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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511000030.3 (22)申请日 2015.12.28 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C07K 14/415(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 北京未名凯拓作物设计中心有限公 司 地址 100085 北京市海淀区上地西路 39 号 北大生物城北京未名凯拓公司 (72)发明人 吴洁芳 陈波 卫静 赵静 (54) 发明名称 一个基因 KT572 在提高植物耐逆性上的应用 (57) 摘要 一个基因 KT572 在提高植物耐逆性上的应 用。本发明公。
2、开了一个来源于水稻的与耐逆性相 关的基因及其应用。 实验证明， 将本发明的基因转 化水稻可显著提高水稻对干旱、 盐胁迫的耐受性。 本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的 研究， 以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良 具有重要的理论及实际意义， 将在植物 （特别是禾 谷类作物） 的耐逆基因工程改良中发挥重要作用， 应用前景广阔。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图2页 CN 105543237 A 2016.05.04 CN 105543237 A 1.一个基因， 其特征在于， 所述基因的核苷酸序列。
3、如序列表中SEQIDNO： 2所示。 2.含有权利要求1所述基因的表达载体、 表达盒。 3.权利要求1所述的基因编码的蛋白质。 4.根据权利要求3所述的蛋白质， 其特征在于， 所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO： 1所示。 5.权利要求1所述的基因及其编码的蛋白质在培育耐逆性转基因植物中的应用。 6.权利要求5所述的应用， 所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。 7.权利要求5或6所述的应用， 其特征在于： 将植物耐逆基因插入表达载体， 获得含有植 物耐逆基因的植物表达载体， 然后将该植物表达载体导入目的植物， 从表达所述植物耐逆 性的植株筛选得到耐逆性增强的植株。 8.权利要求5-7任一项所述。
4、的应用， 其特征在于： 所述植物为双子叶植物或者单子叶植 物， 优选为单子叶植物， 尤其优选为水稻。 9.权利要求8所述的应用， 其中所述表达载体的特征是： 用于构建所述植物表达载体的 出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹 轰击的载体， 或者是可在原核生物中复制的载体。 10.权利要求8所述的应用， 其特征在于： 在所述植物表达载体中加入选择性标记基因， 所述选择性标记基因包括但不限于： 可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶、 发光化 合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物、 抗化学试剂标记基因。 11.权利要求9所述的应用， 其中所述出发载体为pCAM。
5、BIA系列载体。 12.权利要求11所述的应用， 其中所述出发载体为pCAMBIA1300。 13.一种培育转基因植物的方法， 是将权利要求1所述的基因导入目的植物中， 得到耐 逆性高于所述目的植物的转基因植物。 14.根据权利要求13所述的方法， 其特征在于： 所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。 15.根据权利要求13或14所述的方法， 其特征在于： 所述目的植物为双子叶植物或者单 子叶植物， 优选为单子叶植物， 尤其优选为水稻。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543237 A 2 一个基因KT572在提高植物耐逆性上的应用 技术领域 0001 本发明涉及植物耐逆性相关的基因与其应用。
6、， 特别涉及来源于水稻的与抗逆相关 的基因KT572在提高植物耐逆性上的应用。 背景技术 0002 水稻、 玉米和小麦是我国重要的粮食作物， 三大作物的产量、 品质对于我国的粮食 生产和粮食安全都至关重要。 干旱、 盐碱、 高温和冻害等非生物逆境会直接影响粮食作物的 正常生长和产量。 利用现代农业生物技术， 如转基因技术培育具有耐逆性和广泛适应性的 农作物新品种， 可以使农作物在逆境条件下保持稳定高产。 随着转基因研究的深入， 已经陆 续分离克隆了一些与抗逆相关的基因， 包括代谢过程中的关键调控基因、 渗透调节蛋白、 小 分子物质， 还有参与调控各种逆境应答途径的转录因子等。 0003 转录因。
7、子是调控基因表达的关键基因， 对作物的生长发育起着重要的调节作用。 多年以来， 转录因子的克隆和功能研究一直是科学研究的热点之一， 科学家们利用不同的 研究路线分离鉴定了大量的转录因子， 也从中发现了一些与农艺性状相关的调控因子， 为 农作物的性状改良提供了重要基因资源。 在水稻基因组测序工作完成后， 许多数据库对水 稻基因组进行了分析。 据预测， 在籼稻和粳稻中分别包含2,025个和2,384个转录因子， 分属于63个转录因子基因家族， 如WRKY （111/113， 籼稻/粳稻） 、 bZIP （88/109） 、 AP2/EREBP （174/182） 、 AUX/IAA （30/46）。
8、 、 MYB （136/138） 、 HB （84/103） 等。 根据以往的文献报道与数据库 的功能注释， 这里既包含植物所特有的转录因子家族， 如WRKY， 也包含与植物生长发育、 抗 逆性等密切相关的其它一些转录因子家族， 如bZIP、 AP2/EREBP、 MYB等。 利用这些数据库， 结 合基因芯片杂交、 EST序列等基因表达信息， 从基因组水平预测和分离水稻转录因子全长 cDNA， 并利用已经建立的高效的水稻转化系统使其在水稻中过量表达， 对其进行规模化功 能验证， 进一步通过研究转基因水稻的表型变化及抗逆性能的改变等推断转录因子的功 能； 在大量的重复性的植物转化、 表型分析、 。
9、功能鉴定等工作的基础上， 寻找在改良农作物 中具有实用价值的植物重要调节因子， 并应用于作物的性状改良， 对有效解决农业生产中 的实际问题， 具有重要的理论意义和应用价值。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一段与水稻耐逆性相关的核苷酸序列， 生物信息学分析显示 它属于WRKY转录因子家族， 命名为KT572基因， 以用于提高植物的耐逆性能。 0005 发明所提供的与耐逆性相关的KT572基因， 来源于稻属水稻 （OryzasativaL.） ， 编码具有序列表中的SEQIDNO： 1所示氨基酸序列的蛋白质。 0006 序列表中的SEQIDNO： 1由210个氨基酸残基组成， 为蛋白KT5。
10、72。 本发明中 KT572的编码基因既可为所述基因的cDNA序列， 也可为所述基因的基因组DNA序列， 或者是 与所述基因具有90以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。 具有SEQIDNO： 1所示氨 基酸序列的编码基因， 可以具有序列表中SEQIDNO： 2的核苷酸序列。 说明书 1/6 页 3 CN 105543237 A 3 0007 含有本发明基因的表达载体、 转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。 0008 扩增KT572任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。 0009 本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。 本发明所提供的提高植 物耐逆性的方法， 是将编。
11、码本发明与耐逆性相关的KT572基因导入植物组织、 细胞或器官， 使植物耐逆性获得提高。 0010 在上述提高植物耐逆性的方法中， 本发明中水稻与耐逆性相关的KT572基因既可 为所述基因的cDNA序列， 也可为所述基因的基因组基因序列； 与所述基因具有90以上同 源性且编码相同功能蛋白的DNA序列， 是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方 法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。 本领域的技术人员应该理解的是， 特定基因序列 中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强， 而且在一些应用 （例 如， 反义或共抑制技术） 中， 部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。。
12、 基因序列变 化或缩短的方法， 以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知 的。 0011 本发明水稻与耐逆性相关KT572基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物 组织、 细胞或器官； 用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆 菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等， 如pBin系列载体 （如pBin19等） 、 pBI系列载体 （如pBI101等） 、 GatewayTW系列载体 （如pH2GW7等） 、 pCAMBIA系 列载体 （如pCAMBIA3301等） 、 per8、 pX6或其它衍生植物表达载体， 所述出发载体还可。
13、为可 在原核生物中复制的载体， 如pENTER-TOPO、 pUC系列载体或pBluescript系列载体等。 0012 使用本发明中水稻与耐逆性相关的KT572基因或其同源序列构建植物表达载体 时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、 组成型、 组织特异型或诱导型 （ABA、 干 旱、 盐碱或化学诱导等） 启动子。 所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒 （CAMV） 35S启 动子， 玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等； 所述组织特异性表达启动子可为根特 异性表达启动子、 叶片特异性表达启动子、 维管特异性表达启动子、 种子特异性表达启动 子、 花特异性表达启动。
14、子或花粉特异性表达启动子， 如2S1启动子 （GenBank号： NM_ 118848.2， GI:30687489） 和NapinA （GenBank号： M64633.1， GI:349405） 启动子等； 所述诱导 型启动子可为受低温、 干旱、 ABA、 乙烯、 盐碱或化学等诱导的启动子。 上述启动子可单独使 用或与其它的植物启动子结合使用。 此外， 使用本发明的基因构建植物表达载体时， 还可使 用增强子， 包括翻译增强子和/或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻 接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整个序列的正确翻译。 所述 翻译控制信号和起始。
15、密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合成的。 翻译起始区 域可以来自转录起始区域或结构基因。 0013 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行 加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 （GUS基因、 GFP基因、 萤光素酶基因等） 、 具有抗性的抗生素标记物 （新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、 潮 霉素磷酸转移酶 （Hygromycinphosphotransferase） 基因、 庆大霉素标记物或卡那霉素标 记物等） 或是抗化学试剂标记基因 （如抗除莠剂基因） 等。 所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII) 基因的。
16、宿主植物细胞、 组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选， 含潮 霉素磷酸转移酶 （Hygromycinphosphotransferase） 基因的宿主植物细胞、 组织或器官可 说明书 2/6 页 4 CN 105543237 A 4 由潮霉素进行筛选。 从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境 筛选转化植株。 经上述方法进行筛选后还可采用Southern、 PCR或点杂交等分子检测手段对 转基因植株进行检测， 以确定其是否转化有目的基因。 0014 其中， 本发明以pCAMBIA1300为出发载体， 构建的含有本发明水稻与耐逆性相关的 KT572基。
17、因的植物表达载体命名为pCactF-KT572。 携带有本发明水稻与耐逆性相关的KT572 基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、 PEG)、 Ti质粒、 Ri质粒、 植物病毒载体、 直接DNA转化、 花粉管导入、 微注射、 电激、 基因枪、 农杆菌介导等常 规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、 组织或器官， 并将转化的植 物细胞、 组织或器官培育成植株； 所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、 愈伤组织、 茎尖、 叶片和种子等。 0015 此外， 通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的KT572基因或其同源序列的转基 因植株进行继代培养后， 可。
18、从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。 此外， 还可对该转基 因植株进行扩繁， 可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。 所述转基因植物的扩繁包 括无性繁殖和/或种子繁殖。 0016 本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用， 因此， 所述被转化的植物细胞、 组织或器官既可来源于烟草、 油菜、 棉花、 大豆、 杨树、 桉树、 马铃薯或牧草等双子叶植物， 也 可来源于水稻、 玉米、 小麦、 大麦、 高梁、 谷子或草坪草等单子叶植物。 0017 本发明提供了一个与耐逆性相关的基因KT572。 实验证明， 将本发明的基因转化水 稻可提高水稻对干旱、 盐胁迫的耐受性。 本发明的蛋白及其编码基因对于植。
19、物耐逆机制的 研究， 以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义， 将在植物 （特 别是禾谷类作物） 的耐逆基因工程改良中发挥重要作用， 应用前景广阔。 0018 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 附图说明 0019 图1为表达载体pCactF的T-DNA区图谱。 LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界； hyg表示潮霉素抗性； p35S表示CaMV35S基因的启动子； T35S表示CaMV35S基因的终止子； pAct1表示Actin基因的启动子； 3flag表示3倍的flag标签序列； OCS表示OCS基因的终止子； HindIII、 KpnI、 SpeI。
20、、 XbaI、 SalI和PstI分别表示限制性内切酶的酶切位点。 0020 图2为KT572转基因株系的耐旱性分析： A： 干旱处理前苗生长状态； B： 干旱处理后 苗生长状态； C： 正常培养一周后苗生长状态； D： 干旱处理后的存活率统计。 0021 图3为KT572转基因株系的盐筛分析： A： 盐筛处理前苗生长状态； B： 盐筛处理后苗 生长状态； C： 正常培养一周后苗生长状态； D： 盐筛处理后的存活率统计。 具体实施方式 0022 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法， 所用引物均由上海英骏生物 技术公司合成， 测序由北京华大基因完成， PCR试剂盒、 载体构建过程中的核。
21、酸内切酶购自 宝生物工程有限公司， pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司， T4DNA连接酶 购自Promega公司， 方法均参照试剂盒提供的方法进行。 实验中所用的载体pCactF由本实验 改造所得， 基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1300。 说明书 3/6 页 5 CN 105543237 A 5 0023 1、 KT572基因的分离 从KT572基因的编码起始位点ATG开始设计5 端引物， 于终止密码子处设计3 端引物： 引物1： 5 tctagaATGTCTCCTGTGCCGAGTCC3 引物2： 5 gtcgacTTACAAAAAATGGAAGAATC。
22、3 引物1中tctaga序列为限制性内切酶XbaI的酶切位点， 下划线标识的序列为KT572基因 的编码序列； 引物2中gtcgac序列为限制性内切酶SalI的酶切位点， 下划线标识的序列为 KT572基因的编码序列。 引物1的序列如SEQIDNo： 3所示， 引物2的序列如SEQIDNo： 4所 示。 0024 提取幼苗期的日本晴水稻的总RNA， 通过反转录得到cDNA作为模板， 用以上引物扩 增KT572基因的全长， 其大小为633bp， 其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO： 2所示， 所编码 的蛋白质氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO： 1所示。 0025 具体反应为： 取约2 g的。
23、总RNA， 加入1 l10DNasebuffer， 1 l的DNase， 补DEPC 处理过的水至10 l体系， 混匀， 37温育30min后， 加入1 l的RQDNasestopsolution,65 温育10min以终止反应后， 加入2 lOligo(dT)18primer(0.1 g/ l)， 4 l5First- strandbuffer， 1 lRibonucleaseinhibitor(40U/ l)， 2 l4dNTP(各10mM)， 1 l MMLVReverseTranscriptase(200U/ l)， 小心混匀， 37保温1小时。 然后90处理5分 钟， 冰上冷却， 离。
24、心收集即获得相应的反转录产物cDNA。 将得到的cDNA稀释10倍， 取1 l作为 PCR反应的模板， 上、 下游引物(10 M)各1 l， LATaq酶(5U/ l)0.5 l， 4dNTPs(各10mM)1 l， 2GCbuffer(Mg2+)25 l， H2O20.5 l。 PCR反应条件为预热955min， 变性94 1min， 退火5630sec， 延伸721min50sec， 34个循环。 反应结束后， 对PCR扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳检测， 获得了大小分别与预期结果相符的DNA片段。 分别回收并纯化上 述片段， 将其连接入载体pEASY-T1(全式金公司)中， 通过热激法转。
25、化大肠杆菌 （E.coli） TOP10菌株， 挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中， 37、 200rpm 的摇床中培养12-16小时， 提取质粒， 分别得到含有目的片段的重组质粒， 测序验证正确后， 用XbaI和SalI双酶切切下目的片段KT572,连入进行相同双酶切的pCactF植物表达载体， 构建得到载体pCactF-KT572。 挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落进行测序验证。 植物表达载体 pCactF的T-DNA区图谱如图1所示。 0026 2 农杆菌转化 用农杆菌介导法将按具体实施方式1获得的与耐逆性相关的基因KT572转化水稻， 具体 方法如下： 1）。
26、 转化农杆菌 利用热激法将上述重组载体pCactF-KT572转入农杆菌AGL0菌株 （中国科学院遗传与 发育生物学研究所赠送） ， 利用农杆菌对水稻进行共转化。 0027 2） 侵染水稻愈伤组织 挑取步骤1） 获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L 的20mLYEB液体培养基中， 在28、 150rpm下振荡培养2-3天， 再于4、 5000rpm离心3分钟， 去上清， 将菌体沉淀重悬于含0 .1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基(Co(N03)26H2O 0.15mg/L， CaCl2110mg/L,MgSO4122mg/L,KI3.75mg/L， Na。
27、H2PO4H2O150mg/L， Na2- EDTA0.01mM， FeSO47H2O139mg/L， KCl2.95g/L， MnSO44H2O84.5mg/L， ZnSO47H2O 说明书 4/6 页 6 CN 105543237 A 6 6.25mg/L， H3BO35mg/L， Gly37.5mg/L， CuSO40.005mg/L， Na2MoO42H2O1.25mg/L， 盐 酸硫胺素VB15mg/L， 烟酸5mg/L， 盐酸吡哆醇VB65mg/L， 肌酸0.1g/L， 酪蛋白水解物 0.3g/L， L-Gln87.6mg/L， L-Asp26.6mg/L， 蔗糖20g/L)中， 。
28、在28下避光振荡培养1-2小时 至OD600=0.6-0.9。 挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、 颗粒 状愈伤组织浸入上述转化有pCactF-KT572的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后， 静置30分 钟， 取出， 用无菌滤纸吸干多余菌液， 将愈伤组织接种于N6共培养基 （N6培养基+10g/L葡萄 糖+1mg/L乙酰丁香酮+2,4-二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 2mg/L） 上培养， 其中N6基本培养基的配方 为(NH4)2SO40.46g/L， KNO32.83g/L， CaCl20.2g/L， MgSO40.092g/L， KH2PO40.4g/L， Na2-。
29、EDTA0.15g/L， FeSO47H2O0.11g/L， MnSO44H2O0.44g/L， ZnSO47H2O0.17g/ L， H3BO30.14g/L， CoCl26H2O0.0005g/L， CuSO45H2O0.0005g/L， Na2MoO42H2O 0.005g/L， 盐酸硫胺素VB10.01g/L， 烟酸0.001g/L， 盐酸吡哆醇VB60.001g/L， 肌酸 0.1g/L， 酪蛋白水解物0.3g/L， L-Pro0.5g/L， 蔗糖30g/L， 琼脂10g/L， pH5.8。 2-3天后， 将 愈伤组织放入广口瓶中， 用无菌水冲洗3-5次， 每次摇动数次， 然后在含5。
30、00mg/L头孢霉素的 无菌水中浸泡30-60分钟， 最后再用无菌水冲洗1遍， 置于无菌滤纸上晾干， 最后转入筛选培 养基 （N6基本培养基+2,4-D2mg/L+头孢霉素250mg/L） 筛选。 0028 3） 阳性转基因水稻的获得 将侵染后的水稻愈伤组织于N6共培养基中共培养3-5天后， 转至含50mg/L潮霉素和 400mg/L头孢霉素的N6固体培养基 （N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+300mg/L水解酪 蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂， pH5.8） 上筛选3周， 再转入含50mg/L潮霉素 和200mg/L头孢霉素的N6固体培养基上筛选4周，。
31、 随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基 （N6培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸） ， 光照培养3周， 再转入分 化培养基 （N6培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L6-苄基氨基嘌呤） 上进行分化， 将生长出的再生 植株在壮苗培养基(1/2MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上进行生根培养后 移至温室中， 在28、 15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片， 按常规方法提取总DNA， 在正向引物5 -ACTCACCGCGACGTCTGT-3 和反向引物5 -TTCCTTTGCCCTCGGACG-3 的引 导下， PCR扩增潮霉素磷酸转移。
32、酶基因， 经扩增获得1009bpDNA片段的为阳性转基因植株， 检测结果表明用上述方法获得了转化有pCactF-KT572的转基因水稻。 0029 3、 KT572转基因植株的耐旱性分析 收获KT572的T1代转基因水稻种子， 选取5个以上的株系进行干旱筛选。 用水浸种培养3 天使其萌发， 然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选， 同时以转空载体的水稻中花11作对照， 筛 选5天后， 对照植株全部死亡， 统计转基因植株抗性苗与死亡苗数， 分析转基因植株的抗性 分离比， 选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为31的株系， 待苗长到8cm左右时， 将小苗从培 养皿中转移到三角瓶中， 每瓶10株， 三个重复。
33、。 培养至三叶期 （第3片叶完全舒展） ， 其生长状 态如图2A。 改用含有20%PEG的Hoagland溶液进行旱筛， 约3天， 对照出现叶尖发黄泛白， 叶 片下垂或半卷甚至全卷时 （图2B） ， 洗去PEG溶液， 正常培养。 期间每1.5天更换一次PEG溶液。 三角瓶中的营养液两天更换一次， 以保持营养液的新鲜状态。 一周后照相 （图2C） ， 统计成活 苗数， 计算耐旱苗比例， 结果如图2D （横坐标为不同的转基因株系编号， 纵坐标为耐旱苗百 分比） 。 旱筛后恢复培养一周后如图2C所示， 转空载体对照株系大部分都已发黄、 卷曲、 死 亡， 而转基因植株表现出很强的干旱耐受力和恢复能力，。
34、 大部分能够继续生长， 恢复一周后 说明书 5/6 页 7 CN 105543237 A 7 的存活率统计如图2D所示， 转基因株系的存活率均高于对照株系。 由苗的生长状态和数据 统计可以得知KT572转基因植株具有耐旱性。 在获得KT572转基因水稻T2代的种子后， 我们 再一次进行了耐旱性实验， 结果与上述实验结果相一致。 0030 此实验说明KT572基因具有增强水稻耐旱性的作用 4、 KT572转基因植株的耐盐性分析 收获KT572T1代转基因水稻种子， 选取5个以上的株系进行盐胁迫筛选。 用水浸种培养 3天使其萌发， 然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选， 同时以转空载体的水稻中花1。
35、1作对照， 筛选5天后， 对照植株全部死亡， 统计转基因植株抗性苗与死亡苗数， 分析转基因植株的抗 性分离比， 选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为31的株系， 待苗长到8cm左右时， 将小苗从 培养皿中转移到三角瓶中， 每瓶10株， 三个重复。 培养至三叶期 （第3片叶完全舒展） ， 其生长 状态如图3A。 改用含有200mMNaCl的Hoagland溶液进行盐筛， 约3天左右， 对照出现叶尖发 黄泛白， 叶片下垂或半卷甚至全卷时 （图3B） ， 洗去盐溶液， 正常培养。 期间每1.5天更换一次 盐溶液。 复水第二天再更换一次营养液， 以去除剩余的盐分。 三角瓶中的营养液2天更换一 次， 以保持。
36、营养液的新鲜状态。 一周后照相 （图3C） ， 统计成活苗数， 计算耐盐苗比例， 结果如 图3D （横坐标为不同的转基因株系编号， 纵坐标为耐盐苗百分比） 。 实验结果显示， T1代转基 因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株， 经盐处理后， KT572转基因水稻T1 代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长， 转空载体的中花11对照 （CK） 植株的叶片发 黄、 卷曲、 干枯， 茎杆不能直立， 恢复培养后很快死亡 （图3C） 。 在获得KT572转基因水稻T2代 的种子后， 我们再一次进行了耐盐性实验， 结果与上述实验结果相一致。 0031 此实验说明KT572基因具有增强水稻耐盐性。
37、的作用。 说明书 6/6 页 8 CN 105543237 A 8 SEQUENCELISTING 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 一个基因KT572在提高植物耐逆性上的应用 4 PatentInversion3.3 1 210 PRT 水稻 （OryzasativaL.ssp.japonica） 1 MetSerProValProSerProHisGlnSerHisHisLeuGlyHisGly 151015 SerArgLysGluLysArgMetArgLysValAspThrPheAlaProHis 202530 AsnAspGlyHisGlnTrpArgLysTyrGlyGluLy。
38、sLysIleAsnAsn 354045 CysAsnPheProArgTyrTyrTyrArgCysThrTyrLysAspAsnMet 505560 AsnCysProAlaThrLysGlnIleGlnGlnLysAspTyrSerAspPro 65707580 序列表 1/4 页 9 CN 105543237 A 9 ProLeuTyrSerValThrTyrTyrAsnGluHisThrCysAsnSerAla 859095 PheLeuProLeuSerProSerGluPheGlnLeuGlnThrAlaSerGly 100105110 LysAlaValSerIleCysPhe。
39、GluSerSerGlyAlaGlnGluProMet 115120125 ThrAsnAlaSerSerProSerSerSerAlaAlaArgArgSerThrPro 130135140 SerGluAsnLysAsnGlnProLeuProArgHisSerGluAlaTyrSer 145150155160 TrpGlyValGlyValValGluGlnLysProSerCysThrGluLeuGln 165170175 SerCysSerThrGluCysGlnAspAlaPheSerAlaGlyThrIlePro 180185190 GluGluThrValAspAlaGlyAr。
40、gPheGlySerIleArgPhePheHis 195200205 PheLeu 210 2 633 DNA 序列表 2/4 页 10 CN 105543237 A 10 水稻 （OryzasativaL.ssp.japonica） 2 atgtctcctgtgccgagtccgcatcaatcacaccatctaggccatggctcaaggaaagag60 aagcgcatgaggaaggtggatacctttgcgccgcacaacgacggccaccagtggaggaag120 tacggcgagaagaagataaacaactgtaatttccccagatactactacagat。
41、gcacctat180 aaagataacatgaattgcccagcaacgaagcagattcagcagaaagattatagtgatcca240 ccattgtactcagtcacctactacaatgagcatacatgtaatagtgcttttcttcctctt300 agcccctcagagttccagctgcagactgcatctgggaaggcagtctccatctgctttgaa360 tcatctggggctcaagaaccaatgaccaatgccagctcaccttcttcaagcgcagcacgg420 cgtagcacaccttcagagaacaagaatcagcc。
42、tcttccacggcattcggaagcctattct480 tggggggttggtgttgtagaacaaaagccgtcctgcactgagctccaatcttgcagcacc540 gaatgtcaggatgcattttcagctggtacgattcctgaagagacagtagatgcaggaaga600 tttggttctatcagattcttccattttttgtaa633 3 26 DNA 人工序列 3 tctagaatgtctcctgtgccgagtcc26 4 26 DNA 人工序列 序列表 3/4 页 11 CN 105543237 A 11 4 gtcgacttacaaaaaatggaagaatc26 序列表 4/4 页 12 CN 105543237 A 12 图1 图2 说明书附图 1/2 页 13 CN 105543237 A 13 图3 说明书附图 2/2 页 14 CN 105543237 A 14 。