 形成一多顺反子 ； (3) 将多顺反子置于 RNA 聚合 酶启动子下游， 并置于载体上导入具有 miRNA 的 动物细胞或植物细胞中以转录形成 pri-miRNA/ shRNA-sgRNA ； (4) 上 述 pri-miRNA/shRNA-sgRNA 在上述动物细胞或植物细胞中被 RNase III 加工 成 pre-miRNA/shRNA-sgRNA， 在此过程中， sgRN。
3、A 和 pre-miRNA/shRNA 分别释放出来。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 105543223 A 2016.05.04 CN 105543223 A 1.一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： (1)根据目的选取需要抑制其表达的基因以及需要进行编辑的基因， 分别设计至少二 miRNA/shRNA的基因序列和至少一sgRNA的基因序列； (2)将该至少二miRNA/shRNA的基因序列顺序排列， 并将一sgRNA的基因序。
4、列连接于二 miRNA/shRNA之间， 形成一miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子； (3)将miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子置于RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子下 游， 并置于载体上导入具有miRNA的动物细胞或植物细胞中以转录形成pri-miRNA/shRNA- sgRNA； (4)上述pri-miRNA/shRNA-sgRNA在上述具有miRNA的动物细胞或植物细胞中被RNase III加工成pre-miRNA/shRNA-sgRNA， 在此过程中， sgRNA和pre-miRNA/shRNA分别释放出来， 其中sgRNA被装配包裹入不同类。
5、型的Cas9蛋白中， 露出Cas9蛋白的多余部分被RNA外切酶降 解， 形成sgRNA-Cas9复合物， 进而识别相应的靶位点， 对所述需要进行编辑的基因进行编 辑； pre-miRNA/shRNA则被加工进入RISC复合物成为成熟的miRNA/shRNA， 以抑制所述需要 抑制器表达的基因的表达。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述sgRNA为正常的sgRNA或融合了核酸适体 的sgRNA。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述shRNA的正义链和反义链之间具有loop 区域， 该loop区域中含有UGUG模体。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述RN。
6、A聚合酶II启动子为组成型表达启动 子、 诱导表达启动子或组织特异性启动子。 5.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述RNaseIII为Drosha和Dicer。 6.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述不同类型的Cas9蛋白为正常的Cas9蛋 白、 缺口酶活性的Cas9突变体或核酸酶活性缺失同时融合转录因子或转录抑制抑制因子的 Cas9蛋白。 7.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法， 其特征在于： 编码所述Cas9蛋白的基 因与所述miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子同时进行组织特异性表达。 8.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法， 其特征在于： 。
7、所述miRNA/shRNA-based sgRNA多顺反子作为内含子置于编码Cas9蛋白的基因中表达， 以保证sgRNA的转录与Cas9蛋 白的表达在时空上的一致性。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543223 A 2 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法 技术领域 0001 本发明属于基因编辑技术领域， 具体涉及一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转 录sgRNA的方法。 背景技术 0002 基因组编辑是一种可以对生物体基因组完成精确修饰的一种技术， 利用基因组编 辑技术可以将细胞内特定的基因进行突变、 敲入和删除等， 从而改变生物体的遗传特性。 当。
8、 前的基因组编辑技术是利用某些方法在基因组特定的位置上造成DNA损伤， 从而激发细胞 内的DNA损伤修复机制。 细胞内主要修复DNA双链断裂的机制有两条： 一条是非同源末端连 接途径(Non-homologousEndJoining,NHEJ)， 在该途径中细胞对DNA断裂处进行部分酶 切， 使之暴露出粘性末端， 再将两个断裂的末端连接起来， 这个过程中往往会导致部分碱基 丢失， 因此使得该相应基因缺乏几个氨基酸或者发生移码突变而被敲除。 另一条重要的修 复途径是同源重组途径(HomologousRecombination,HR)， 若DNA损伤时的同时恰好碰到与 该损伤位点同源性很高的另一条。
9、完整的DNA时， 损伤位点会以同源的DNA为模板进行损伤修 复， 若同源基因中被认为引入了其它基因、 元件或者点突变则可能产生基因组带有相应改 变的细胞。 此外， 利用细胞具有将DNA损伤产生的粘性末端连接的功能还能直接将带有相同 粘性末端发DNA直接连接进入细胞基因组中。 0003 基因组编辑技术从一开始就展现出其强大的应用价值， 利用基因编辑技术可以产 生出有特定遗传背景的细胞、 模式动物等， 从而帮助研究人员进行功能基因的筛选和致病 基因的鉴定及相应的机理研究； 基因编辑技术亦有助于获取具有某些改良性质的动、 植物 以及微生物等， 使之符合人类的某些生产、 生活等发面的需求； 更为重要的。
10、是基因组编辑技 术还是医学上的一把利刃， 通过基因组编辑可以帮助人类治疗多种疾病， 包括遗传病和病 毒性疾病等等。 0004 基因组编辑技术从出现开始大致经历了三个重要的发展阶段。 传统的基因打靶技 术依靠细胞内本身存在的小概率同源重组事件来替换目的基因， 这种做法盲目且效率低 下， 常常在同源重组替换目的基因的同时还有大量目的基因在基因组上的随机插入产生。 锌指核酸酶(ZincFingerNuclease,ZFN)的发现使人们得以进行更加精确高效的基因组 编辑工作。 锌指核酸酶是一种人工改造的核酸内切酶， 是利用每个锌指结构域能识别3个连 续的核苷酸， 将几个识别不同核苷酸的锌指结构域串联并。
11、且融合限制性内切酶FokI的切割 结构域便形成了一个ZFN。 由于FokI需要形成二聚体才能切割因此必须是一对位置恰当的 ZFN才能行使功能， 这加大了ZFN设计的难度。 2011年之后TALEN(Transcription Activator-Like(TAL)EffectorNucleases)被用于基因组编辑， TALE结构域是由34个氨基 酸的重复单位构成， 每个重复单位中的第12和13位的氨基酸不同， 因此每个单元可以分别 识别A、 T、 C、 G这四种碱基中的一种， 与ZFN一样， TALE通过与FokI融合， TALEN可以识别并且 切割基因组上的任意位置， 由于TALEN比ZF。
12、N更易于设计因此被广泛用于编辑各种细胞和生 物体。 2013年张峰和Church等人将CRISPR/Cas9系统改造以用于基因编辑， 他们将crRNA和 说明书 1/8 页 3 CN 105543223 A 3 tracrRNA融合成一条sgRNA从而简化了CRISPR基因打靶的过程。 与ZFN和TALEN不同的是 Cas9识别基因组DNA并不是单纯依靠蛋白与DNA的相互作用， 而是由sgRNA与DNA上靶位点间 的碱基互补配对以及Cas9蛋白跟与靶位点邻近的PAM位点的相互作用这两种相互作用共同 介导， 单DNA-sgRNA-Cas9形成三元复合物的同时Cas9的核酸酶活性被激活进而切割DN。
13、A双 链。 CRISPR/Cas9不但设计上简便， 其效率也大大高于TALEN和ZFN， 因此很快受到科研人员 的青睐。 0005 近两年来， 除了将CRISPR/Cas9系统应用于基因组编辑外还有大量的研究工作致 力于改造CRISPR/Cas9系统以使其更高效、 更特异或者具有更多的功能。 例如， 将Cas9的HNH 或者RuvC结构域之一突变可以将其由核酸内切酶转变成缺口酶避免， 通过一对sgRNA分别 切割目的基因的两条链才能产生DNA断裂， 这相当于延长了靶位点的长度从而提高了靶位 点识别的特异性并可以通过改变切割出的DNA末端来影响NHEJ和HR发生的概率。 2015年张 峰等人先后。
14、报道了比目前通用的SpCas9脱靶率更低且更小的SaCas9以及能切割DNA产生粘 性末端的Cpf1。 还有人通过改造SpCas9的PAM识别位点的特异性来增加SpCas9可识别的靶 标以及增强SpCas9识别的特异性， 减少脱靶率。 此外， CRISPR/Cas9系统还可以用于基因的 过表达和敲减， 将转录因子或者转录抑制因子与无核酸酶活性的Cas9突变体构成的融合蛋 白可以在sgRNA的引导下促进或者抑制特定的靶基因的表达。 亦可以在sgRNA的3 末端再融 合一段能结合MS2蛋白的RNA核酸适体， 然后将这段融合的sgRNA、 核酸酶活性缺失的Cas9和 MS2-VP64融合蛋白共表达s。
15、gRNA与Cas9形成复合物的同时， MS2-VP64也结合到sgRNA上的核 酸适体处形成三元复合物， 三元复合物识别目的基因后VP64的转录因子活性能促进目的基 因的转录。 0006 CRISPR/Cas9技术也可以用于多基因编辑， 多基因编辑需要多个不同的sgRNA。 目 前主要有三种方法表达多sgRNA。 1、 将多个sgRNA表达载体与Cas9表达载体共转同一个细 胞。 该法除却增加实验复杂性外， 过多质粒和转染试剂的使用也将产生较大的细胞毒性， 更 为重要的是无法保证所有质粒都能转染到同一个细胞之中， 因此给后续的筛选带来了沉重 的负担。 2、 将多个sgRNA在同一个载体上用多个。
16、U6串联表达， 这种方法虽然减少了载体的数 量但确很大程度上增加了载体大小， 若载体过大则转染效率将会下降， 若载体大小超过慢 病毒、 逆转录病毒或者腺病毒等病毒载体的包装限制则无法将其包装成为病毒使用。 并且 多个高度同源的序列串联使用容易使载体不稳定， 易于重组， 尤其不利于临床应用。 3、 用串 联的crRNA介导多基因编辑， 该系统中只需要2个U6启动子分别转录串联的crRNA和 tracrRNA因此载体大小进一步缩小。 张峰等发现crRNA进行双基因敲除的效率高于sgRNA， 而另一个团队的研究发现crRNA介导的基因转录激活效率远不如sgRNA。 两个研究团队的研 究差异或许是因为。
17、crRNA在哺乳动物细胞中的加工机制还不明确所致， 可能是因为张峰等 人当时使用的crRNA恰巧易于加工， 随后的大多数的研究(包括张峰本人的研究)中都很少 用到crRNA的策略， 可见crRNA的策略在应用过程中还存在诸多不便之处使之收到摒弃。 此 外， 上述的三种策略虽然都能同时操作多个基因却只能同时对多个基因进行一种操作， 即 要么切割靶DNA， 要么对靶基因进行过表达或抑制表达。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有技术缺陷， 提供一种基于miRNA/shRNA转录加工机制 说明书 2/8 页 4 CN 105543223 A 4 转录sgRNA的方法。 0008 本发明的具体。
18、技术方案如下： 0009 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法， 包括如下步骤： 0010 (1)根据目的选取需要抑制其表达的基因以及需要进行编辑的基因， 分别设计至 少二miRNA/shRNA的基因序列和至少一sgRNA的基因序列； 0011 (2)将该至少二miRNA/shRNA的基因序列顺序排列， 并将一sgRNA的基因序列连接 于二miRNA/shRNA之间， 形成一miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子； 0012 (3)将miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子置于RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动 子， 并置于载体上导入具。
19、有miRNA的动物细胞或植物细胞中以转录形成pri-miRNA/shRNA- sgRNA； 0013 (4)上述pri-miRNA/shRNA-sgRNA在上述具有miRNA的动物细胞或植物细胞中被 RNaseIII加工成pre-miRNA/shRNA-sgRNA， 在此过程中， sgRNA和pre-miRNA/shRNA分别释 放出来， 其中sgRNA被装配包裹入不同类型的Cas9蛋白中， 露出Cas9蛋白的多余部分被RNA 外切酶降解， 形成sgRNA-Cas9复合物， 进而识别相应的靶位点， 对所述需要进行编辑的基因 进行编辑； pre-miRNA/shRNA则被加工进入RISC复合物成。
20、为成熟的miRNA/shRNA， 以抑制所 述需要抑制器表达的基因的表达。 0014 由于crRNA在哺乳动物细胞内加工机制不明且存在效率不稳定等问题， 因此本发 明利用哺乳动物细胞中的RNaseIII来加工串联表达的sgRNA， miRNA广泛存在于动植物之 中， 常常以多顺反子的形式表达， 其加工机制非常保守并且需要依赖RNaseIII， 因此本发明 将sgRNA嵌入到天然或者人工设计的miRNA多顺反子之间利用pri-miRNA加工成pre-miRNA 的时候释放出其中的sgRNA。 0015 由于miRNA和shRNA具有相似的加工机制和功能， 因此可以基于miRNA表达加工机 制来表。
21、达shRNA进行RNA干扰抑制基因表达。 将miRNA-basedsgRNA载体中的miRNA替换成特 定的shRNA则赋予了这个载体knock-down特定基因的功能。 基于此， 本发明的方法不仅可以 进行多基因的操作， 还可以对多基因进行不同的操作。 本发明的方法一方面可以knock- down一系列特定基因， 另一方面根据实验目的不同选用不同的Cas9可以对多基因进行基因 敲除、 插入、 替换或者过表达等等。 0016 本发明的方法的多基因多操作的特性可以赋予CRISPR技术更多的功能， 例如LIG4 和DNA-PK等基因都是介导NHEJ途径所必须的蛋白， 利用miRNA-basedCR。
22、ISPR进行同源重组 的同时若将其shRNA设计成靶向LIG4和DNA-PK等基因可以提高同源重组的发生概率。 又如 Nanog、 Oct4、 Sox2、 KLF4和c-MYC等过表达可以促进体细胞重编程为干细胞， 而抑制P53基因 的表达可以促进体细胞重编程， 若利用miRNA-basedCRISPR一边knock-downP53等抑制重 编程的基因， 一边过表达Nanog、 Oct4等促进重编程的基因有助于提高重编程效率。 0017 此外， 与以往的CRISPR技术不同， 本发明的方法用RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III 启动子都可以表达miRNA-basedsgRNA。 以往的sgR。
23、NA或者是crRNA都是由U6等RNA聚合酶 III启动子表达。 RNA聚合酶III启动子在各种类型的细胞中都具有较强的表达水平， 并且有 明确的转录起始位点和终止位点， 其产物没有内含子、 5 帽子和3 polyA尾巴的结构， 十分 适合小RNA的转录， 然而RNA聚合酶III启动子不具有组织特异性， 并且不能表达较长的RNA。 由于可以选择RNA聚合酶II启动子， 我们的miRNA-basedsgRNA理论上可以设计的很长， 乃 说明书 3/8 页 5 CN 105543223 A 5 至其中包含几十sgRNA和shRNA， 长达数千bp都是可以表达的。 在哺乳动物细胞中所选的RNA 聚合。
24、酶II启动子可以是CMV等组成型表达的启动子， 也可以是Tet-on和Tet-off等诱导表达 的启动子， 或者是其它组织特异性启动子。 RNA聚合酶II启动子还可以赋予miRNA-based sgRNA组织特异性表达的特性在基因条件敲除的动物模型中或者在医学研究中都尤其重 要。 例如用以往的CRISPR系统构建的神经中某个基因的条件敲除小鼠， 全身细胞中都有 sgRNA的表达， 而Cas9则置于CAMKII启动子(一种神经特异性的RNA聚合酶II启动子)下， 只 有在神经细胞中Cas9才能表达并且结合sgRNA敲除神经元中特定的基因。 然而若少量的 Cas9在生殖细胞中发生渗漏表达并敲除其中。
25、特定的基因则会导致条件敲除小鼠的子代中 出现全身性的基因敲除个体， 因此造成了条件敲除动物的不稳定， 若不加以筛选多次连续 传代后大多数小鼠将都是这种全身性敲除小鼠而非条件敲除。 而若将miRNA-basedsgRNA 也置于CAMKII启动子下则sgRNA也主要在神经细胞中表达， 则可以大大减少这种在其它组 织中非特异的敲除几率， 尤其是对减少子代出现全身性敲除具有重要意义。 同理， 若医学研 究需要在人或动物的特定的细胞中敲除某些基因， 利用miRNA-basedCRISPR技术可以大大 的避免了Cas9对其它细胞的攻击。 0018 在本发明的一个优选实施方案中， 所述sgRNA为正常的s。
26、gRNA或融合了核酸适体的 sgRNA(如融合了MS2的茎环结构等)。 0019 在本发明的一个优选实施方案中， 所述shRNA的正义链和反义链之间具有loop区 域， 该loop区域中含有UGUG模体。 0020 在本发明的一个优选实施方案中， 所述RNA聚合酶II启动子为组成型表达启动子 (CMV等)、 诱导表达启动子(Tet-on和Tet-off等)或组织特异性启动子(CAMKII等)。 0021 在本发明的一个优选实施方案中， 所述RNA聚合酶III启动子为U6、 H1等。 0022 在本发明的一个优选实施方案中， 所述RNaseIII为Drosha和Dicer。 0023 在本发明的。
27、一个优选实施方案中， 所述不同类型的Cas9蛋白为正常的Cas9蛋白、 缺口酶活性的Cas9突变体或核酸酶活性缺失同时融合转录因子(如dSpCas9-VP64等)或转 录抑制抑制因子(如dSpCas9-KRAB等)的Cas9蛋白。 0024 在本发明的一个优选实施方案中， 编码所述Cas9蛋白的基因与所述miRNA/shRNA- basedsgRNA多顺反子同时进行组织特异性表达； 0025 在本发明的一个优选实施方案中， 所述miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子作为 内含子置于编码Cas9蛋白的基因中表达， 以保证sgRNA的转录与Cas9蛋白的表达在时空上 的一致性， 这样。
28、无需两个启动子， 进一步减小了载体大小， 在调节敲除或者诱导敲除的动物 或者细胞模型中， 这样也可以保证sgRNA和Cas9在同一时空在表达。 0026 本发明的有益效果是： 0027 1、 本发明可以较为简便的对不同的基因同时进行不同的遗传操作， 所操作的基因 和操作的方式(过表达、 抑制、 敲除等等)可以人为进行设计。 0028 2、 本发明的方法操作的基因数目理论上并无太多限制。 通常至少可以同时进行包 括敲减在内的两种不同的遗传操作， 特殊的设计可以进行更多种类的遗传操作。 0029 3、 本发明的方法表达sgRNA和miRNA(或shRNA)的多顺反子， RNA较长可以用RNA聚 合。
29、酶II启动子表达， 尤为重要的是可以组织特异性或诱导表达sgRNA和miRNA(或shRNA)， 从 而比过去的基因编辑技术在组织、 细胞特异性上更佳或者具有更低的本底表达。 说明书 4/8 页 6 CN 105543223 A 6 0030 3、 本发明的方法可以在一个载体中表达多个sgRNA。 0031 4、 本发明的方法在表达多个sgRNA的同时载体大小明显缩短。 0032 5、 本发明的方法中的载体重复区域大大减少有利于提高载体的稳定性。 0033 6、 本发明的方法所构建的载体结构精简、 使用方便， 极大的扩展了CRISPR载体的 功能和应用， 是功能基因及信号通路研究、 医学研究、。
30、 基因工程研究的良好工具。 附图说明 0034 图1为本发明的miR-basedsgRNA载体构建策略图。 miRNA(或shRNA)与sgRNA交替 出现， 其中miRNA的5 和3 臂是Drosha识别并切割miRNA或者shRNA所必须的。 该载体转录后 miRNA(或shRNA)被Drosha切割释放出来成为pri-miRNA(或pri-shRNA)， 进一步被Dicer切 割后装配进入RISC复合物， 去降解靶基因mRNA从而抑制其表达。 而sgRNA则被装配包裹进入 各种类型的Cas9蛋白之中， 露出Cas9的多余部分会被体内无处不在的RNA外切酶逐渐降解， 然后sgRNA-Cas。
31、9复合物能识别基因组上的靶位点， 并且进行各种基因编辑工作。 0035 图2为本发明实施例1的TLR1.1sgRNAD1-EF1-copGFP载体图谱。 0036 图3为本发明实施例1的TLR1.1sgRNAD3-EF1-copGFP载体图谱。 0037 图4为本发明实施例1的实验结果图， miRNA-basedsgRNA可以表达并加工出有活 性的miRNA。 将sgRNA插入miR-23a/27a/24-2cluster的不同位置(分别命名为D1和D3位)。 其 中， A.将读码框错位的红色荧光蛋白报告载体、 SpCas9表达载体与构建的miRNA-based sgRNA载体共转染293T细。
32、胞， pCDH空载体和pCDH23acluster载体作为阴性对照， 发现 miRNA-based载体转染能使报告载体发生移码使得红色荧光得以表达。 B.Sensor法检测 miR-23a/27a/24-2cluster的表达。 具体实施方式 0038 以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。 0039 实施例1 0040 miR-basedsgRNA载体构建策略如图1所示， 具体如下： 0041 1.miRNA-basedsgRNA载体设计 0042 根据目的选取需要敲减的基因以及需要进行基因组编辑的基因， 分别设计shRNA 和sgRNA。 成熟的shRNA长。
33、度以20-24为宜， 其序列的设计需要根据所选定的mRNA序列， 选取 其中sense链与靶基因mRNA的序列完全一致， antisense的序列能与sense完全互补配对为 宜， 部分碱基不完全互补配对亦可以接受。 Antisense最好进行blast以确保其在全基因组 mRNA中没有与其它mRNA有过多的碱基配对， 以免有脱靶效应。 Sense与antisense之间的 loop区域可以自由设计成无配对的区域， 但在loop区域含有UGUG模体的加工效率更佳。 SgRNA的设计需要考虑靶位点上有相应的PAM位点， 我们已SpCas9为例， 将含有NGGPAM识别 位点前20个碱基作为sgR。
34、NA上的引导序列， 再这20个碱基后加上SpCas9sgRNA通用的部分构 成完整的sgRNA序列。 ShRNA与sgRNA之间的臂可以选择天然的miRNA两翼的序列， 也可以根 据文献报道改造使其兼具UG和CNNC模体， 在成熟体shRNA两侧具有11-12bp的部分互补配对 的茎基部， 基部最后3个碱基最好完全配对， 茎基部两侧必须有5个以上无结构的间隔碱基。 0043 在本实施例中， 以人miR-23a为骨架， 将sgRNA插入其中， sgRNA靶向pCVLTraffic 说明书 5/8 页 7 CN 105543223 A 7 LightReporter1.1(I-Scetarget)。
35、Ef1aBFP(Plasmid#31481,Addgene)报告载体中的I- SceI酶切位点上的5 -TTATTTGCGTAGGGATAACAGGG-3 序列， 其中最后3个GGG为PAM识别位 点， 仅出现于报告载体中， 不存在于sgRNA中。 我们构建的sgRNA的DNA序列为： 5 - T T A T T T G C G T AG G G A T A A C A T AG AG C T AG A A A T AG C A AG T T A A A A T A AG G C T AG T CCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT-3 (如SEQID01。
36、所示)。 该sgRNA若能表达则 能靶向pCVLTrafficLightReporter1.1(I-Scetarget)Ef1aBFP报告载体， 并切割载 体使载体发生移码突变进而使得红色荧光蛋白的序列进入读码框中， 使得细胞发出红色荧 光。 0044 2.miRNA-basedsgRNA载体构建 0045 设计好的miRNA-basedsgRNA可以通过重叠延伸PCR(OE-PCR)的方式合成， 或者在 已有的骨架上通过传统的分子克隆手段进行修改或插入部分shRNA或sgRNA。 本实施例中， 用引物pCDH-miR-23aclusterF： acctccatagaagattctagaTGC。
37、TGTAGCCTCCTTGTCC(SEQID 02)和pCDH-miR-23aBamHIclusterR： 0046 gatccttgcggccgcggatccTCCAAGCATCAGCCCACCC(SEQID03)从人类基因组中扩增 了miR-23a/27a/24-2簇并用XbaI和BamHI位点克隆至pCDH下以构建pCDH-miR-23acluster 载体， 由于miR-23a和miR-27a之间中间的位置存在一个XmaI酶切位点， 将1中设计好的靶向 pCVLTrafficLightReporter1.1(I-Scetarget)Ef1aBFP报告载体的sgRNA的DNA序列 合成，。
38、 通过无缝连接试剂盒插入pCDH-miR-23acluster的XmaI酶切位点处。 插入的sgRNA位 于XmaI位点之前的载体被命名为pCDH-miR-23aTLR1.1sgRNAD1-EF1-copGFP， 插入的 sgRNA序列位于XmaI位点之后的载体被命名为pCDH-miR-23aTLR1.1sgRNAD3-EF1-copGFP (如图2和图3所示)。 0047 构建好的miR-23aTLR1.1sgRNAD1和miR-23aTLR1.1sgRNAD1序列如下(如SEQ ID04所示， 大写字体为TLR1.1sgRNA序列)： 0048 tgctgtagcctccttgtcccgc。
39、atgggccctctaggtatctctgcctctccagtcctggggctggaacggagggcac agctaggctccagctccccgtgtggtggctcctgcatatgagaaaagagcttccctgtgatcaaaggaagcatctgg ggacctggaggggaggtgtccccaaatctcattacctcctttgctctctctctctttctcccctccaggtgccagcc tctggccccgcccggtgcccccctcacccctgtgccacggccggctggggttcctggggatgggatttgcttcctgt cacaaatcac。
40、attgccagggatttccaaccgaccctgagctctgccaccgaggatgctgTTATTTGCGTAGGGATAA CAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG CTcccggggacggggtggcagagaggccccgaagcctgtgcctggcctgaggagcagggcttagctgcttgtgagca gggtccacaccaagtcgtgttcacagtggctaagttccgccccccaggccctcacctcctctggccttgccgcctg。
41、t cccctgctgccgcctgtctgcctgccatcctgctgcctggcctccctgggctctgcctcccgtgcctactgagctga aacacagttggtttgtgtacactggctcagttcagcaggaacaggggtcaagcccccttggagcctgcagcccctgc cttccctgggtgggctgatgcttgga 0049 miR-23aTLR1.1sgRNAD3序列如下(如SEQID05所示， 大写字体为TLR1.1sgRNA 序列)： 0050 tgctgtagcctccttgtcccgcatgggccctctaggtatctctgcc。
42、tctccagtcctggggctggaacggagggcac 说明书 6/8 页 8 CN 105543223 A 8 agctaggctccagctccccgtgtggtggctcctgcatatgagaaaagagcttccctgtgatcaaaggaagcatctgg ggacctggaggggaggtgtccccaaatctcattacctcctttgctctctctctctttctcccctccaggtgccagcc tctggccccgcccggtgcccccctcacccctgtgccacggccggctggggttcctggggatgggatttgcttcctgt cacaa。
43、atcacattgccagggatttccaaccgaccctgagctctgccaccgaggatgctgcccgggTTATTTGCGTAG GGATAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAG TCGGTGCTgacggggtggcagagaggccccgaagcctgtgcctggcctgaggagcagggcttagctgcttgtgagca gggtccacaccaagtcgtgttcacagtggctaagttccgccccccaggccctcacctcctctggccttgcc。
44、gcctgt cccctgctgccgcctgtctgcctgccatcctgctgcctggcctccctgggctctgcctcccgtgcctactgagctga aacacagttggtttgtgtacactggctcagttcagcaggaacaggggtcaagcccccttggagcctgcagcccctgc cttccctgggtgggctgatgcttgga 0051 3.miRNA-basedsgRNA载体转染和表达检测 0052 miRNA-basedsgRNA载体可以用通用的转染方法导入细胞中表达。 本实施例用转 染试剂PEI将其与SpCas9表达载体lentiCRIS。
45、PR(Plasmid#49535,Addgene)共转293T细胞检 测其sgRNA和miR-23a/27a/24-2的表达水平。 具体操作为6孔板细胞， 每个孔转染1.5 g pCDH-miR-23aTLR1.1sgRNAD1或pCDH-miR-23aTLR1.1sgRNAD3以转染pCDH或者pCDH- 23acluster为阴性对照， 同时每孔再加入1.5 glentiCRISPR和1 gpCVLTrafficLight Reporter1.1(I-Scetarget)Ef1aBFP报告载体进行总4 g进行共转实验。 每孔加opti- medium200 l和6 lPEI转染试剂。 00。
46、53 本实施例用定量PCR检测sgRNA和miRNA的过表达效果。 成熟体sgRNA的定量PCR通 过polyA加尾法检测， 先将总RNA用末端加尾酶加polyA尾巴， 再用双碱基铆钉引物反转录， 定量PCR正向引物结合在sgRNA上， 反向引物结合在反转录引物上， 通过控制延伸时间避免 扩增出未加工的前体sgRNA。 MiRNA的定量PCR采用Stem-loop方法。 0054 sgRNA的活性检测通过红色荧光报告基因的方法， 将miRNA-basedsgRNA载体、 SpCas9表达载体和报告载体共转293T细胞， 具有sgRNA表达的细胞能发出红色荧光， 通过检 测我们发现我们设计的mi。
47、RNA-basedsgRNA载体可以使细胞发出红色荧光因此意味着该载 体可以表达有活性的sgRNA(图4A)。 MiRNA的活性检测采用sensor的方法， sensor是在荧光 素酶的3 UTR上插入和多拷贝的相应miRNA的靶位点， 若miRNA能有效表达则可以抑制相应 sensor中荧光素酶的表达， 通过双荧光素酶报告基因实验发现我们构建的miRNA-based sgRNA能有效抑制miR-23a、 miR-27a和miR-24三个miRNA对应的sensor表达(图4B)， 这也意 味着我们的载体能够产生有功能的成熟体miRNA。 0055 4.组织特异性表达miRNA-basedsg。
48、RNA 0056 将上述miRNA-basedsgRNA载体亚克隆至其它含组织特异性启动子的载体下， 即 可直接转染相应的细胞， 或者包装成病毒再行感染细胞， 亦或者显微注射。 若将miRNA- basedsgRNA表达盒置于组织特异性启动子下再插入动植物生殖细胞的基因组中， 则可构 建组织特异性敲除的个体。 0057 本领域普通技术人员可知， 本发明的技术方案在下述范围内变化时， 仍然能够得 到与上述实施例相同或相近的技术效果， 仍属于本发明的保护范围： 0058 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法， 包括如下步骤： 0059 (1)根据目的选取需要抑制其表达的基。
49、因以及需要进行编辑的基因， 分别设计至 说明书 7/8 页 9 CN 105543223 A 9 少二miRNA/shRNA的基因序列和至少一sgRNA的基因序列； 0060 (2)将该至少二miRNA/shRNA的基因序列顺序排列， 并将一sgRNA的基因序列连接 于二miRNA/shRNA之间， 形成一miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子； 0061 (3)将miRNA/shRNA-basedsgRNA多顺反子置于RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动 子下游， 并置于载体上导入具有miRNA的动物细胞或植物细胞中以转录形成pri-miRNA/ shRNA-sgRNA； 0062 (4)上述pri-miRNA/shRNA-sgRNA在上述具有miRNA的动物细胞或植物细胞中被 RNaseIII加工成pre-miRNA/shRNA-sgRNA， 在此过程中， sgRNA和pre-miRNA/shRNA分别释 放出来， 其中sgRNA被装配包裹入不同类型的Cas9蛋白中， 露出Cas9蛋白的多余部分被RNA 外切酶降解， 形成sgRNA-Cas9复合物， 进而识别相应的靶位点， 对所述需要进行编辑的基因 进行编辑； pre-miRNA/shRNA则被加工进入RISC复合物成为成熟的miRNA/shRNA。