技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种具有端粒酶保护作用的酶解大米蛋白的制备方法。
背景技术
人的正常细胞会在数十次的自然穿传代后变为衰老细胞，而每一次的细胞分裂都使得染色体缩短，引至细胞趋于成熟和老化。而要抑制这种细胞的老化则需要保护染色体中的端粒。端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，实质上是一重复序列，作用是保持染色体的完整性。端粒酶是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体，为RNA依赖的DNA聚合酶，能将端粒片段加至端粒的末端，修复端粒原有的长度。据科学研究把端粒酶注入衰老细胞中，能够延长端粒长度，使细胞年轻化。
多肽是氨基酸通过肽键连接形成的化合物，是机体细胞的主要组成成分。小分子肽是由二到四个氨基酸组成的具有特定生物活性的肽类总称。已有报道证实小分子肽具有修复端粒末端及延长端粒长度的作用，即具有类似端粒酶的端粒保护作用。因此小分子肽应用于化妆品中可获得抗皱、抗衰老的良好效果。
微生物发酵与酶解法是目前使用较为广泛的两种多肽的制备方法。微生物发酵法的产物多为大分子肽，而酶解法也存在酶解效率低、酶用量大、生产成本高等问题。目前已报道的增加酶解效率的方法主要有两种：一种是对酶进行改性提高其生物活性和在不良环境中的稳定性。如小分子化合物结合在酶上，使蛋白球表面亲水化以提高酶的稳定性；另一种是添加助酶解剂，降低酶与反应底物间的表面张力。如Seo等人研究发现Tween20的加入可有效增加纤维素与纤维素酶之间的接触面积，从而提高纤维素酶的利用率，促进木质纤维素的酶解（BioresourceTechnology,2011,102:9605-9612）。本发明采用微生物发酵与酶解相结合的方法，并以化学改性酶作为酶解助剂制备大米蛋白，该方法蛋白酶使用量低、大米蛋白产量高且小分子肽含量高，所得的大米蛋白具有增加端粒长度的功效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种具有端粒酶保护作用的酶解大米蛋白的制备方法，该方法蛋白酶使用量低、大米蛋白产量高且小分子肽含量高，所得的大米蛋白具有增加端粒长度的功效。
一种具有端粒酶保护作用的酶解大米蛋白的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为大米：水=1:1~100的混合物，所述料液比为g/L；
2）将步骤1）所得混合物在高压锅中在60~120oC的温度下蒸煮30~60min；
3）蒸煮后的混合物降温至40~60oC，然后添加占混合物质量分数0.1%~10%的地枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵温度40~60oC，发酵湿度为50%~90%，发酵时间为24~72h，发酵结束后获取发酵滤液待用；
4）将步骤3）所得发酵滤液置于超声槽中以5~100KHZ的频率进行超声处理，然后加入复合蛋白酶溶液，形成酶解液，所述复合蛋白酶溶液由改性胰蛋白酶溶液、改性木瓜蛋白酶溶液、PEG-100硬脂酸酯溶液按质量比1：1~10：1~10组成；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节步骤4）所得酶解液的pH为6.0~8.0，维持酶解温度为25~50oC，酶解60~240min；
6）酶解结束后，经60~80oC高温灭酶，既得具有端粒酶保护作用的酶解大米蛋白。
复合蛋白酶溶液的具体制备步骤如下：
所述改性胰蛋白酶溶液通过以下方法制备：在25oC下，在pH=6的柠檬酸溶液中，边搅拌边加入天然胰蛋白酶，待其完全溶解后，缓慢加入质量为其5倍的二甲基辛二酸亚胺酯，恒温反应12h，停止反应，得到质量分数为10%的改性胰蛋白酶溶液；
所述改性木瓜蛋白酶溶液通过以下方法制备：在25oC下，在pH=6的柠檬酸溶液中，边搅拌边加入天然木瓜蛋白酶，待其完全溶解后，缓慢加入质量为其5倍的二甲基辛二酸亚胺酯，恒温反应12h，停止反应，得到质量分数为10%的改性木瓜蛋白酶溶液；
所述PEG-100硬脂酸酯溶液为质量分数为10%的PEG-100硬脂酸酯水溶液。
本发明使用微生物发酵与酶解法相结合，在微生物法将大米蛋白酶解成大分子肽的基础上采用酶解法进一步将大分子肽酶解成小分子肽，可以大大降低酶解过程中酶的使用量。同时在酶解过程中以二甲基辛二酸亚胺酯改性的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶代替天然的蛋白酶，可显著提高蛋白酶的生物活性和稳定性。再者首次将PEG-100硬脂酸酯作为助酶解剂，用以降低蛋白酶与蛋白质之间的表面张力，增加二者之间的接触面积，从而提高酶解效率。与传统的单一酶解法相比，本发明在较少蛋白酶的使用基础上，实现了小分子肽转化的最大化。
采用本发明方法所提取的小分子肽复合物中含有二肽β-丙氨酰-L-组氨酸、β-丙氨酸-甲基-L-组氨酸，三肽甘氨酸-L-组氨酸-赖氨酸等易于吸收的小分子肽；四肽谷氨酸-L-组氨酸-脯氨酸-β-丙氨酰及游离的氨基酸和未分解的蛋白。
取实施例1、对比例1、对比例2制备的多肽复合物，利用高效液相色谱检测其产物中小分子肽的含量。结果显示为，实施例1微生物发酵酶解法制得的产物中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为7.5mg/L，对比例1复合酶解法制得的产物中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为1.2mg/L，对比例2微生物发酵普通酶解法制得的产物中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为0.43mg/L，有效说明本发明在使用相同蛋白酶的条件下可获得较多的小分子肽产物。
所述对比例1的多肽的制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:80g/L的酶解原液；
2）将酶解原液置于超声槽中以100KHZ的频率进行超声，加入改性胰蛋白酶：改性木瓜蛋白酶：PEG-100硬脂酸酯质量比为1:1:1的复合蛋白酶溶液；
3）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为6.0，维持酶解温度为35oC，酶解时间为240min；
4）酶解结束后经80oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为1.2mg/L。
所述对比例2微生物发酵酶解水解大米蛋白的制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:80g/L的发酵原液；
2）将发酵原液置于高压锅中以100oC的温度蒸煮30min；
3）蒸煮后的发酵原液降温至60oC后，接入原料比例10%的地枯草芽孢杆菌，维持发酵温度为60oC，发酵湿度为80%，发酵时间为64h，发酵结束后过滤取滤液待用；
4）将步骤3）获得的滤液置于超声槽中以100KHZ的频率进行超声，加入天然胰蛋白酶：天然木瓜蛋白酶质量比为1：10的复合天然蛋白酶溶液；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为6.0，维持酶解温度为35oC，酶解时间为240min；
6）酶解结束后经80oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为0.43mg/L。
使用定量聚合酶链反应（PCR）的方法来测量小分子肽对端粒长度的促增长作用。选取5例健康人外周血样本，每例两份血样，共10份，分为两组a组（未加小分子肽的样品）5份和b组（加入实施例1的小分子肽样品）5份，用端粒长度扩增引物对样品进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后得到DNA基因片段。最后采用PCR法测量端粒长度相对T/S（端粒/单拷贝）比率，而T/S比率同端粒的平均长度呈正比关系，故端粒长度可根据T/S比值来确定。测试结果如表1所示，结果发现，b组的T/S比值比a组高了35%，说明小分子肽有增加端粒长度的效果，具有与端粒酶相似的保护、稳定端粒的作用。
表1小分子肽对端粒长度T/S比值的影响
样本号 a b 1 0.45 0.67 2 0.52 0.73 3 0.47 0.64 4 0.46 0.61 5 0.51 0.68
将实施例1中的小分子肽复合物以1%的比例加入乳液中，通过测试人体皮肤弹性的变化检测其抗衰老效果。皮肤真皮层中的胶原纤维、弹力纤维以及填充于细胞间的氨基聚糖、蛋白多糖与结合水以一定的排列组合方式赋予了皮肤弹性，皮肤弹性越好表明皮肤越年轻，弹性是化妆品抗衰老功效评价的重要参数。
具体方法如下：测试样品为添加1%小分子肽成分的乳液和不添加小分子肽成分的乳液。测试点标记：在每位受试者的左右前臂内侧用模具标记测试区域(4cm*6cm)，模具上挖有洞孔，在洞孔边标记各个测试探头的测试点位置。样品按2.0±0.1mg/cm2的用量，均匀涂于试验区，每种样品随机选用受试者8名。通过皮肤弹性测试仪MPA580测定受试者前臂内侧标记点使用样品前、使用样品15d，30d后的皮肤弹性变化如图1、图2所示。从中可以看出，添加小分子肽的产品使用后对皮肤的弹性有明显提高，平均R2值从0.43提高到0.78，而未添加小分子肽的产品对皮肤弹性没有明显影响。说明小分子肽的添加在提高皮肤弹性上起到了至关重要的作用，可运用于抗皱产品的开发。
附图说明
图1为未添加小分子肽产品使用30天内皮肤弹力变化；
图2为添加小分子肽产品使用30天内皮肤弹力变化。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明方法及在化妆品中的使用效果，但本发明并不限于这些例子。
实施例1：
一种具有端粒保护作用的水解大米蛋白制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:80g/L的发酵原液；
2）将发酵原液置于高压锅中以100oC的温度蒸煮30min；
3）蒸煮后的发酵原液降温至60oC后，接入原料比例10%的地枯草芽孢杆菌，维持发酵温度为60oC，发酵湿度为80%，发酵时间为64h，发酵结束后过滤取滤液待用；
4）将步骤3）所得发酵滤液置于超声槽中以100KHZ的频率进行超声处理，然后加入改性胰蛋白酶：改性木瓜蛋白酶：PEG-100硬脂酸酯质量比为1:1:1的复合蛋白酶溶液；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为6.0，维持酶解温度为35oC，酶解时间为240min；
6）酶解结束后经80oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为7.5mg/L。
实施例2：
一种具有端粒保护作用的水解大米蛋白制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:1g/L的发酵原液；
2）将发酵原液置于高压锅中以60oC的温度蒸煮60min；
3）蒸煮后的发酵原液降温至40oC后，接入原料比例0.1%的地枯草芽孢杆菌，维持发酵温度为40oC，发酵湿度为50%，发酵时间为24h，发酵结束后过滤取滤液待用；
4）将步骤3）所得发酵滤液置于超声槽中以5KHZ的频率进行超声处理，然后加入改性胰蛋白酶：改性木瓜蛋白酶：PEG-100硬脂酸酯质量比为1:10:10的复合蛋白酶溶液；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为8.0，维持酶解温度为45oC，酶解时间为60min；
6）酶解结束后经60oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为4.5mg/L。
实施例3：
一种具有端粒保护作用的水解大米蛋白制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:50g/L的发酵原液；
2）将发酵原液置于高压锅中以75oC的温度蒸煮45min；
3）蒸煮后的发酵原液降温至45oC后，接入原料比例5%的地枯草芽孢杆菌，维持发酵温度为45oC，发酵湿度为70%，发酵时间为36h，发酵结束后过滤取滤液待用；
4）将步骤3）所得发酵滤液置于超声槽中以50KHZ的频率进行超声处理，然后加入改性胰蛋白酶：改性木瓜蛋白酶：PEG-100硬脂酸酯质量比为1:5:3的复合蛋白酶溶液；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为7，维持酶解温度为35oC，酶解时间为120min；
6）酶解结束后经70oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为10.2mg/L。
实施例4：
一种具有端粒保护作用的水解大米蛋白制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:50g/L的发酵原液；
2）将发酵原液置于高压锅中以120oC的温度蒸煮90min；
3）蒸煮后的发酵原液降温至25oC后，接入原料比例1%的地枯草芽孢杆菌，维持发酵温度为30oC，发酵湿度为60%，发酵时间为24h，发酵结束后过滤取滤液待用；
4）将步骤3）所得发酵滤液置于超声槽中以80KHZ的频率进行超声处理，然后加入改性胰蛋白酶：改性木瓜蛋白酶：PEG-100硬脂酸酯质量比为1:2:8的复合蛋白酶溶液；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为7.5，维持酶解温度为35oC，酶解时间为150min；
6）酶解结束后经65oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为11.8mg/L。
实施例5：
一种具有端粒保护作用的水解大米蛋白制备方法，采用如下步骤：
1）将大米经粉粹、过滤预处理后，加水搅拌均匀，配成料液比为1:20g/L的发酵原液；
2）将发酵原液置于高压锅中以90oC的温度蒸煮50min；
3）蒸煮后的发酵原液降温至50oC后，接入原料比例3%的地枯草芽孢杆菌，维持发酵温度为50oC，发酵湿度为75%，发酵时间为72h，发酵结束后过滤取滤液待用；
4）将步骤3）所得发酵滤液置于超声槽中以30KHZ的频率进行超声处理，然后加入改性胰蛋白酶：改性木瓜蛋白酶：PEG-100硬脂酸酯质量比为1:7:10的复合蛋白酶溶液；
5）采用柠檬酸与碳酸氢钠调节酶解液的pH为8.0，维持酶解温度为50oC，酶解时间为200min；
6）酶解结束后经65oC高温灭酶后的产物，无需进一步提纯便可添加至化妆品中进行使用，其中分子量在100~2000Da之间的小分子肽含量为3.6mg/L。