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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510957617.7 (22)申请日 2015.12.18 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 重庆医科大学附属儿童医院 地址 400014 重庆市渝中区中山二路 136 号 (72)发明人 邹琳 刘姗 赵晓东 戴荣欣 (74)专利代理机构 北京元本知识产权代理事务 所 11308 代理人 周维锋 (54) 发明名称 一种检测 Rec-(J) 型 T 细胞受体重排 删除环含量的方法及试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及一种检测 Rec-(J) 型 T 细 胞受体重排删除环含量的方法及试剂盒。本发明 所述方法及应用本。
2、发明的试剂盒能够实现快速、 简便、 准确、 高效、 实用、 经济的检测新生儿滤纸干 血斑中 Rec-(J) 型 T 细胞受体重排删除环 的含量， 能够满足临床检验实际工作的需要， 利用 Rec-(J) 型 T 细胞受体重排删除环的含量 可早期提示罹患免疫缺陷类疾病。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 105506077 A 2016.04.20 CN 105506077 A 1.一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法， 其特征在于， 具体包括以 下步骤： 1)特异性引。
3、物和特异性探针的设计 根据被证实的 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环序列， 设计特异性扩增引物和特异 性探针； 其中， 所述探针两端带有荧光基团； 2)标准品构建 合成 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环连接点核心序列双链DNA， 并通过TA克隆连接 到PMD19-T载体上进行克隆， 测序验证序列， 并测定质粒溶液浓度， 所得到的PMD19-T- Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环质粒作为 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环核酸标准品； 将不同摩尔数的PMD19-T- Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环质粒加入高压灭菌处理的 Tris-EDTA缓冲液中保存， 得。
4、到标准品； 3)PCR扩增 将标准品按照梯度稀释后与待测标本同期进行PCR扩增反应， 分析结果以获得待测标 本的 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的含量。 2.根据权利要求1所述的一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法， 其 特征在于： 上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO： 1所示， 下游扩增引物的核苷酸序列如 SEQIDNO： 2所示。 3.根据权利要求1所述的一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法， 其 特征在于： 所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO： 3所示。 4.根据权利要求1所述的一种检测 Rec- (J) 型T细胞受。
5、体重排删除环含量的方法， 其 特征在于： 所述核心序列如SEQIDNO： 4所示。 5.根据权利要求1所述的一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法， 其 特征在于： 所述待测标本为新生儿滤纸干血斑。 6.根据权利要求1所述的一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法， 其 特征在于， 所述PCR扩增反应的条件为： 先于50温度下处理2分钟， 再在95温度下预变性 5分钟； 以95变性30秒、 58退火60秒为一个循环， 共循环40次。 7.用于检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂 盒包括 Rec- (J) 。
6、型T细胞受体重排删除环的特异性扩增引物、 特异性探针、 Rec- (J) 型 T细胞受体重排删除环核酸标准品、 PCR反应液。 8.根据权利要求7所述的用于检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒， 其特征在于： 所述特征性扩增引物如SEQIDNO： 1-2所示。 9.根据权利要求7所述的用于检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒， 其特征在于： 所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO： 3所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506077 A 2 一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法及 试剂盒 技术领域 0001 本。
7、发明属于分子生物学领域， 具体涉及适用于检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排 删除环含量的试剂盒及方法。 背景技术 0002 T细胞受体重排删除环(TREC)是一种在T细胞抗原受体(TCR)基因重排时产生的稳 定的环状DNA片段,而70以上的TREC为 Rec- (J) 型TREC。 TREC是游离基因， 稳定的存在 于细胞中， 并不随T细胞的进一步增殖而扩增。 随着T细胞分裂， TREC水平在细胞群体中逐渐 被稀释， 但它的数量代表胸腺输出初始T细胞的数量， 反应胸腺的功能。 而T淋巴细胞的减 少， 导致免疫功能低下或缺失， 产生一系列免疫低下性疾病如： 重症联合免疫缺陷(SCID)、 。
8、X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、 普通变异型免疫缺陷病(CVID)、 X-连锁高免疫球蛋白M血 症(X-HIGM)等。 其中， SCID为早期致死性免疫缺陷综合症,患儿出生后无症状期很短。 0003 SICD是一种体液免疫、 细胞免疫同时有严重缺陷的疾病， 多为基因突变所致。 最新 研究成果显示， 新生儿SCID总体发病率是1/58000。 所有SCID患儿都有T细胞生成缺陷。 因 此， 患有SCID的婴儿更易得威胁生命的重症感染。 而80以上的患儿缺乏阳性家族史， 基于 人口的筛查是在获得感染前尽早检测出SCID的唯一方式。 诊断后接受免疫重构的SCID患儿 存活率为87,接受移植、 酶。
9、替代治疗和/或基因治疗的患儿存活率为92。 因此通过TREC 对新生儿SCID筛查对提高SCID患儿的生存率及生活质量具有重大意义。 0004 目前， TREC的定量检测方法有： 实时定量PCR、 竞争性RCR及PCR-ELISA。 其中实时定 量PCR灵敏度及准确性最高。 然而， TREC在外周血中丰度低， 故目前大多数基础研究采用从 静脉血中抽提DNA， 用参考基因校正的方法进行检测。 但新生儿外周血标本难获得， 研发灵 敏度及准确性更高的可用于检测干血斑中TREC的试剂盒对新生儿SCID筛查具有重大意义。 发明内容 0005 本发明目的之一在于提供一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体。
10、重排删除环含量的方 法， 其能够简捷、 直观、 准确的对 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的含量进行检测。 0006 为实现上述目的， 本发明的技术方案为： 0007 一种检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的方法， 具体包括以下步骤： 0008 1)特异性引物和特异性探针的设计 0009 根据被证实的 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环序列， 设计特异性扩增引物和 特异性探针； 其中， 所述探针两端带有荧光基团； 0010 2)标准品构建 0011 合成 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环连接点核心序列双链DNA， 并通过TA克隆 连接到PMD19-T载体上。
11、进行克隆， 测序验证序列， 并测定质粒溶液浓度， 所得到的PMD19-T- Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环质粒作为 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环核酸标准 说明书 1/4 页 3 CN 105506077 A 3 品； 将不同摩尔数的PMD19-T- Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环质粒加入高压灭菌处理 的Tris-EDTA缓冲液中保存， 得到标准品； 0012 3)PCR扩增 0013 将标准品按照梯度稀释后与待测标本同期进行PCR扩增反应， 分析结果以获得待 测标本的 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的含量。 0014 将标准品按照梯度稀释后与待测标本同。
12、期进行PCR扩增反应是指， 将标准品按照 梯度稀释后与待测标本一起进行PCR扩增反应。 0015 进一步， 上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO： 1所示， 下游扩增引物的核苷酸 序列如SEQIDNO： 2所示。 0016 进一步， 所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO： 3所示。 0017 进一步， 所述核心序列如SEQIDNO： 4所示。 0018 详见下表： 0019 0020 上表中F表示上游引物， R表示下游引物。 0021 进一步， 所述待测标本为新生儿滤纸干血斑。 0022 进一步， 所述PCR扩增反应的条件为： 先于50温度下处理2分钟， 再在95温度下 预变性5分钟。
13、； 以95变性30秒、 58退火60秒为一个循环， 共循环40次。 0023 本发明的目的之二在于提供一种试剂盒， 能够实现快速、 简便、 准确、 高效、 实用、 经济的检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的含量， 能够满足临床检验实际工作的需 要， 利用 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的检测对新生儿SCID筛查对提高SCID患儿的 生存率及生活质量具有重大意义。 0024 为实现以上目的， 本发明的技术方案如下： 0025 用于检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒， 所述试剂盒包括 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的特异性扩增引物、 特异性探。
14、针、 Rec- (J) 型T细胞受 体重排删除环核酸标准品、 PCR反应液。 0026 进一步， 所述特征性扩增引物如SEQIDNO： 1-2所示。 0027 进一步， 所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO： 3所示。 0028 本发明的有益效果在于： 0029 本发明所述方法及应用本发明的试剂盒能够实现快速、 简便、 准确、 高效、 实用、 经 济的检测 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环的含量， 能够满足临床检验实际工作的需要， 说明书 2/4 页 4 CN 105506077 A 4 利于 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环含量检测预测疾病的发生、 发展风险。 附图说明。
15、 0030 图1为标准品倍比稀释后进行扩增反应的扩增曲线； 0031 图2为微调阈值， 使标准曲线斜率(约3.3)、 相关性(约0.99)及PCR扩增效率达最佳 时的标准曲线； 0032 图3为待测标本的扩增曲线。 具体实施方式 0033 所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明， 但并不是本发明的内容仅限 于所举实施例。 所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改 进和调整， 仍属于本发明的保护范围。 0034 实施例1PCR扩增引物和特异性探针的设计及合成 0035 利用primer5.0软件， 根据引物设计一般原则筛选较好引物三对， PCR扩增、 电泳 后根据目。
16、的条带确定最优引物。 最优引物上游扩增引物3 端后第二位碱基开始根据碱基互 补原则设计30个碱基的探针序列。 引物和探针委托成都擎科梓熙生物技术有限公司合成， 最优的PCR扩增引物与探针详见表1。 0036 表1TREC扩增引物与探针 0037 上游扩增引物CACATCCCTTTCAACCATGCT 下游扩增引物GCCAGCTGCAGGGTTTAGG 探针FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-TAMRA 0038 实施例2标准品构建 0039 委托成都擎科梓熙生物技术有限公司人工合成 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除 环的连接点核心序列双链DNA， 并通过。
17、TA克隆连接到PMD19-T载体上进行克隆， 测序验证序 列， 并测定质粒溶液浓度， 所得到的PMD19-T-T细胞受体重排删除环质粒作为 Rec- (J) 型 T细胞受体重排删除环核酸标准品； 将不同摩尔数的PMD19-T- Rec- (J) 型T细胞受体重排 删除环质粒加入高压灭菌处理的Tris-EDTA缓冲液中保存， 得到浓度为109copy/ul的标准 品。 核心序列如表2所示。 0040 表2核心序列 0041 0042 实施例3DNA提取 0043 选取200例新生儿滤纸干血斑及43例原发性免疫缺陷综合症基因检测阳性患儿滤 纸干血斑(包括12例WAS综合症WASP基因分析、 6例X。
18、连锁高IgM综合征CD40L基因突变分析、 6 例X连锁慢性肉芽肿病CYBB基因分析、 16例XLA疾病BTK基因分析及3例X连锁重症联合免疫 说明书 3/4 页 5 CN 105506077 A 5 缺陷病gamac基因分析)作为研究标本。 自动打孔仪打干血斑3个， 从干血斑中提取DNA。 0044 实施例4PCR扩增反应 0045 (1)PCR扩增反应 0046 倍比稀释标准品， 使 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环拷贝数达到106， 105， 104， 103， 102， 101， copy/ul。 与标本一起扩增。 0047 PCR扩增反应体系为： 2.5RealMasterM。
19、ix(probe)10ul， EnhancerSolution 1ul,10uM上游引物1.5ul， 10uM下游引物1.5ul， 10uM探针0.3ul， 模板DNA8ul， 1BSA 0.2ul,25mMMgCl21.5ul,其余为无核酸酶的灭菌高纯双蒸水， 终体积为25ul。 0048 PCR扩增反应条件为： (1)先在50温度下处理2分钟， 再在95温度下预变性5分 钟； (2)以95变性30秒、 58退火60秒为一个循环， 共循环40次。 0049 (2)PCR扩增反应结果分析 0050 标准品梯度稀释后进行PCR扩增反应的扩增曲线如图1所示， 微调阈值， 使标准曲 线斜率(约3.3。
20、)、 相关性(约0.99)及PCR扩增效率达最佳， 标准曲线如图2所示。 待测标本的 扩增曲线如图3所示。 0051 由图3可以看出， 200例新生儿血片筛查结果均为1000copy/孔。 50例原发性免疫 缺陷综合症基因检测阳性患儿中： 1例X连锁慢性肉芽肿病患儿1000copy/孔,3例X连锁重 症联合免疫缺陷病患儿75copy/孔， 其它患儿标本检测结果均在75-1000copy/孔。 而直径 为3.2mm的血斑中 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环75copy/孔视为筛查阳性， 故此次利 用滤纸干血斑进行 Rec- (J) 型T细胞受体重排删除环筛查检测出阳性标本3例。 0052 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说明书 4/4 页 6 CN 105506077 A 6 0001 序列表 1/2 页 7 CN 105506077 A 7 0002 序列表 2/2 页 8 CN 105506077 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 9 CN 105506077 A 9 。