技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及鉴定转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH3301及其衍生品系的检测方法及其所依赖的转化体特异序列。
背景技术
水稻是我国乃至世界最主要的粮食作物之一。水稻也是虫害发生较为严重的作物之一。我国水稻田间害虫有600多种上，其中分布广泛且为害较为严重的是二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫。据统计，每年我国由虫害造成的损失占水稻总产量的5％以上，高达一千万吨，每年用于水稻害虫防治的费用都在135亿元人民币以上。而在水稻品种及野生稻中没有抗鳞翅目害虫的种质资源可以利用。以转基因技术为核心的品种设计技术可以将远缘物种的抗性基因导入水稻中，从而使现有品种获得高抗虫特性。目前已经有多个转基因水稻品系获准进入环境释放和生产性试验。对转基因作物的有效监管是转基因作物安全利用的前提和保障。转基因作物外源序列插入片段旁侧序列是转基因植物品系的最重要的分子身份证。因此，依据外源插入片段的旁侧序列是建立转基因作物品系特异性检测方法的重要技术资料。
mfb-MH3301是福建省农业科学院生物技术研究所和中国科学院遗传与发育生物学研究所共同研发的抗二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟以及大螟的具有广泛应用前景的转基因水稻品系。利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种（品系）是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。
利用插入位点旁侧序列鉴定转基因品系，该方法已在鉴定克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号品系中建立。mfb-MH3301是最新研发的抗虫转基因水稻品系，尚无任何相关转基因水稻mfb-MH3301外源基因插入片段的旁侧序列文章报道和专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH3301的检测方法，属于生物技术领域，利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种（品系）是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述方法是转化体mfb-MH3301中外源基因Cry1Ab及其表达框在水稻染色体上插入片段及其旁侧特异序列SEQ ID NO:1及基于该序列建立的特异性PCR扩增鉴定技术。
所述旁侧序列为LB端旁侧序列，其LB端旁侧序列如SEQ ID NO:1所示。
依据LB端旁侧序列设计的特异性引物为：
正向引物G92：5’-GAGACATTAGTAGGCAGGAC-3’；
反向引物Bb3301-L1：5’-CGAGACATAACTGACAGAGGAGG-3’或
Bb3301-L2：5’-CTACTCTATCGTTGTTTTTGAC-3’或
Bb3301-L3：5’-TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。
所述特异性引物中一条引物为依据SEQ ID NO:1中1-500位序列设计的正向引物；另一条引物为依据SEQ ID NO:1中501-2000序列设计的三条反向引物中的任一条。
转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的外源插入片段的旁侧序列的PCR检测方法，所述PCR扩增条带中含有SEQ ID NO:1中的一段序列。
依赖于外源基因插入片段旁侧序列的转Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH3301的PCR检测方法，可依据LB旁侧序列检测1个插入在水稻9号染色体上的位置。上述1对引物可用于转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的定性PCR检测。
转基因水稻mfb-MH3301所用载体见图1，用于转化目的基因Cry1Ab和选择标记基因hpt分别位于不同的二个独立T-DNA区域，其中一个T-DNA区含有35S启动子和选择标记基因hpt；另一个T-DNA区含有2条核基质结合区MAR系列、Ubi启动子和目的基因Cry1Ab。
本发明采用常规方法提取转基因水稻mfb-MH3301 DNA，利用Tail-PCR方法扩增得到LB旁侧序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列包括水稻基因组序列，位于水稻第9号染色体（GeneBank ID: NC-008402.2 ）的7709771-7710270位，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中1-500位的核苷酸序列完全相同；该序列还包括了转化载体pCDMARUBb-Hyg的部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中501-2000位的核苷酸序列完全相同。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了转基因水稻mfb-MH3301外源基因插入位点的左边界旁侧序列，以及基于这段序列的转化事件特异检测方法，为转基因水稻mfb-MH3301品系及其衍生系提供了分子特征和特异的检测手段。
附图说明
图1：转化载体pCDMARUBb-Hyg的T-DNA区域结构示意图。
图2：mfb-MH3301 LB边界Tail-PCR扩增电泳图。I：Tail-PCR第一轮产物；II：Tail-PCR第二轮产物；III：Tail-PCR第三轮产物;M：λ-EcoT14 Marker。
图3：水稻mfb-MH3301外源基因插入旁侧序列定性PCR检测电泳图。1-3泳道：三条反向特异性引物Bb3301-L1、Bb3301-L2、Bb3301-L3分别与正向特异性引物G92组合对mfb-MH3301品系DNA特异性扩增，分别扩增出1260bp 1150bp 1034bp大小的特异性条带；M：DL2000 Marker。
图4：水稻mfb-MH3301外源基因插入旁侧序列特异性定性PCR检测电泳图，采用正向特异性引物G92与反向特异性引物Bb3301-L3组合对mfb-MH3301及非转基因对照闽恢3301进行的PCR鉴定，mfb-MH3301扩增出1034bp大小的特异性扩增条带，非转基因对照闽恢3301没有扩增出相应条带。泳道1：mfb-MH3301； 泳道2：闽恢3301； M：λ-EcoT14 Marker。
具体实施方式
实施例1.转基因水稻mfb-MH3301外源基因插入位点旁侧序列克隆
一、实验材料
1. 植物材料：转基因水稻mfb-MH3301
2. 试剂：
1) Taq DNA Ploymerase：天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司提供
2) PCR扩增引物：生工生物工程(Sangon)(上海)有限公司合成
3) 上样缓冲液：10×Loading Buffer，宝生物工程(TaKaRa)(大连)有限公司提供
4) Agarose：西班牙琼脂糖，BIOWEST公司提供
3. 实验仪器
1) 高速/冷冻高速离心机：Eppenddorf Centrifuge 5415D、Eppenddorf Centrifuge 5424、Eppenddorf Centrifuge 5804R
2) PCR仪：GeneAmp PCR System Perkin-Elmer 9600、GeneAmp PCR System2700、 BIO-RAD Dyad Disciple Thermal Cycler PTC-0221、Eppendorf Mastercycler pro S
3) 电泳仪系统：BIO-RAD PowerPac Basic电源、BIO-RAD PowerPac Universal电源、BIO-RAD sub-cell GT水平电泳槽、BIO-RAD Wide Mini-sub cell 水平电泳槽
4) 凝胶成像系统：Alpha Innotech FluorChem SP(荧光/化学光/可见光凝胶成像系统)
5) 移液器：Eppendorf Research可调量程移液器
二、实验方法
1.水稻DNA提取
1) 将2×CTAB溶液置于65℃水浴中预热。
2) 摘取新鲜的水稻叶片或冻存于-20℃的水稻叶片1-3cm，置于1.5mL EP管中，加入适量液氮，用洗净晾干的尖头玻璃棒研磨至粉末状。
3) 向EP管中中加入600μL 预热的2×CTAB溶液，混匀。
4) 将EP管置于65℃水浴中温育20分钟，期间颠倒1次。
5) 从水浴中取出EP管，加入等量氯仿：异戊醇（24:1），用力上下颠倒或涡旋混匀，至下层液相呈现深绿色。
6) 于室温条件静置10分钟，10,000rpm，离心10分钟。
7) 将上层水相上清液转移至新的1.5mL EP管中，加入2倍体积预冻的无水乙醇，轻轻颠倒混匀后置于－20℃冰箱沉淀30-60分钟。
8) 沉淀结束后，10,000rpm，离心10分钟，小心弃上清。
9) 加入1mL 75％乙醇，涡旋洗涤沉淀。
10) 5,000rpm, 离心3分钟，收集DNA，小心弃液体，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。
11) 室温自然干燥，或置于通风处吹干。
12) 加入ddH2O或TE(pH8.0)，充分溶解，置4℃备用。
2. 旁侧序列扩增
采用热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Tail-PCR）扩增与已知DNA序列邻接的未知旁侧序列。根据已知载体pCDMARUBb-Hyg序列，设计了3条左边界嵌套的特异引物Bb3301-L1、Bb3301-L2和Bb3301-L3依次与简并引物AD10组合进行三轮扩增。引物序列见表1。
表1.用于Tail-PCR和mfb-MH3301特异性鉴定的引物
Tail-PCR包括3个反应：第一轮反应（25μl）体系包含1×PCR buffer，100μmol/L dNTPs，0.5μmol/L R1,50μmol/L AD，1.0单位Taq DNA聚合酶，50-100ng DNA模板。第二轮(25μl)和第三轮(100μl)反应混合物分别含有0.5μmol/L R2、R3和其前一轮产物稀释物(50×)2μl、8μl，其它反应物同第一轮，具体反应体系见表2。
表2. Tail－PCR反应体系
3. PCR产物电泳及回收
用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收第三次扩增产物，用于序列测定，电泳图详见附图3。
4. PCR产物测序及分析
旁侧序列的测定及同源比较 第三次TailL-PCR扩增产物回收后测序，测序结果在Rice Genome Database of Chinese Super Hybrid Rice (http://btn.genomics.org.cn:8080/rice/index.php)和NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行blast比较序列的同源性。旁侧序列之间以及旁侧序列与载体骨架序列之间的比较使用Dnastar软件中MegAlign。结果显示T-DNA插入位置为水稻及因子中第9条染色体，（GeneBank ID: NC-008402.2 ）的7709771-7710270位。
实施例2 基于转基因水稻mfb-MH3301品系外源基因插入旁侧序列特异性PCR检测
一、实验材料
1.植物材料
1）转基因水稻品系mfb-MH3301
2）常规水稻：闽恢3301
2.试剂
1) Taq DNA Ploymerase：天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司提供
2) PCR扩增引物：生工生物工程(Sangon)(上海)有限公司合成
3) 上样缓冲液：10×Loading Buffer，宝生物工程(TaKaRa)(大连)有限公司提供
4) Agarose：西班牙琼脂糖，BIOWEST公司提供
3.实验仪器
1) 高速/冷冻高速离心机：Eppenddorf Centrifuge 5415D、Eppenddorf Centrifuge 5424、Eppenddorf Centrifuge 5804R
2) PCR仪：GeneAmp PCR System Perkin-Elmer 9600、GeneAmp PCR System2700、 BIO-RAD Dyad Disciple Thermal Cycler PTC-0221、Eppendorf Mastercycler pro S
3) 电泳仪系统：BIO-RAD PowerPac Basic电源、BIO-RAD PowerPac Universal电源、BIO-RAD sub-cell GT水平电泳槽、BIO-RAD Wide Mini-sub cell 水平电泳槽
4) 凝胶成像系统：Alpha Innotech FluorChem SP(荧光/化学光/可见光凝胶成像系统)
5) 移液器：Eppendorf Research可调量程移液器
二、实验方法
1. 植物基因组DNA提取及检测同实施例1中“水稻DNA提取”
2. 基于转基因水稻品系mfb-MH3301外源基因插入旁侧序列的PCR检测
根据实施例1中测定的LB端旁侧序列，分别在水稻基因组序列部分和转化载体部分设计引物，引物命名及具体序列详见表1.
3. 采用常规PCR方法扩增基因组DNA。以Bb3301-L3和G92为一对特异性引物，按表2所述PCR反应体系中“第三轮”反应体系，将退火温度改为56℃，扩增，扩增产物电泳检测。
4．扩增鉴定结果：
利用一对特异性引物Bb3301-L3和G92组合扩增转基因水稻品系mfb-MH3301和非转基因对照闽恢3301，在mfb-MH3301中可扩出一条1034bp扩增产物，而对照闽恢3301没有相应的扩增片段，见附图4。表明本发明的鉴定方法是可靠的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH3301的检测方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> LB端旁侧序列
<400> 1
taggcaagac gaaaactata tcattagagc tgggccaatc atatcccaaa caaggtctta 60
ttggcatata tagtcggaaa actatgtatt taaaagttca tgtgtcctat aacaaaacac 120
aaaagaaaat gcaaactctg atgtgtctaa ccagggagct ttttgatcaa ctcagagaca 180
ttagtaggca ggactgaatg atcatccaaa ctggagagta tgtatgctag aaagttcttc 240
cgcaactcct ttgtttccta acaagatgat gcatatacaa aattaatgac gataatatat 300
tgaatatgta ttccaatcaa aattaactct ccaggaatta tttcttacag ttgaaaacca 360
ccgaatcagt cgatgaccat cccataatcg cataaaattg aatacaaaga atccacagtc 420
acaactagaa ataaatcata gggaaaaatg agttgatcac ttatcatgca gtaaaacata 480
tacccataat aaagacggga gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt 540
aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc 600
tggattttag tactggattt tggttttagg aattagaaat tttattgata gaagtatttt 660
acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata 720
ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta ttatggagaa actcgacggt 780
atcgataagc ttgatccatg cctcacatgt taatgtacta ccaatggagg gcttccatgc 840
ctcacatgtt catgtacaca tttatgatta ggaaactttt taatatattt tatagatttc 900
ttatccatca tataaaaata cataattaat catacgattt tggagataca tattctgacg 960
tatcaaattc taattaaatt ttaaaatatt ttagtgacgt atcaaattct aattaaattt 1020
taaaatattt tagagacgta ttttcgtaac aatttaaaat gtatattata gatcacattc 1080
ataggtcatt ttataattta aaatattatg gagatgcatc ttcgtttatt ttacggagat 1140
atattttcgt aatttatcat aatagaattg ttcatgctat attttgttta tgtttgctca 1200
gatgaagatt taaaccttac aagcaatgtg caaaaaatga cgtacataaa tttagatggt 1260
ccaaaaatgt tataaataaa agatcaagaa gtgtcaaaaa aagtcaaaaa caacgataga 1320
gtagtataat gtcaaaataa aataaaatcc atgacactac tactattata tattaatgca 1380
ctaatgtgta tgtctaacta catcgcctct gcctcctctg tcagttatgt ctcgtaggcc 1440
atcaatcccc cgtcctccga cgttgtctcc ggtacatcaa tgtcccatgt gcctacgtca 1500
tgatggcatt taggacatgt ctcacatcag ccagatcagc aagatacatt tgtcaatgtc 1560
tatctacgca atctccacaa tgcgacgaca tataggcaag acatcctcaa cataatttag 1620
ttgtgcatgc ttctcctcta gtatctcccg atgagttgat cgaattaatt cctgcagccc 1680
ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1740
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 1800
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 1860
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gacatgatta 1920
cgaattcgag ctcggtaccc agcttctaga gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg 1980
ataatttatc ctagtttgcg 2000
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> G92
<400> 2
gagacattag taggcaggac 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Bb3301-L1
<400> 3
cgagacataa ctgacagagg agg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Bb3301-L2
<400> 4
ctactctatc gttgtttttg ac 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Bb3301-L3
<400> 5
tcttcatctg agcaaacata aac 23
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> AD10
<400> 6
xgtgnagxgt gnag 14