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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310680770.0 (22)申请日 2013.12.13 CGMCC NO ： 7101 2013.01.18 C12N 1/12(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 中国热带农业科学院热带生物技 术研究所 地址 570000 海南省海口市龙华区城西学院 路 4 号 (72)发明人 张家明 谭德冠 付莉莉 孙雪飘 (74)专利代理机构 海口翔翔专利事务有限公司 46001 代理人 莫臻 (54) 发明名称 一种利用绿藻将纤维素转化为油脂的方法 (57) 。
2、摘要 本发明涉及一种利用绿藻将纤维素转化为 油脂的方法， 所述绿藻是从橡胶树分离出来的单 细胞绿藻， 被命名为海南橡藻 （Heveochlorella hainangensis） ， 已于 2013 年 1 月 18 日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏号 ： CGMCC NO ： 7101 ； 利用海南橡藻 （Heveochlorella hainangensis） 在含纤维素的 培养基中， 置于黑暗条件下培养， 诱导产生纤维素 酶， 降解纤维素， 获取碳源， 从而生长繁殖， 积累油 脂。 本发明所提供的海南橡藻具有可培养、 生长周 期短等特点， 有较强的降解纤维素。
3、的能力， 同时可 积累油脂， 为秸秆等纤维素质转化为生物能源提 供了新途径， 具有潜在的商业价值和重要的理论 实践意义。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 李娟娟 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 103667067 B 2016.05.04 CN 103667067 B 1.一种利用海南橡藻将纤维素转化为油脂的方法， 其特征在于： 将经平板活化的海南 橡藻藻种接种在200mL已灭菌的培养基中， 26黑暗条件下120r/min振荡预培养10d， 然后 以2接种浓度接种至30L已灭菌的培养基中， 26在暗条件下。
4、120r/min振荡或静止培养 10d， 收集藻细胞； 所述海南橡藻(Heveochlorellahainangensis)已于2013年1月18日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号： CGMCCNO： 7101,名称为： Heveochlorellahainangensis； 所述培养基的具体配方如下： NH4NO31650mgL-l、 KNO3 1900mgL-l、 KH2PO4170mgL-l、 CaCl22H2O440mgL-l、 MgSO47H2O370mgL-l、 FeSO47H2O 27.8mgL-l、 Na2EDTA37.3gL-l、 MnSO44H2。
5、O22.3mgL-l、 ZnSO47H2O8.6mgL-l、 H3BO36.2mgL -l、 KI0.83mgL-l、 Na2MoO42H2O0.25mgL-l、 CuSO45H2O0.025mgL-l、 CoCl26H2O 0.0025mgL-l、 肌醇100mgL-l、 甘氨酸2mgL-l、 盐酸硫胺素0.4mgL-l、 盐酸吡哆素0.5mgL-l、 烟酸 0.5mgL-l、 葡萄糖或者蔗糖30mgL-l以下、 羧甲基纤维素钠20-40gL-l， pH6.2。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103667067 B 2 一种利用绿藻将纤维素转化为油脂的方法 技术领域 0001 本发明属微。
6、生物领域， 具体的说， 涉及一种利用绿藻将纤维素转化为油脂的方法， 尤其涉及诱导绿藻纤维素酶基因表达， 降解纤维素， 合成油脂。 背景技术 0002 随着矿物能源消耗和生态环境问题的日益严重， 研究、 开发和利用可再生能源是 人类社会、 经济发展的大势所趋。 生物质能源作为可再生能源的重要组成部分， 越来越受到 世界各国的重视。 2007年， 我国发布 可再生能源中长期发展规划 ， 明确将生物质能源作为 我国可再生能源发展的重点领域， 力争到2020年生物质发电达到3000万千瓦， 沼气年利用 总量达到443亿立方米， 燃料乙醇的年生产能力达到1000万吨， 生物柴油的年生产能力达到 200万。
7、吨。 0003 然而， 实现上述目标并不是一件容易的事情。 由于发展生物燃料需要消耗一定量 的农作物， 在目前还没有大规模发展的今天， 生物燃料已经产生了与食物 “争地盘” 的矛盾， 使粮食和食用油的价格大幅上涨。 例如， 马来西亚和印度尼西亚一直是世界领先的棕榈油 生产国， 由于利用棕榈油生产生物柴油， 造成食用油价格大幅上涨。 美国虽然是粮食出口大 国， 近年由于发展生物乙醇， 其玉米期货价格在2007年上涨75%。 因此， 如何解决吃饱肚子和 发展生物能源的矛盾是各国决策者需要面对的难题。 0004 “吃饱肚子” 是人类和平发展的基本条件， 开发利用生物质能源是人类可持续发展 的科技支撑。
8、， 势在必行。 缓解二者之间矛盾的途径之一是开放利用包括农作物秸秆在内的 纤维素质生物质。 秸秆露天焚烧是我国农村 “顽疾” ， 产生的大量烟雾不仅污染空气， 还严重 影响能见度。 据统计， 我国每年产生秸秆7.2亿吨， 40%还田作肥料， 剩下的都一烧了之。 因 此， 秸秆是最具开发潜力的绿色可再生能源之一。 国内外对于纤维素质转化为生物质能源 的研究已开展了半个世纪。 然而， 主要研究集中在将纤维素转化为乙醇， 极少研究将纤维素 转化为油脂， 尤其没有利用绿藻将纤维素一步法转化为油脂的报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种利用绿藻将纤维素转化为油脂的方法。 0006 本发明所提。
9、供的绿藻， 是从橡胶树分离出来， 是目前唯一从橡胶树中分离的单细 胞绿藻， 被命名为海南橡藻 （Heveochlorellahainangensis） 。 该藻细胞呈圆球状， 直径 3.8-8.7 m， 与已知的绿藻在显微、 超显微结构以及DNA序列上存在显著差异， 分子系统进化 分析结果表明该藻为一新种， 代表一个新的属。 0007 海南橡藻 （Heveochlorellahainangensis） 已于2013年1月18日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号） ， 保藏号： CGMCCNO： 7101,名称为： Heveochlore。
10、llahainangensis。 0008 海南橡藻 （Heveochlorellahainangensis） 在含纤维素的培养基中， 置于黑暗条 件下培养， 诱导产生纤维素酶， 降解纤维素， 获取碳源， 从而生长繁殖， 积累油脂。 说明书 1/3 页 3 CN 103667067 B 3 0009 本发明所提供的海南橡藻 （Heveochlorellahainangensis） 具有可培养、 生长周 期短等特点， 有较强的降解纤维素的能力， 同时可积累油脂， 为秸秆等纤维素质转化为生物 能源提供了新途径， 具有潜在的商业价值和重要的理论实践意义。 附图说明 0010 图1为海南橡藻在含纤维素。
11、培养基上培养降解纤维素的显色图 （纤维素被降解后 形成退色的透明圈） ； 0011 A： 在光照条件下， 海南橡藻纤维素酶基因不表达， 不形成退色圈； 0012 B： 在黑暗条件下， 海南橡藻纤维素酶基因表达， 形成退色圈。 具体实施方式 0013 下面结合实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。 以下实施例用于 说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常 按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。 0014 实施例一、 刚果红显色法确认海南橡藻能在黑暗条件下降解纤维素 0015 所用培养基为纤维素MS刚果红培养基， 具体配方如下： NH4N。
12、O31650mgL-l、 KNO31900mgL-l、 KH2PO4170mgL-l、 CaCl22H2O440mgL-l、 MgSO47H2O370mgL-l、 FeSO4 7H2O27.8mgL-l、 Na2EDTA37.3gL-l、 MnSO44H2O22.3mgL-l、 ZnSO47H2O8.6mgL-l、 H3BO36.2mgL -l、 KI0.83mgL-l、 Na2MoO42H2O0.25mgL-l、 CuSO45H2O0.025mgL-l、 CoCl26H2O0.0025mgL-l、 肌醇100mgL-l、 甘氨酸2mgL-l、 盐酸硫胺素0.4mgL-l、 盐酸吡哆素0.5m。
13、gL-l、 烟酸0.5mgL-l、 蔗 糖10-30mgL-l、 羧甲基纤维素钠20gL-l、 刚果红200mgL-l、 琼脂粉9gL-l， pH=6.2。 0016 将继代培养的海南橡藻接种至培养基平板中央， 放置于黑暗条件26培养， 以光 照培养为对照。 培养4-10d， 在黑暗条件下培养的海南橡藻周围开始产生水解退色透明圈 （图1B） ， 光照条件下培养的不形成退色圈 （图1A） 。 形成水解退色圈的原理是， 刚果红能与培 养基中的纤维素形成红色复合物， 使培养基呈红色。 当纤维素被纤维素酶分解后， 刚果红 纤维素的复合物就无法形成， 因而培养基中出现以橡藻为中心的退色透明圈， 这表明橡。
14、藻 在暗条件下能产生纤维素酶。 0017 实施例二、 在含纤维素的液体培养基中培养海南橡藻 0018 所 用的 液体培养基为添 加梭甲 基纤维素的 M S培养基 ， 具体配方 如下 ： NH4NO31650mgL-l、 KNO31900mgL-l、 KH2PO4170mgL-l、 CaCl22H2O440mgL-l、 MgSO47H2O370mgL -l、 FeSO47H2O27.8mgL-l、 Na2EDTA37.3gL-l、 MnSO44H2O22.3mgL-l、 ZnSO47H2O8.6mgL-l、 H3BO36.2mgL-l、 KI0.83mgL-l、 Na2MoO42H2O0.25m。
15、gL-l、 CuSO45H2O0.025mgL-l、 CoCl2 6H2O0.0025mgL-l、 肌醇100mgL-l、 甘氨酸2mgL-l、 盐酸硫胺素0.4mgL-l、 盐酸吡哆素0.5mgL-l、 烟酸0.5mgL-l、 葡萄糖或者蔗糖30mgL-l以下、 羧甲基纤维素钠20-40gL-l， pH=6.2。 0019 将经平板活化的海南橡藻藻种接种在500mL三角瓶中 （含200mL上述已灭菌的培养 基） ， 26黑暗条件下120r/min振荡预培养10d， 然后以2%接种浓度接种至50L的发酵罐 （LP351， 瑞士比欧）（含30L上述已灭菌的培养基） ， 26在暗条件下120r/m。
16、in振荡或静止培 养10d， 收集藻细胞。 0020 油脂提取和含量测定： 说明书 2/3 页 4 CN 103667067 B 4 0021 用改良的酸水解法提取油脂。 具体方法是： 将实施例二中所收集到的藻细胞进行 冷冻干燥， 称取冷冻干燥后的藻粉1g， 置于50mL的带盖离心管， 加入4mL灭菌蒸馏水， 混匀后 加入5mL盐酸， 将离心管置于70-80水浴20min， 取出离心管， 加入5mL95%的乙醇， 混匀。 冷 却后加入10mL乙醚， 加盖振摇1min， 小心开盖， 放出气体。 4000r/min离心2min， 吸出上清液 于已恒重的锥形瓶内， 再加5mL乙醚于离心管中， 加盖振。
17、摇1min， 4000r/min离心2min萃取2 次， 将上清液吸出于原锥形瓶中。 将锥形瓶置于水浴锅上蒸干， 置于95-105烘箱中干燥 2h， 取出冷却后称重。 其中， 粗油重量=藻粉干重-提取后藻粉干重， 油脂含量%=粗油重量/藻 粉干重100。 试验重复5次。 结果见表1。 0022 表1海南橡藻油脂含量的测定 0023 由结果可知， 利用本发明提供的海南橡藻 （Heveochlorellahainangensis） 在黑暗条 件下， 分泌纤维素酶， 将纤维素降解为可利用糖类， 用于生长繁殖， 同时积累油脂。 通过检 测， 用该方法测得用纤维素培养基培养出的海南橡藻油脂含量平均为42%。 0024 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 103667067 B 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 103667067 B 6 。