技术领域
本发明涉及多肽药物制备方法领域，尤其涉及一种西那普肽的化学合成 方法。
背景技术
新生儿呼吸窘迫综合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS） 指新生儿出生后出现短暂（数分钟至数小时）的自然呼吸，继而发生进行性 呼吸困难、发绀、呻吟等急性呼吸窘迫症状和呼吸衰竭。患儿肺内形成透明 膜为其主要病变，故又称新生儿肺透明膜病（hyaline membrane disease of newborn）。据悉，我国每年约有1600万新生儿，新生儿呼吸窘迫综合征的发 病率大约是0.5％。而在美国，每年约有2万～3万新生儿患此病，占妊娠数 的1％。新生儿呼吸窘迫综合征发生的原因主要是由于缺乏肺表面活性物质 （pulmonarysurfactant，PS），呼气末肺泡萎陷，致使出生后不久出现进行性加 重的呼吸窘迫和呼吸衰竭，常见于早产儿，胎龄越小，发病率越高。
2012年3月6日，美国食品及药物管理局（FDA）批准了芦西纳坦 （lucinactant，商品名Surfaxin）用于治疗新生儿呼吸窘迫综合征。芦西纳坦 是在西那普肽（sinapultide）的基础上根据天然人肺表面活性剂的特点设计而 成的产品，用于模拟人肺表面活化蛋白B（SP-B）。
西那普肽是一个具有20个氨基酸的多肽分子，其结构序列如SEQ ID NO： 1所示。
1993年美国专利5260273A利用基因重组技术合成了具有SEQ ID NO：1 结构的多肽分子，此后一直未见关于西那普肽合成方法的报道。
但是利用基因重组技术对西塔普肽进行合成，操作起来十分困难，且所 需时间较长，最重要的是，一旦重组基因DNA分子链上的核苷酸发生突变， 则会造成肽链上相应的氨基酸突变，降低了药品的纯度和使用安全性。
如果采用化学方法通过逐步偶联的方式合成西那普肽则会避免上述问 题，但是由于西那普肽的肽链中存在着16个疏水性极强的亮氨酸，加大了偶 联反应操作的难度，从而使逐一偶联氨基酸合成西那普肽的方法周期加长， 而且进行20步氨基酸的偶联反应会使成本升高，副产物增多，导致纯品回收 率低。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种西那普肽的化学合成 方法，避免产生在逐一偶联氨基酸制备西那普肽过程中周期长、成本高、副 产物多的问题。
本发明提供的西那普肽的化学合成方法，包括以下步骤：
步骤1：制备具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段和具有SEQ ID NO：2 所示结构的多肽树脂；
步骤2：取所述具有SEQ ID NO：2所示结构多肽树脂，逐步偶联所述具有 SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段，偶联三次后，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂；
步骤3：取所述西那普肽树脂裂解并纯化即得西那普肽。
由于在西那普肽的序列中包含有16个疏水性极强的亮氨酸，而疏水氨基 酸的偶联反应不易发生，如通过逐个偶联的方式制备西那普肽则会使反应效 率的降低，而副产物增多。西那普肽的序列由4个SEQ ID NO：2所示的结构 顺序相连组成，本发明通过合成具有SEQ ID NO：2结构的多肽小片段作为合 成的中间体，经过3步偶联反应，合成具有SEQ ID NO：1结构的西那普肽树 脂。如此不但减少了偶联反应次数，更避免了重复偶联亮氨酸，从而提高了 合成效率、降低了副产物的含量、节约了制备成本。
优选地，所述步骤2具体为：
21）取过量的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂，与具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段进行偶联，制得具有SEQ ID NO：3所示 结构的多肽树脂；
22）取过量的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段，与具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂进行偶联，制得具有SEQ ID NO：4所示 结构的多肽树脂；
23）取过量的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段，与具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂进行偶联，制得具有SEQ ID NO：1所示 结构的西那普肽树脂。
优选地，步骤21）中所述的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段与具 有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂的摩尔比为（3~6）：1，更优选的为 （4~6）：1，最优选的为5：1。
优选地，步骤22）中所述的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段与具 有SEQ ID NO：3示结构的多肽树脂的摩尔比为（3~6）：1，更优选的为（4~6）：1， 最优选的为5：1。
优选地，步骤23）中所述的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段与具 有SEQ ID NO：4示结构的多肽树脂的摩尔比为（3~6）：1，更优选的为（4~6）：1， 最优选的为5：1。
优选地，步骤2中所述偶联的反应时间为2~4小时，更优选地为3小时。
优选地，步骤2中所述偶联剂为PyBOP、TBTU或HBTU中任意一种与 HOBt的混合物，或采用PyAOP或HATU中任意一种与HOAt的混合物。
优选地，步骤3中所述裂解采用的裂解液的主要成分为TFA。
优选地，所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂的制备过程具体为：
111）制备Fmoc-Leu-CTC树脂或Fmoc-Leu-Wang树脂；
112）取所述Fmoc-Leu-CTC树脂或Fmoc-Leu-Wang树脂，逐步偶联 Leu、Leu、Leu、Lys，制得具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂。
优选地，步骤111）为制备Fmoc-Leu-Wang树脂。
优选地，步骤112）中所述偶联采用的偶联剂为DIC、PyBOP或TBTU 中任意一种与HoBt的混合物。
优选地，所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段的制备过程具体为：
121）制备Fmoc-Leu-CTC树脂；
122）取所述Fmoc-Leu-CTC树脂，逐步偶联Leu、Leu、Leu、Lys制得 具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂；
123）裂解所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂，制得具有 SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段。
优选地，步骤122）所述偶联采用的偶联剂为DIC、PyBOP或TBTU中 任意一种与HoBt的混合物。
优选地，步骤123）所述裂解采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或 TFE与DCM的混合物。
本发明还提供了另一种西那普肽的化学合成方法，包括以下步骤：
步骤A：制备具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段和具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂；
步骤B：取过量的所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段加入偶 联剂，然后用反应溶剂溶解，活化后作为第一反应液；
步骤C：取所述第一反应液加入所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多 肽树脂中，进行第一偶联反应制得具有SEQ ID NO：3所示结 构的多肽树脂，回收第一偶联反应后的液体为第二反应液；
步骤D：将所述第二反应液加入所述具有SEQ ID NO：3所示结构的多 肽树脂中，进行第二偶联反应制得具有SEQ ID NO：4所示结 构的多肽树脂，回收第二偶联反应后的液体为第三反应液；
步骤E：将所述第三反应液加入所述具有SEQ ID NO：4所示结构的多 肽树脂中进行第三偶联反应，制得具有SEQ ID NO：1所示结 构的西那普肽树脂；
步骤F：取所述西那普肽树脂裂解并纯化即得西那普肽。
优选地，步骤B中所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段的摩尔量 是具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂的8~12倍，更优选地是9~11倍， 最优选地是10倍。
优选地，所述偶联的反应时间为1~2小时，更优选地为1小时。
优选地，步骤B中所述反应溶剂采用DMF、DCM、NMP或DMSO中的 一种或多种，更优选地采用DMF与DMSO的混合液，最优选地为DMF与 DMSO的比例以体积比计为1：1。
与现有技术相比，本发明通过合成具有SEQ ID NO：2结构的多肽小片 段作为反应的中间体，利用分段合成的方式经过3步偶联反应得到具有SEQ ID NO：1结构的多肽树脂，之后采用常规技术对多肽树脂进行裂解后纯化得 到西那普肽纯品。由于多肽小片段的合成较为简单，且减少了偶联反应次数， 本发明将西那普肽的合成周期缩短了2/3。实验表明，采用本发明方法合成的 西那普肽产品纯度大于99％，总收率大于30％，并且该方法操作简单，合成 周期短，成本不高，副产物少，产品收率高。
附图说明
图1为本发明实施例24中制得的西那普肽纯品色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种西那普肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明 的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本 发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组 合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的西那普肽的化学合成方法，包括以下步骤：
步骤1：制备具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段和具有SEQ ID NO：2 所示结构的多肽树脂；
步骤2：取所述具有SEQ ID NO：2所示结构多肽树脂，逐步偶联所述具有 SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段，偶联三次后，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂；
步骤3：取所述西那普肽树脂裂解并纯化即得西那普肽。
由于所述SEQ ID NO：2所示的结构为西那普肽序列的一部分，西那普肽 的序列由4个SEQ ID NO：2所示的结构顺序相连组成，本发明通过合成具有 SEQ ID NO：2结构的多肽小片段作为合成的中间体，利用分段合成的方式经 过3步偶联反应得到具有SEQ ID NO：1结构的西那普肽树脂。
有基于此，具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂的制备过程具体为： 首先，制备Fmoc-Leu-CTC树脂或Fmoc-Leu-Wang树脂；然后，取制得的 Fmoc-Leu-CTC树脂或Fmoc-Leu-Wang树脂，逐步偶联Leu、Leu、Leu、 Lys，制得具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂。
在制备具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂过程中采用的偶联剂为 DIC、PyBOP或TBTU中任意一种与HoBt的混合物。
在此基础上，具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段的制备过程具体为： 首先，制备Fmoc-Leu-CTC树脂；然后，取制得的Fmoc-Leu-CTC，逐步偶 联Leu、Leu、Leu、Lys制得具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂； 然后，裂解所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂，制得具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段。
在此过程中，偶联采用的偶联剂仍为DIC、PyBOP或TBTU中任意一种 与HoBt的混合物。裂解采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM 的混合物。
为了得到西那普肽树脂，步骤2的具体过程为：首先，取过量的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂，与具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段进 行偶联，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂；然后，取过量的具有 SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段，与具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树 脂进行偶联，制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂；然后，取过量的 具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段，与具有SEQ ID NO：4所示结构的多 肽树脂进行偶联，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂。
为了使偶联反应充分进行，具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段与具 有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂的摩尔比为（3~6）：1，更优选的为 （4~6）：1，最优选的为5：1。
同时，具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段与具有SEQ ID NO：3示结 构的多肽树脂的摩尔比为（3~6）：1，更优选的为（4~6）：1，最优选的为5：1。
同时，具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段与具有SEQ ID NO：4示结 构的多肽树脂的摩尔比为（3~6）：1，更优选的为（4~6）：1，最优选的为5∶1。
在此基础上，本发明提供的西那普肽合成方法的步骤2中，偶联的反应 时间为2~4小时，采用的偶联剂为PyBOP、TBTU或HBTU中任意一种与HOBt 的混合物，或采用PyAOP或HATU中任意一种与HOAt的混合物。在本发明 的实施方式中，偶联效果较好的偶联剂为PyAOP与HOAt的混合物。
为了充分裂解西那普肽树脂得到西那普肽，步骤3中，裂解西那普肽树 脂采用的裂解液的主要成分为TFA。本发明中裂解西那普肽树脂可采用的裂 解液有：TFA与H2O的混合物，以体积比计TFA∶H2O＝95∶5；或采用TFA、DET、 PHOH和H2O的混合物，以体积比计TFA∶DET∶PHOH∶H2O＝90∶5∶3∶2；或采用 TFA、DET、TIS、PHOH、和H2O的混合物，以体积比计
TFA∶DET∶TIS∶PHOH∶H2O＝80∶5∶5∶5∶5；在本发明的实施方式中，优选的裂解液 为TFA与H2O的混合物
本发明还提供了另一种西那普肽的化学合成方法，其过程为：首先，制 备具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段和具有SEQ ID NO：2所示结构的多 肽树脂；然后，取过量的所述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段加入偶 联剂，然后用反应溶剂溶解，活化后作为第一反应液；取第一反应液加入所 述具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂中，进行第一偶联反应制得具有 SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂，回收第一偶联反应后的液体为第二反应 液；将第二反应液加入所述具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂中，进行 第二偶联反应制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂，回收第二偶联反 应后的液体为第三反应液；取第三反应液加入所述具有SEQ ID NO：4所示结 构的多肽树脂中进行第三偶联反应，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那 普肽树脂；最后，取所述西那普肽树脂裂解并纯化即得西那普肽。
其中，具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段的摩尔量是具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽树脂的8~12倍，更优选地是9~11倍，最优选地是10 倍。
在此基础上，每次偶联的反应时间为1~2小时。
另外，为了使偶联反应更加充分，用于配制第一反应液的反应溶剂采用 DMF、DCM、NMP或DMSO中的一种或多种，优选地采用DMF与DMSO 的混合液，更优选地为DMF与DMSO的比例以体积比计为1∶1，活化所采用 的活化剂为DIPEA。
由于本发明合成了具有SEQ ID NO：2结构的多肽小片段，并将其作为 反应的中间体，经过3步偶联反应，将这些多肽小片段逐步偶联到预先制备 好的具有SEQ ID NO：2结构的多肽树脂上，得到具有SEQ ID NO：1结构 的西那普肽树脂，然后经过裂解和纯化得到西那普肽纯品。采用这种方式对 西那普肽进行合成可以避免亮氨酸的疏水性对偶联反应效率的限制，且减少 了偶联反应次数，大大缩短了合成周期，并提高了合成效率，同时，副产物 含量较低且成本不高。
本发明中采用的Wang树脂和2-CTC树脂购自天津南开和成有限公司， 反相/弱阳离子交换混合模式固定相购自中国科学院大连化物所，各种保护氨 基酸购自吉尔生化有限公司，其它溶剂和试剂为普通市售品。
本发明中所使用的缩写及其含义如下表所示：
表1本发明所使用的缩写及其含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基 Boc 叔丁氧羰基 Trt 三苯甲基 NMP N-甲基吡咯烷酮 DMSO 二甲基亚砜 DMF N,N-二甲基甲酰胺 DCM 二氯甲烷 DBLK 20％六氢吡啶/DMF溶液 DIC N,N-二异丙基碳二亚胺 DIPEA N,N-二异丙基乙胺 DMAP 4-二甲胺基吡啶 TFE 三氟乙醇 TFA 三氟乙酸 EDT 1,2-乙二硫醇 PHOH 苯酚 TIS 三异丙基硅烷 TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸 HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯 PyAOP (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐 PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基 HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 HOBt 1-羟基苯并三唑
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 Fmoc-Leu-Wang树脂的制备
称取替代度为0.8-0.9mmol/g的Wang Resin 1.2g，加入到固相反应柱中， 用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取0.51g Fmoc-Leu-OH、 0.13gHOBT和0.01gDMAP用DMF溶解，冰水浴下加入0.16mL DIC活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入5mL吡啶和5.5ml乙酸 酐封闭12小时。用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代 度为0.20mmol/g。
实施例2 Fmoc-Leu-CTC树脂的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂6g，加入到固相反应柱中，用 DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取3.2g Fmoc-Leu-OH用DMF 溶解，冰水浴下加入3mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反 应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时,用DMF洗涤6次，然后用DMF 洗涤6次。得到Fmoc-Leu-CTC树脂，检测替代度为0.40mmol/g。
实施例3 具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽Wang树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例1中制备的替代度为0.20mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂1.5 g，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Leu-Wang树 脂，30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次。将0.32g Fmoc-Leu-OH，0.25g HOBt，0.29ml DIC溶于体积比为1∶1的DCM和DMF 混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应终点以茚三酮法检测 为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再 偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤， 依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH， 其中最后一个氨基酸Lys偶联结束后不用脱除Fmoc，得到具有SEQ ID NO：2 所示结构的多肽Wang树脂：Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g。
实施例4 具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽Wang树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例1中制备的替代度为0.20mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂1.5 g，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Leu-Wang树 脂，30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次。将0.32 g Fmoc-Leu-OH，0.25g HOBt，0.28g PyBOP，0.55ml DIPEA溶于体积比为 1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应 终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表 示反应不完全，需再偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护基和加入相 应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH，其中最后一个氨基酸Lys偶联结束后不用脱除Fmoc，得 到具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽Wang树脂：Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu -Leu-Wang树脂1.3g。
实施例5 具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽Wang树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例1中制备的替代度为0.20mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂1.5 g，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Leu-Wang树 脂，30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次。将0.32 g Fmoc-Leu-OH，0.25g HOBt，0.30g TBTU，0.55ml DIPEA溶于体积比为 1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应 终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表 示反应不完全，需再偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护基和加入相 应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽Wang树脂： Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.2g。
实施例6具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-CTC树脂的制备
称取实施例2中制备的替代度为0.40mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂13g， 加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Leu-CTC树脂， 30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次，将3.2g Fmoc-Leu-OH，1.4g HOBt，1.8ml DIC溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混 合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为 准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶 联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依 次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Iys(Boc)-OH， 其中最后一个氨基酸Lys偶联结束后不用脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜，称重，得到具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂： Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-CTC树脂13g。
实施例7具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-CTC树脂的制备
称取实施例2中制备的替代度为0.40mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂13g， 加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Leu-CTC树脂， 30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次，将3.2g Fmoc-Leu-OH，1.4g HOBt，1.5g PyBOP，3.2mlDIPEA溶于体积比为1∶1的 DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应终点以 茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应 不完全，需再偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸 偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH，其中最后一个氨基酸Lys偶联结束后不用脱除Fmoc。反 应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重，得到具有SEQ ID NO：2所 示结构的多肽CTC树脂：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-CTC树脂12g。
实施例8具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-CTC树脂的制备
称取实施例2中制备的替代度为0.40mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂13g， 加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Leu-CTC树脂， 30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次，将3.2g Fmoc-Leu-OH，1.4g HOBt，1.6g TBTU，3.2mlDIPEA溶于体积比为1∶1的 DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应终点以 茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应 不完全，需再偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸 偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH，其中最后一个氨基酸Lys偶联结束后不用脱除Fmoc。反 应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重，得到具有SEQ ID NO：2所 示结构的多肽CTC树脂：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-CTC树脂11.5g。
实施例9具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu- Leu-Leu-OH多肽片段的制备
称取实施例6、7或8中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC 树脂13g，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂150ml（体积比，TFE： DCM＝1∶4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收 集滤液。将滤液滴加至1500ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：乙醚＝1∶4），离 心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽 片段：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段2.5g，纯度为95％。
实施例10具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽片段：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu- Leu-Leu-OH多肽片段的制备
称取实施例6、7或8中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽CTC 树脂13g，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂150ml（体积比，TFA： DCM＝1∶4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收 集滤液。将滤液滴加至1500ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：乙醚＝1∶4），离 心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到具有SEQ ID NO：2所示结构的多肽 片段：Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段2.0g，纯度为94％。
实施例11具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol），加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取实施例9或10 中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽 片段1.44g（约1.8mmol），加入0.48g TBTU、0.24g HOBt，用DMF和DCM （体积比为1∶1）的混合液溶解后加入0.5ml DIPEA，室温下进行偶联反应2 小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树 脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用DBLK脱除Fmoc保护， 然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.44g（约1.8mmol），加入0.48g TBTU、0.24g HOBt，用DMF和DCM（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入 0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示 结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.44g（约1.8mmol），加入0.48g TBTU、0.24g HOBt，用DMF和DCM（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入 0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明， 则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用DBLK 脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的 西那普肽树脂2.25g。
实施例12具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol），加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取实施例9或10 中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽 片段1.2g（约1.5mmol），加入0.78g PyBOP、0.24g HOBt，用DMF和DMSO （体积比为1∶1）的混合液溶解后加入0.5ml DIPEA，室温下进行偶联反应3 小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树 脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用DBLK脱除Fmoc保护， 然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.2g（约1.5mmol），加入0.78g PyBOP、0.24g HOBt，用DMF和DMSO（体积比为1∶1）的混合液溶解后加 入0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应3小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示 结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.2g（约1.5mmol），加入0.78g PyBOP、0.24g HOBt，用DMF和DMSO（体积比为1∶1）的混合液溶解后加 入0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应3小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示 结构的西那普肽树脂2.40g。
实施例13具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol），加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取实施例9或10 中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽 片段1.2g（约1.5mmol），加入0.57g HBTU、0.24g HOBt，用DCM和DMSO （体积比为1∶1）的混合液溶解后加入0.5ml DIPEA，室温下进行偶联反应3 小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树 脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用DBLK脱除Fmoc保护， 然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.2g（约1.5mmol），加入0.57g HBTU、0.24g HOBt，用DCM和DMSO（体积比为1∶1）的混合液溶解后加 入0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应3小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示 结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.2g（约1.5mmol），加入0.57g HBTU、0.24g HOBt，用DCM和DMSO（体积比为1∶1）的混合液溶解后加 入0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应3小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示 结构的西那普肽树脂2.31g。
实施例14具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol），加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取实施例9或10 中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽 片段0.96g（约1.2mmol），加入0.78g PyAOP、0.24g HOAt，用DMF和NMP （体积比为1∶1）的混合液溶解后加入0.5ml DIPEA，室温下进行偶联反应3 小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树 脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用DBLK脱除Fmoc保护， 然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段0.96g（约1.2mmol），加入0.78g PyAOP、0.24g HOAt，用DMF和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入 0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应3小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示 结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段0.96g（约1.2mmol），加入0.78g PyAOP、0.24g HOAt，用DMF和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入 0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应3小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示 结构的西那普肽树脂2.05g。
实施例15具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol），加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取实施例9或10 中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽 片段0.72g（约0.9mmol），加入0.57g HATU、0.24g HOAt，用DMSO和NMP （体积比为1∶1）的混合液溶解后加入0.5ml DIPEA，室温下进行偶联反应4 小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树 脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用DBLK脱除Fmoc保护， 然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段0.72g（约0.9mmol），加入0.57g HATU、0.24g HOAt，用DMSO和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加 入0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应4小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示 结构的多肽树脂。
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段0.72g（约0.9mmol），加入0.57g HATU、0.24g HOAt，用DMSO和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加 入0.5ml DIPEA，加入上述制得的具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂中， 室温下进行偶联反应4小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色 透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时），用 DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示 结构的西那普肽树脂1.96g。
实施例16具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段1.92g（约2.4mmol），加入0.48g TBTU、0.24g HOBt，用DMF和DCM（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入 1.0ml DIPEA，作为第一反应液。
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol）,加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入第一反应液，室 温下进行第一偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无 色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）， 回收偶联反应后剩余的液体作为第二反应液。用DBLK脱除Fmoc保护，然 后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
将第二反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第二偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，回收偶联反应后的液体作为第三反应液。用DBLK脱除 Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽 树脂。
将第三反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第三偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，抽掉剩余液体。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF 洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂2.06g。
实施例17具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段2.16g（约2.7mmol），0.78g PyAOP、 0.24g HOAt，用DMF和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入1.0ml DIPEA，作为第一反应液。
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol）,加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入第一反应液，室 温下进行第一偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无 色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）， 回收偶联反应后剩余的液体作为第二反应液。用DBLK脱除Fmoc保护，然 后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
将第二反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第二偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，回收偶联反应后剩余的液体作为第三反应液。用DBLK脱 除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多 肽树脂。
将第三反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第三偶联反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，抽掉剩余液体。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF 洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂2.18g。
实施例18具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段2.4g（约3mmol），1.56g PyBOP、 0.48g HOBt，用DMSO和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入1.0ml DIPEA，作为第一反应液。
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol）,加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入第一反应液，室 温下进行第一偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无 色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）， 回收偶联反应后剩余的液体作为第二反应液。用DBLK脱除Fmoc保护，然 后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
将第二反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第二偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，回收偶联反应后剩余的液体作为第三反应液。用DBLK脱 除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多 肽树脂。
将第三反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第三偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，抽掉剩余液体。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF 洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂2.4g。
实施例19具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段2.64g（约3.3mmol），0.57g HBTU、 0.24g HOBt，用DCM和DMSO（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入1.0ml DIPEA，作为第一反应液。
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol）,加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入第一反应液，室 温下进行第一偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无 色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）， 回收偶联反应后剩余的液体作为第二反应液。用DBLK脱除Fmoc保护，然 后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
将第二反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第二偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，回收偶联反应后剩余的液体作为第三反应液。用DBLK脱 除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多 肽树脂。
将第三反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第三偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，抽掉剩余液体。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF 洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂2.37g。
实施例20具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂的制备
称取实施例9或10中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH多肽片段2.88g（约3.6mmol），入0.57g HATU、 0.24g HOAt，用DMSO和NMP（体积比为1∶1）的混合液溶解后加入1.0ml DIPEA，作为第一反应液。
取实施例3、4或5中制备的具有SEQ ID NO：2所示结构的 Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Wang树脂1.5g（约0.3mmol），加入到固相反应 柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入第一反应液，室 温下进行第一偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无 色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）， 回收偶联反应后剩余的液体作为第二反应液。用DBLK脱除Fmoc保护，然 后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂。
将第二反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：3所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第二偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，回收偶联反应后剩余的液体作为第三反应液。用DBLK脱 除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多 肽树脂。
将第三反应液加入到上述制得具有SEQ ID NO：4所示结构的多肽树脂 中，室温下进行第三偶联反应1小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果 树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1 小时），反应结束，抽掉剩余液体。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF 洗涤6次，制得具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽树脂2.41g。
实施例21西那普肽粗品的制备
取实施例11~20任意一项中制备的具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普 肽树脂，加入50ml烧瓶中，用TFA和H2O配置裂解试剂（体积比为 TFA∶H2O＝95∶5），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2小时。反应结束，过滤 树脂，收集滤液。滴加至240ml乙醚中，离心，然后用无水乙醚洗涤，并且 真空干燥，得到具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽粗品，经检测纯度为 82.4％。
实施例22西那普肽粗品的制备
取实施例11~20任意一项中制备的具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普 肽树脂，加入50ml烧瓶中，用TFA、DET、PHOH和H2O配置裂解试剂（体 积比为TFA∶DET∶PHOH∶H2O＝90∶5∶3∶2），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2 小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至240ml乙醚中，离心，然后 用无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普 肽粗品，经检测纯度为79.6％。
实施例23西那普肽粗品的制备
取实施例11~20任意一项中制备的具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普 肽树脂，加入50ml烧瓶中，用TFA、DET、TIS、PHOH和H2O配置裂解试 剂（体积比为TFA∶DET∶TIS∶PHOH∶H2O＝80∶5∶5∶5∶5），将裂解试剂倒入烧瓶中， 室温反应2小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至240ml乙醚中， 离心，然后用无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到具有SEQ ID NO：1所示结 构的西那普肽粗品，经检测纯度为75.4％。
实施例24西那普肽粗品的纯化
称取实施例21~23任意一项中制备的具有SEQ ID NO：1所示结构的西那 普肽粗品1.1g，用50ml 20％醋酸溶液溶解并过滤。
采用RP-HPLC系统对具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽粗品进行纯 化，纯化色谱条件如下：
检测波长230nm；
色谱柱：规格：50×250mm，内装反相C18色谱柱；
流动相：0.2％TFA/乙腈流动相纯化；
收集目的峰馏分，初步纯化得到纯度大于98.5％的西那普肽。
采用RP-HPLC系统对具有SEQ ID NO：1所示结构的西那普肽进行转盐， 转盐色谱条件如下：
检测波长：230nm；
色谱柱：规格：50×250mm，内装反相C18色谱柱；
流动相：0.2％醋酸溶液/乙腈流动相转盐；
收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到西那普肽醋酸盐精肽0.4g。
对制得的西那普肽纯品进行高效液相色谱检测，检测的色谱图如图1所 示，其中西那普肽峰的出峰时间为：12.328min，与西那普肽标准品的出峰时 间一致，紫外吸收光谱分析表明，西那普肽与西那普肽标品的吸收光谱一致。 表明以本发明的方法制备出了西那普肽。经分析，以质量百分比计，本发明 制备的西那普肽纯度为99.0％，总收率40％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。