用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及其使用方法.pdf

本发明公开了用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及使用方法，涉及基因突变的检测。本发明的方法包括(1)提供引物和探针；(2)待测样品处理和模板提取；(3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；(4)用步骤(1)的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；(5)利用双环探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX或ROX荧光强度作为结果的判断标准。本发明的引物、探针及方法：可同时检测EGFR基因的29缺失突变；灵敏度高；特异性强；选择性能力强；检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。

1、  用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，包括下列4组引物和探针中的至少一组：
(1)、5′-GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC-3′SEQ ID NO：1
5′-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA-3′SEQ ID NO：2
5′-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT-3′SEQ ID NO：3
5′-TCTGGGCTCCCCACCAGAC-3′SEQ ID NO：4
FAM-5′-CGTGCCGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGACACCGT-3′-TAMRA SEQ ID NO：21
(2)、5′-GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3′SEQ ID NO：5
5′-GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAATATC-3′SEQ ID NO：6
5′-TCCCGTCGCTATCAAGGATC-3′SEQ ID NO：7
5′-CCCGTCGCTATCAAGGAGC-3′SEQ ID NO：8
5′-TCCCGTCGCTATCAAGGAAC-3′SEQ ID NO：9
5′-TTCCCGTCGCTATCAAGGAATCTT-3′SEQ ID NO：10
5′-CGGCTGCCAGACATGAGAAAAG-3′SEQ ID NO：11
FAM-5′TTCTGCTAAAGCAGAAACTCACATCGAGATGTGA-3′-TAMRA SEQ ID NO：22
(3)、5′-GAAGCCTACGTGATGGCCAT-3′SEQ ID NO：12
5′-GTGGACAACCCCCACCAC-3′SEQ ID NO：13
5′-CGTGGACAACCCCCACCA-3′SEQ ID NO：14
5′-ATG GCCAGCGTGGACGGT-3′SEQ ID NO：15
5′-TGATGGCCAGCGTGTC-3′SEQ ID NO：16
5′-GAGCAGGTACTGGGAGCC-3′SEQ ID NO：17
FAM-5′AGCCGACCTTCGGCTGCCTCCTGGAAGGAGG-3′-TAMRA SEQ ID NO：23
(4)、5′TGTCAAGATCACAGATTTTGGGGG-3′SEQ ID NO：18
5′CAGATTTTGGGCTGGCCAAAAA-3′SEQ ID NO：19
5′-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3′SEQ ID NO：20
FAM-5′-AAGTAAGCCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCAAGGAGGC-3′-TAMRA SEQ ID NO：24

2、  一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提供权利要求1所述的4组引物和探针中的至少一组；
(2)待测样品处理和模板提取；
(3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；
(4)用步骤(1)的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；
(5)利用双环探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX或ROX荧光强度，以HEX(或ROX)信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或35：阴性；Ct小于32：阳性。

3、  如权利要求2所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其特征在于：步骤(2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液。

4、  如权利要求2所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其中荧光PCR的反应体系为：
1×PCR缓冲液
MgCl₂       5.0～10.0mmol
dNTP各      0.8～1.5mmol
各对引物    0.1～1.0μmol
各条探针    0.5～1.0μmol
Taq酶       2.0～3.0U
模板        4.0～6.0μl
总体积     40～60μl

5、  一种试剂盒，至少包括：
权利要求1所述的4组引物和探针中的至少一组；
及PCR反应缓冲液。

用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及其使用方法
技术领域
本发明涉及基因突变检测，特别涉及检测人类表皮生长因子受体EGFR基因29种缺失突变的引物、探针及方法。
背景技术
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞，对细胞的生长、分化的调节有重要作用。EGFR可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前，临床上EGFR靶向治疗主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体两个部分，如阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)，罗氏公司的恶罗替尼(特罗凯)。
近年来大量研究发现一些肺癌病人EGFR基因的编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与吉非替尼和恶罗替尼等药物的临床疗效有关，即与药物反应性有关，原因可能是因为这些突变改变了EGFR胞内ATP结合区的结构，提高了EGFR对吉非替尼的结合能力。目前，虽然已经发现不下30种突变，不过主要是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变；外显子19上747-750位氨基酸的大约有20多种不同缺失约占突变的45％，其中以2235_2249del15和2236_2250del15最为常见；外显子21上858位氨基酸的替代约占突变的40-45％；外显子18点突变(G719S或G719C)约占突变的5％；外显子20上的插入突变约占突变的1％左右。外显子18的G719X突变约占突变的5％左右。但是，在肺癌患者中EGFR的突变率并不高，美国肺癌病人中EGFR基因的突变率仅有2％，日本为40％。中国女性非小细胞肺癌的病人中EGFR基因的突变率为30％，如果这部分患者均能应用吉非替尼或恶罗替尼治疗将会明显改善预后。
这些靶向药物虽然对某些人群疗效非常，但是价格昂贵，如果病人不携带有EGFR突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变成为人们亟待解决的问题。
建立对肿瘤病人EGFR基因突变检测方法不同于检测一般性的遗传突变，一般的遗传性突变即便是杂合性突变(异质性)和野生比例永远是1/1，靠一般的探针技术就可以对突变和野生进行很好的区分。然而，这些EGFR突变都是体细胞突变，提取模板中存在大量野生型DNA，突变所占比例不确定，直接来自手术切除的样品，突变比例高，可能达到20％以上，或许突变含量只有0.1％。虽然可以通过显微激光捕获样品中的肿瘤细胞，提高样品中肿瘤细胞的比率。不过即便是肿瘤细胞，也不是100％的肿瘤细胞都带有此类突变，处于不同肿瘤组织部位的细胞或许不太一样。如果是来自血液的样品突变含量或许会更低。这就是稀有突变检测的难点：一面要具有高灵敏的检测能力——个位数甚至单个突变拷贝，另外必须保证极高的特异性——面对上千倍上万倍的野生型模板的干扰，不出现假阳性。
目前检测EGFR基因稀有突变的方法有多种，检测能力在1％～20％。主要有两大类，一类是非实时PCR，主要有测序和DHPLC，检测能力仅为20％和5％，而且需要PCR后处理，步骤繁琐，耗时长，容易污染；另一类是实时PCR，虽然都是基于实时PCR的技术平台，但是为了提高检测方法的选择能力，不同学者所用策略不尽相同。主要有完全依赖DNA序列自身识别特异性和依赖酶识别特异性两大类策略，有TaqMan探针、高分辨熔解曲线分析、竞争性抑制实时PCR方法，检测能力5％～20％之间，DxS蝎子引物法检测能力可达1％。
近年来，研究发现在病人的外周血液中能够检测到癌细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤早期诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血血清中检测到EGFR突变。认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道靶向药物靶标位点的分子学特征，从而判断哪个药物对病人最有效。但是，外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般小于0.2％，即便是手术切除的肺癌组织中也混杂了大量的正常细胞，而且并不是所有的肿瘤细胞都带有突变。上述方法不能满足越来越多的无创的突变检测需要，因此能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。
发明内容
为了克服现有技术检测能力有限，现提供一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的荧光PCR方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是，一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的荧光PCR方法，其包括以下步骤：
(1)根据人类表皮生长因子受体(EGFR)基因18、19、20、21外显子的野生型基因序列和和相应突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和多个特异性双环探针。
(2)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系。
(3)用步骤(1)的各种特异性简并引物和特异性双环探针同时扩增待测的29种缺失突变基因序列。
(4)利用双环探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX或ROX荧光强度，以HEX(或ROX)信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或35：阴性；Ct小于32：阳性。荧光PCR的反应体系为：
1×PCR缓冲液
MgCl₂        5.0～10.0mmol
dNTP各       0.8～1.5mmol
各对引物     0.1~1.0μmol
各条探针     0.5~1.0μmol
Taq酶        2.0～3.0U
模板         4.0～6.0μl
总体积       40～60μl
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
所述的缺失突变为肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因29种常见突变，具体相见表1：
表1：肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因的29种突变


29种突变分8个PCR反应检测，各管检测的突变见表2。

所述特异性引物和特异性探针相见表3。
表3特异性引物和特异性探针

所述一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的荧光PCR方法不包括对待测样品处理和模板提取步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
本发明的有益效果是：本发明在特异性引物和双环探针技术的基础上，建立了多重实时PCR同时检测29种人类表皮生长因子受体(EGFR)基因突变，此方法：(1)可在一个PCR管里同时检测EGFR基因的19缺失突变；(2)灵敏度高，5-10拷贝的突变即可检出；(3)特异性强，10ng野生型基因组DNA不会有非特异信号；(4)选择性能力强，可以在10ng野生型基因组DNA背景下检出0.1％~1％的缺失突变DNA；(5)检测速度快，整个检测过程需要90分钟。
附图说明
图1至图2为本发明单管荧光PCR检测19种EGFR基因缺失突变的检测曲线图。
图1为本发明单管荧光PCR检测不含19种EGFR基因缺失突变的阴性对照样品检测曲线图；
图2为本发明单管荧光PCR检测含19种EGFR基因缺失突变的其中一种或多种的样品检测曲线图；
具体实施方式
本发明以人类EGFR基因19外显子的19种缺失突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及联合使用双环探针，从而实现快速准确、简单地同时检测19种缺失突变，而且检测突变的能力高达0.1％~0.1％。
野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以细胞系H1650为19-M1(2235_2249del15)模板，其他18种缺失突变以经过基因工程构建的突变质粒作为突变模板，建立单管荧光PCR检测EGFR基因19种缺失突变的反应体系，并将此体系用于EGFR缺失突变的快速检测。此方法主要包括以下步骤：
(1)根据Cosmic数据公布的人类表皮生长因子受体(EGFR)基因19外显子的野生型基因序列和19种缺失突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和多个特异性双环探针。
(2)待测样品处理和模板提取。
(3)荧光PCR扩增。
(4)检测荧光信号，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准。
步骤(1)中根据Cosmic数据公布的人类表皮生长因子受体(EGFR)基因19外显子的野生型基因序列和19种缺失突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和多个特异性双环探针，详见表3。
步骤(2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到2ng/μl作为PCR扩增的模板。
步骤(3)的荧光PCR扩增反应体系为：
1×PCR缓冲液
MgCl₂       7.0mmol
dNTP各      1.0mmol
各对引物    0.1~1.0μmol
各条探针    0.5~1.0μmol
Taq酶       2.5U
模板        5μl
总体积      40μl
以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl₂，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
步骤(4)检测FAM和HEX荧光信号的Ct值，是采用Mx3000P荧光PCR扩增仪或Mx3005P荧光PCR扩增仪或Rotor-Gene3000荧光PCR扩增仪或Rotor-Gene6000荧光PCR扩增仪或ABI 7500荧光PCR扩增仪。，一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或35：阴性；Ct小于32：阳性。
实施例1
本例中以EGFR基因热点突变外显子19上的E746_A750del(2235_2249del15)突变为例来分析本发明的单管荧光PCR检测EGFR基因19种缺失突变的方法。实验用细胞系4株，分别为H1650(带E746_A750del突变)、H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)；100份健康的无偿献血者全血样品、62份临床肺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。
利用上述荧光PCR检测EGFR基因热点突变外显子19上的E746_A750del(2235_2249del15)突变的方法包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取质控：
样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。
(2)荧光PCR扩增，配制反应体系：
1×PCR缓冲液
MgCl₂       7.0mmol
dNTP各      1.0mmol
各对引物    0.1~1.0μmol
各条探针    0.5~1.0μmol
Taq酶       2.5U
模板        5μl
总体积       50μl
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环。
(3)检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)后35个循环退火阶段检测FAM和HEX或ROX荧光信号，一次可以检测96份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或35：阴性；Ct小于32：阳性。
前述100份健康献血者全血样品以及细胞系H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)，突变细胞系H1650(带E746_A750del突变)经本发明的体系检测，只有H1650细胞系DNA有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。
灵敏度分析：将突变型细胞系H1650DNA从100ng/μL连续10倍梯度稀释，分别为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。
选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将突变细胞系(H1650)的DNA和野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。
A：50％即为100ng/μL突变细胞DNA。
B：30％取A液60μL后混入40μL 100ng/μL H460细胞DNA，震荡混均。
C：20％取A液40μL后混入60μL 100ng/μL H460细胞DNA，震荡混均。
D：15％取B液50μL后混入50μL 100ng/μL H460细胞DNA，震荡混均。
E：10％取C液50μL后混入50μL 100ng/μL H460细胞DNA，震荡混均。
F：5％取E液50μL后混入50μL 100ng/μL H460细胞DNA，震荡混均。
G：1％取F液20μL后混入80μL 100ng/μL H460细胞DNA，震荡混均。
H：0.5％取G液50μL后混入50μL 100n/μL H460细胞DNA，震荡混均。
I：0.1％取H液20μL后混入80μL 100n/μL H460细胞DNA，震荡混均。
结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0.1％。
重复性试验：每个反应分别加入突变细胞系H1650DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。
收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共62例，其中49组织样品，1例血浆，3例胸水，9例全血。其中男性34例，女性28例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。
对于外显子19，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：62例样品中有3例发生外显子19的E746-A750突变，15例正常肺组织对照均为野生型。其中均为2例女性，1例男性，女性和男性分别占了67％和33％。
表4荧光PCR检测结果与DNA测序结果的比较

本发明单个PCR反应就可以同时检测EGFR外显子19的19种缺失，检测时间仅需100分钟，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含0.1％的突变DNA即可检出。
实施例2
本例中以EGFR基因热点突变外显子19上的L747_P753＞S(2240_2257del18)突变为例来分析本发明的单管荧光PCR检测EGFR基因19种缺失突变的方法。实验用质粒模板1株(含L747_P753＞S突变)，细胞系3株，分别为H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)；100份健康的无偿献血者全血样品、62份临床肺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。
利用上述荧光PCR检测EGFR基因热点突变外显子19上的L747_P753＞S(2240_2257del18)突变的方法包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取质控：
样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。
(2)荧光PCR扩增，配制反应体系：
1×PCR缓冲液
MgCl₂       7.0mmol
dNTP各      1.0mmol
各对引物    0.1~1.0μmol
各条探针    0.5~1.0μmol
Taq酶       2.5U
模板        5μl
总体积      50μl
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环。
(3)检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)后35个循环退火阶段检测FAM和HEX或ROX荧光信号，一次可以检测96份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或35：阴性；Ct小于32：阳性。
前述100份健康献血者全血样品以及细胞系H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)，突变质粒DNA(带L747_P753＞S突变)经本发明的体系检测，只有突变质粒DNA有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。
灵敏度分析：将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释，每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。
选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。然后将10⁵拷贝/μL的突变质粒DNA用20ng/μL和2ng/μL的H460DNA连续10倍稀释。
结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0.1％。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝和10拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。
收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共62例，其中49组织样品，1例血浆，3例胸水，9例全血。其中男性34例，女性28例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。
对于外显子19，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：62例样品中有3例发生外显子19的缺失突变，15例正常肺组织对照均为野生型。其中均为2例女性，1例男性，女性和男性分别占了67％和33％。
表4荧光PCR检测结果与DNA测序结果的比较

本发明单个PCR反应就可以同时检测EGFR外显子19的19种缺失，检测时间仅需100分钟，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含0.1％的突变DNA即可检出。
实施例3
本例中以EGFR基因热点突变外显子19上的E746_T751del(2236_2253del18)突变为例来分析本发明的单管荧光PCR检测EGFR基因19种缺失突变的方法。实验用质粒模板1株(含E746_T751del突变)，细胞系3株，分别为H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)；100份健康的无偿献血者全血样品、62份临床肺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。
利用上述荧光PCR检测EGFR基因热点突变外显子19上的L747_P753＞S(2240_2257del18)突变的方法包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取质控：
样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。
(2)荧光PCR扩增，配制反应体系：
1×PCR缓冲液
MgCl₂       7.0mmol
dNTP各      1.0mmol
各对引物    0.1~1.0μmol
各条探针    0.5~1.0μmol
Taq酶       2.5U
模板        5μl
总体积      50μl
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环。
(3)检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)后35个循环退火阶段检测FAM和HEX或ROX荧光信号，一次可以检测96份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或35：阴性；Ct小于32：阳性。
前述100份健康献血者全血样品以及细胞系H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)，突变质粒DNA(带L747_P753＞S突变)经本发明的体系检测，只有突变质粒DNA有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。
灵敏度分析：将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。
选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。然后将10⁵拷贝/μL的突变质粒DNA用20ng/μL和2ng/μL的H460DNA连续10倍稀释。
结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0.1％。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝和10拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。
收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共62例，其中49组织样品，1例血浆，3例胸水，9例全血。其中男性34例，女性28例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。
对于外显子19，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：62例样品中有3例发生外显子19的缺失突变，15例正常肺组织对照均为野生型。其中均为2例女性，1例男性，女性和男性分别占了67％和33％。
表4荧光PCR检测结果与DNA测序结果的比较

本发明单个PCR反应就可以同时检测EGFR外显子19的19种缺失，检测时间仅需100分钟，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含0.1％的突变DNA即可检出。
序列表
<110>厦门艾德生物医药科技有限公司
<120>用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及其使用方法
<160>24
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GAATTCAAAA AGATCAAAGT GCTGGC     26
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CTGAATTCAA AAAGATCAAA GTGCTGA    27
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CTGAATTCAA AAAGATCAAA GTGCTGT      26
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
TCTGGGCTCC CCACCAGAC               19
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
GTTAAAATTC CCGTCGCTAT CAAAAC       26
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GTTAAAATTC CCGTCGCTAT CAAAATATC    29
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
TCCCGTCGCT ATCAAGGATC    20
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
CCCGTCGCTA TCAAGGAGC     19
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
TCCCGTCGCT ATCAAGGAAC    20
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
TTCCCGTCGC TATCAAGGAA TCTT    24
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
CGGCTGCCAG ACATGAGAAAAG       22
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
GAAGCCTACG TGATGGCCAT         20
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
GTGGACAACC CCCACCAC    18
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
CGTGGACAAC CCCCACC     17
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ATGGCCAGCG TGGACGGT    18
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
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<213>人工序列
<400>17
GAGCAGGTAC TGGGAGCC           18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
TGTCAAGATC ACAGATTTTG GGGG    24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
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<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
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<210>22
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
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<210>24
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
AAGTAAGCCT CCTTACTTTG CCTCCTTCTG CAAGGAGGC    39