技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物筛选系统，尤其涉及一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤 药物筛选系统。
背景技术
癌症目前已成为人类最主要的致死疾病之一，严重威胁着人们的寿命。我国城乡居民恶 性肿瘤死亡率已属于世界较高水平，而且呈持续的增长趋势。中国每年癌症新发病例为220 万，因癌症死亡人数为160万人。其中，肺癌和乳腺癌在过去的30年分别上升了465%和96%。 恶性肿瘤已成为我国城市居民的第一位死亡原因，农村居民的第二位死亡原因。因此，我们 对于肿瘤预防和治疗的研究已刻不容缓。
化学疗法是目前治疗癌症的重要手段之一，寻找安全有效地化疗药物就显得尤其重要。 近年来，分子靶向药物因其治疗作用的高特异性和可以大幅度减低患者发生副作用的风险而 成为抗肿瘤研究的热点。随着我们对肿瘤细胞中TRAIL受体信号通路的研究不断深入，发现 此通路中的死亡受体DR5是很有潜力的肿瘤治疗的新靶标。
多种肿瘤预防及化疗药物均明显激活TRAIL受体信号通路，抑制此通路将显著降低药物 诱导肿瘤细胞凋亡的效率。很多抗肿瘤药物上调TRAIL受体信号通路中DR5的表达，例如， 本实验室发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米（英文名PS-341）就是通过上调DR5的表达，而激活 受体介导的凋亡信号通路。本实验室的工作还证明很多种进入临床实验的化疗药物诱导肿瘤 细胞凋亡也都需要激活死亡受体信号通路，TRAIL受体信号通路能否被激活也直接影响着肿 瘤化疗的效果。
随着生物技术的发展，以及对人类疾病的分子机制认识的加深，一种以特定药物靶点为 基础的筛选方法，也就是基于靶点药物的研究方法已经取代了传统的非特异性的方法。其中， 利用工程改造的细胞进行靶向药物筛选是最具有吸引力的一种方法。这种体外检测方法需要 弄清楚特定的靶分子所引发的特定细胞行为工程，而且还需要建立一种易于检测产物量的方 法，比如用灵敏度较高的荧光素酶（Luciferase）或绿色荧光蛋白GFP作为报告基因等。
基于细胞的筛选方法与体外筛选方法相比有很多显著的优点。第一，不需要纯化靶蛋白， 这就大大节省了成本和时间。第二，在细胞中，靶蛋白的构象、活性以及生物学功能更能接 近于生理学状态。因此，经过筛选得到的先导化合物具有更高的可靠性。经检索，目前并没 有基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明所述的一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统是由含DR5启动子与 荧光素酶报告基因的融合基因的细胞、细胞培养裂解试剂，荧光素酶检测底物构成。
上述含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞优选含DR5启动子与荧光素酶 报告基因的融合基因的非小细胞肺癌细胞A549，命名为：A549-pDR5-luc；或是含DR5启动 子与荧光素酶报告基因的融合基因的非小细胞肺癌细胞H157，命名为：H157-pDR5-luc；所 述细胞培养裂解试剂为promega公司的荧光素酶检测系统中的细胞培养裂解试剂，主要是对 细胞进行裂解；荧光素酶检测底物为promega公司的荧光素酶检测系统中的荧光素酶检测底 物，其在荧光素酶作用下被氧化，并发出生物荧光。
上述的基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统在筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的抗肿瘤药物筛选系统利用TRAIL受体信号通路作为新的抗肿瘤药物筛选的 靶标，根据TRAIL受体信号通路中标志蛋白DR5的表达情况来预测药物杀伤肿瘤细胞的效 果，以期建立快速高效的抗肿瘤药物筛选系统。在应用过程中，是通过测定被筛选化合物作 用于A549-pDR5-luc或H157-pDR5-luc细胞中荧光素酶报告基因表达的升高，来筛选促进 TRAIL受体DR5表达的化合物，即抗肿瘤药物，因此本发明可以高效的对化合物进行筛选， 确定它们是否有抗肿瘤作用。
本发明所述的基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统在筛选抗肿瘤药物中的 应用具体步骤是：
1）选择所构建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5-luc细胞以6×104个/孔细胞接种于含 5%血清的RPIM1640培养基的24孔板中，在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养 24—48h；
2）选取待筛选的化合物，根据其特性先溶解为1mM—10mM浓度的溶液，然后将溶 解好的化合物按终浓度是0—40μM的梯度浓度加入到步骤1）培养的细胞中，同时每种浓度 设置3个平行孔，然后处理6—12h；
3）待处理结束时，弃掉各孔中的细胞培养基，再用PBS清洗一次细胞，然后每孔中 加入200—250μL细胞裂解液，使裂解缓冲液完全覆盖细胞，并在4℃静置，裂解处理 30—40min；
4）充分吹打裂解后的细胞，将所有的细胞碎片和液体转移至离心管中，在4℃的离 心机中，13000±500rpm下离心2—5min；
5）取15μL离心后样品的上清液与10μL荧光素酶检测底物共放入荧光光度计试管 中混匀并使其反应；
6）将反应后的试管放入荧光光度计中进行检测，记录数据并求取平均值，根据检测 的数值判断该待筛选的化合物是否有抗肿瘤活性；当待筛选的化合物药物处理组的检测数值 减去对照组的检测数值大于5000时，说明该待筛选的化合物能明显诱导DR5启动子的活化， 预示该化合物为潜在的抗肿瘤化合物。所述对照组的检测数值对于A549-pDR5-luc细胞，空 白对照组数值一般为4000±500；对于H157-pDR5-luc细胞，空白对照组数值一般为8000± 500。
其中：上述待筛选的化合物是合成化合物、天然产物、有机小分子、无机小分子、脂类、 糖类中的一种或几种。
上述待筛选的化合物进一步优选从天然植物中提取的化合物2’-羟基，4’,5’-二甲氧基査 尓酮（DHMC）或豆蔻明（Cardamonin）。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明系统是一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，目前已证明多 种肿瘤预防及化疗药物均明显激活TRAIL受体信号通路，激活此通路将显著上调药物诱导肿 瘤细胞凋亡的效率，因此以TRAIL受体作为靶标，基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物 筛选系统，具有很高的可靠性和适应性。
2.本发明系统不需要纯化靶蛋白，这就大大节省了成本和时间，具有极高的新颖性和实 用性。另外在细胞中的靶蛋白的构象、活性以及生物学功能更能接近于生理学状态，因此， 经过筛选得到的先导化合物也具有很高的可靠性。
3.本发明系统是利用荧光素酶作为报告基因，用荧光光度计Luminometer检测荧光素酶 报告基因的活性，反映细胞中DR5的活化情况，进而反映该药物的抗肿瘤作用，因此更直接， 灵敏度较高。
4.本发明系统可应用于筛选各种化合物，包括合成化合物、天然产物、有机小分子、无 机小分子、脂、糖类等等，也可以用于检测多种药物联合的作用，应用范围广，具有极大的 灵活性。
5.本发明系统实验周期短，检测过程快速。
6.本发明系统同时也适合于高通量的抗肿瘤药物的筛选，可以将细胞接种在96孔板， 然后用带有自动注射器的多孔板发光仪器来检测荧光素酶报告基因的活性，高效快速。
附图说明
图1是DR5启动子的PCR结果。
图2是H157细胞中转染质粒pGL3-Basic或pGL3-pDR5，然后用0，100nmol/LPS-341 处理8h后，用荧光光度计检测细胞中荧光素酶报告基因活性。
图3是DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的PCR结果。
图4是DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因连在pGM-T载体上的酶切验证结 果。
图5是DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因连在慢病毒载体上的酶切验证结果。
图6是0，100nmol/LPS-341作用于A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc细胞8h后，用 荧光光度计检测细胞中荧光素酶报告基因的活性。
图7是用不同浓度的DHMC，Cardamonin处理A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc细胞 8h后，用荧光光度计检测细胞中荧光素酶报告基因的活性。
具体实施方式
下面结合附图和实施对本发明做详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本发明所述基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统由含DR5启动子与荧光素 酶报告基因的融合基因的细胞、细胞培养裂解试剂，荧光素酶检测底物构成，所述的细胞主 要是通过分子克隆技术和慢病毒表达系统构建而成。
上述基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统构建及应用步骤是：
1）DR5启动子基因的克隆
以A549细胞的cDNA为模板，根据invitrogen公司PCR试剂盒说明书，利用PCR技术 克隆DR5启动子基因（如图1）。然后在T4DNA连接酶的作用下与pGM-T载体在16℃连接 16h后，按照分子克隆实验指南制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，将1μL的连接产物加入到 10μL感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，加入500μL的无氨苄青霉素抗性的 LB液体培养基，37℃振摇1h，然后均匀的涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培 养过夜；之后挑取单克隆划线，利用菌落PCR、酶切等技术初步鉴定阳性克隆，送测序公司 测序，得到的测序结果如SEQ.NO.1所示，测序结果与基因库（NCBI）中比对，序列一致 性为100%，含有正确序列的质粒被命名为T-pDR5。
2）DR5启动子基因与荧光素酶报告基因的融合
利用限制性内切酶将T-pDR5中的DR5启动子基因酶切下来，产物用1.0%低熔点琼脂糖 凝胶电泳，回收DR5启动子基因并纯化。经过酶切且胶回收纯化的DR5启动子基因与载体 pGL3-Basic片段在T4DNA连接酶的作用下在16℃连接16h后，按上述步骤转化大肠杆菌 DH5α；然后利用菌落PCR，酶切等技术进行初步鉴定，挑选阳性克隆，命名为pGL3-pDR5。 然后根据Roche公司的X-tremeGENEHPDNA转染试剂的说明书转染H157细胞，对 pGL3-pDR5质粒进一步验证：
第一天：胰酶消化并计数H157细胞，并将它们接种在24孔板中，使其在第二天转染时 密度在30—60%之间，在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养过夜；
第二天：在0.5mL离心管中加入200μL无血清培养基，然后依次加入1μg质粒pGL3-Basic或pGL3-pDR5与2μLX-tremeGENEHPDNA转染试剂，混匀；静置15分钟；在静置期间，去掉H157细胞中旧的培养基，并换上600μL含5%血清的RPMI-1640培养基；15分钟后，将复合物逐滴加入到H157细胞中，4—8h后将旧的培养基换成2mL含5%血清的RPMI-1640培养基。
第三天：转染24h后，在培养基中分别加入0，100nmol/L的PS-341，每组处理设三个 平行，处理8h。
8h处理后，弃掉旧的细胞培养基，并用PBS清洗一次，然后每孔加入200μL细胞培养 裂解试剂（Promega，Cat.#E1531）；将细胞在4℃静置，裂解30min，然后充分吹打细胞，将 裂解后的细胞碎片和液体转移至0.5mL的离心管中，并在4℃的离心机中，13200rpm下离心 2min；然后取15μL的样品的上清液与10μL荧光素酶检测底物（Promega，Cat.#E1501）在 荧光光度计试管中混匀，使其反应；将盛混合物的试管放入荧光光度计中进行检测，记录数 据并取平均值。结果显示如图2所示，转染了pGL3-pDR5质粒的细胞相对于转染pGL3-Basic 的细胞中荧光素酶的活性提高了3倍左右，具有非常明显的差异，而且PS-341处理后，荧光 素酶的活性明显增加，这说明DR5启动子基因已经成功与荧光素酶报告基因相融合，而所用 于转染的pGL3-pDR5质粒是正确的。
3）将DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因克隆到慢病毒表达载体上
以pGL3-pDR5为模板，根据invitrogen公司PCR试剂盒说明书，利用PCR技术克隆DR5 启动子与荧光素酶报告基因的融合基因（如图3）。然后在T4DNA连接酶的作用下与pGM-T 载体在16℃连接16h后，按上述步骤转化大肠杆菌DH5α；然后利用菌落PCR，酶切（如图 4）等技术初步鉴定阳性克隆，送测序公司测序，测序结果与DR5启动子与荧光素酶报告基 因的融合基因进行比对，序列一致性为100%，正确序列的质粒被命名为T-pDR5-luc。
用限制性内切酶消化质粒，继而酶切产物（DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因） 用1.0%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因并纯化。 经过酶切且胶回收纯化的目的片段与慢病毒表达载体片段在T4DNA连接酶的作用下在16℃ 连接16h后，按照分子克隆实验指南制备大肠杆菌stabl3感受态细胞，将1μL的DR5启动子 与荧光素酶报告基因的融合基因与慢病毒表达载体的连接产物加入到10μL感受态细胞中，冰 浴30min，42℃热激90s，加入500μL的无氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃振摇1h， 然后均匀的涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，28℃培养过夜，然后挑取单克隆划线， 第二天利用菌落PCR或者提取质粒后酶切（如图5）等技术，鉴定阳性克隆，并命名为lenti- pDR5-luc。
4）制备含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的病毒
使用Invitrogen公司ViraPowerTM慢病毒表达系统进行制备病毒：
第一天：
在离心管中配置如下溶液：
溶液A：将9μg的ViraPowerTMPackagingMix和3μg的lenti-pDR5-luc质粒稀释到1.5mL无血清的培养基中，混匀；
溶液B：将36μLLipofectamineTM2000，稀释到1.5mL无血清的培养基中，混匀；静置5min；
混合溶液A和溶液B，轻轻混匀，室温静置20min，使其形成DNA-LipofectamineTM2000 复合物；在DNA-LipofectamineTM2000复合物形成的20min内，胰酶消化293FT细胞，用含 血清的DMEM培养基重悬细胞使其密度为1.2×106个/mL（不要加抗生素）；待20min后，将 DNA-LipofectamineTM2000复合物加入到已含有5mL有血清的DMEM培养基的10cm的培 养皿中，混匀；然后加入5mL293FT的细胞悬液，混匀；在37℃，5%CO2，饱和湿度的培 养箱中培养过夜。
第二天：
去掉含有DNA-LipofectamineTM2000复合物的培养基，并换上10mL不加抗生素的有血 清DMEM培养基，在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养过夜。
第三天或第四天：
在转染后48h—72h内收获病毒，将培养基转移至15mL无菌离心管中，4℃，3000rpm 离心15min去除沉淀，建议用Millex-HV0.45μm的过滤器过滤含病毒的上清液。然后分装到 1.5mL的离心管中，如有需要则进行浓缩，储存在-80℃。
5）含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞的制备
①感染细胞
第一天：胰酶消化并计数A549和H157细胞，然后将它们接种在6孔板中，使其在第二 天感染时密度在30—60%之间，在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养过夜。
第二天：去掉A549和H157细胞中旧的培养基，加入1mL病毒悬液和1mL新的含5%血清的RPMI-1640培养基，并同时加入使其终浓度为6μg/mL，混匀；在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养过夜。
第三天：去掉含病毒的培养基，换上2mL新鲜的含血清的RPMI-1640培养基，在37℃， 5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养过夜。
②筛选
第四天：加入合适浓度的Blasticidin进行筛选（一般为5—10μg/mL）；每间隔3-4天，换 上含有Blasticidin的新鲜的RPMI-1640培养基；
在经过10—12天的筛选后，可见很多细胞集落，这些集落为Blasticidin抗性的，很有可 能是含有DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞。
接下来可以用有限稀释法对上述细胞进行进一步筛选：抗性集落消化下来后将其按每孔 1个细胞种在96孔板中，在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养；第二天寻找每孔中 只有一个细胞的孔，等细胞长满整个孔后，胰酶消化，传至大孔培养，并冻存，细胞分别命 名为A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc。
6）含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞的鉴定
将筛选得到的A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc细胞分别接种在24孔板中，第二天用 PS-341（100nmol/L）处理细胞，每组设3个平行。处理8h后，弃掉旧的细胞培养基，并用 PBS清洗一次，然后每孔加入200μL细胞培养裂解试剂；将细胞在4℃静置，裂解30min， 然后充分吹打细胞，将裂解后的细胞碎片和液体转移至0.5mL的离心管中，并在4℃的离心 机中，13200rpm下离心2min；然后取15μL的样品的上清液与10μL荧光素酶检测底物在荧 光光度计试管中混匀，使其反应；将盛混合物的试管放入荧光光度计中进行检测，记录数据 并求取平均值。经检测，在重组细胞中，PS-341处理组较空白组的荧光素酶活性有明显提高 （如图6），说明DR5的启动子活性增强，因此确定该细胞为含DR5启动子与荧光素酶报告 基因的融合基因的细胞，即为基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选的细胞。
7）基于TRAIL受体信号通路对抗肿瘤药物的筛选
上述筛选到的含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞与细胞培养裂解试 剂，荧光素酶检测底物共同构成本发明所述的系统。本系统在筛选抗肿瘤药物应用时包括如 下步骤：
①第一天，选择所构建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5-luc细胞以6×104个/孔细胞接 种于24孔板中，两种细胞都是用含5%血清的RPIM1640培养基培养，在37℃，5%CO2， 饱和湿度的培养箱中培养过夜；
②第二天，选取待筛选的化合物（待筛选的化合物可以是合成化合物、天然产物、有机 小分子、无机小分子、脂、糖类等等），根据化合物特性对其进行溶解（浓度一般为 1mM—10mM）。然后将溶解好的化合物原则按终浓度是0、5、10、15、20、25、30、35、40μM 的梯度浓度加入到步骤①中接种的细胞中，同时每种浓度设置3个平行孔，处理时间为 6—12h；随时观察细胞，如果发现细胞有大量死亡，可以降低该化合物的处理浓度。
本步骤待筛选的化合物以从天然植物中提取的化合物2’-羟基，4’,5’-二甲氧基査尓酮 （DHMC）和豆蔻明（Cardamonin）为例，它们的检测浓度经试验摸索都设定为0，10μM， 20μM，处理8h。
③待处理结束时，弃掉各孔中细胞培养基，用PBS清洗一次，然后每孔加入200μL1X 细胞裂解液，并保证裂解缓冲液完全覆盖细胞；
④将细胞在4℃静置，裂解30min，然后充分吹打细胞，将裂解后的细胞碎片和液体转 移至0.5mL的离心管中，并在4℃的离心机中，13200rpm下离心2min；
⑤然后取15μL的样品的上清液与10μL荧光素酶检测底物在荧光光度计试管中混匀， 使其反应；
⑥将⑤反应后的试管放入荧光光度计中进行检测，记录数据并求取平均值，根据检测的 数值判断该化合物是否有抗肿瘤活性。一般来说，当药物处理组的检测数值减去对照组（药 物浓度为零）的检测数值大于5000时，说明该药物能明显诱导DR5启动子的活化，即该药 物为潜在的抗肿瘤化合物。对于A549-pDR5-luc细胞，空白对照组数值一般为4000±500， 当药物处理组的数值大于9000时，我们认为该药物为潜在的抗肿瘤化合物；对于 H157-pDR5-luc细胞，空白对照组数值一般为8000±500，当药物处理组的数值大于13000时， 我们认为该药物为潜在的抗肿瘤化合物。
本实施例检测的DHMC，Cardamonin两种化合物作用于A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc 细胞时，荧光素酶的检测结果如图7所示，我们可以看到DHMC和Cardamonin处理明显提 高了荧光素酶的活性（DHMC和Cardamonin处理组都较空白组数值增加了5000以上），说 明DHMC和Cardamonin具有潜在的抗肿瘤活性。
进一步的，通过蛋白质免疫印迹等方法也验证DHMC可以诱导DR5依赖的细胞凋亡， 具有良好的抗肿瘤活性。此结果也证明本发明所述抗肿瘤药物筛选系统的可靠性和实用性。