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1、(10)申请公布号 CN 103667154 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667154 A (21)申请号 201310715390.6 (22)申请日 2013.12.20 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮族自治区南宁市西乡塘 区友爱北路 51 号 (72)发明人 陶立 李军 闭炳芬 黄明学 韦志锋 潘艳 秦若甫 蓝金红 兰美益 陈泽祥 杨威 李常挺 梁保新 彭昊 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务所有 限责任公司 45104 代理人 杨立华 。
2、(54) 发明名称 支原体培养基及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种支原体培养基， 包括基础 培养液， 基础培养液主要由猪肺消化汤、 1% 水解 乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液组成。 试 验证明， 用猪肺消化汤取代牛心汤制作支原体培 养基进行支原体培养增殖快、 浓度高、 效果切确， 还可使支原体培养时动物血清的用量降低 50% 左 右， 这使人工大规模培养支原体成为可能。 本发明 原料猪肺脏市场量大、 材料易得、 价格低廉， 因此， 应用本发明可大幅降低动物支原体培养成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 。
3、(12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103667154 A CN 103667154 A 1/1 页 2 1. 一种支原体培养基， 包括基础培养液， 其特征在于 ： 所述基础培养液主要由猪肺消 化汤、 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母浸出液组成。 2. 根据权利要求 1 所述的支原体培养基， 其特征在于 ： 所述基础培养液由猪肺消化汤、 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母浸出液按体积百分数 48%、 50%、 2% 组成。 3. 根据权利要求 2 所述的支原体培养基， 其特征在于还包括动物血清。 4. 根据权利要。
4、求 3 所述的支原体培养基， 其特征在于 ： 每 90 95ml 基础培养液中加 入 5 10ml 无菌的动物血清。 5. 根据权利要求 4 所述的支原体培养基， 其特征在于 ： 所述动物血清为马血清或小牛 血清。 6. 根据权利要求 1 所述支原体培养基的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 胰腺提取液的制备 取经检疫合格猪的新鲜胰脏， 去除脂肪组织， 切碎 ； 500g 胰脏加入 1500ml ddH2O 和 500ml 无水乙醇， 室温振荡， 100rpm ； 72h 后用滤纸过滤即得 ； 猪肺消化汤的制备 取经检疫合格猪的新鲜猪肺， 去除气管和淋巴结缔组织， 切碎， 1500g 猪肺。
5、加入 2000ml ddH2O， 搅拌加热至80， 再加入质量浓度0.8%的无水NaHCO32500ml， 混匀后冷至45， 加入 胰腺提取液 500ml、 氯仿 50ml， 混匀置 37 6 7h， 之后加浓硫酸 40ml， 100蒸汽加热 1h， 纱布过滤， 用 1mol/L NaOH 溶液调 pH 至 8， 100蒸汽加热 1h， 趁热滤纸过滤， 调节 pH 值至 7.6， 121高压灭菌 20min， 冷却即得 ； 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液的制备 配制原液甲 ： NaCl68.0g， KCl4.0g， NaH2PO42H2O1.4g， 葡萄糖 20.0g， 将以上各成分溶 解。
6、于 500ml 水中， 即得 ； 配制原液乙 ： NaCl2.0g， MgCl26H2O1.7g， 0.4% 酚红液 50ml， 将以上各成分溶解于 500ml 水中， 即得 ； 配制 Earle 液 ： 原液甲 1 份， 原液乙 1 份， 水 18 份， 混合均匀即得 ； 将水解乳蛋白胨和 Earle 液按质量体积比 1:100 混合完全溶解， 装瓶， 115高压灭菌 20min， 冷却即得 ； 25% 新鲜酵母浸出液的制备 将 250g 干面包酵母或啤酒酵母置于 1L 的 ddH2O 中， 浸泡 1h 后加热至沸腾、 冷却， 3000r/min 离心 20min， 取上清液， 用 1mol。
7、/L NaOH 溶液调节 pH 至 8， 滤纸初滤后， 0.22l 滤膜过滤除菌， 即得 ； 将步骤 至 获得的猪肺消化汤、 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母浸出 液按体积百分数 48%、 50%、 2% 在无菌条件下混合， 即得基础培养液。 7. 根据权利要求 6 所述的支原体培养基的制备方法， 其特征在于还包括以下步骤 ： 培养基的完善 在无菌状态下， 每 90 95ml 基础培养液中加入 5 10ml 无菌的动物血清， 混匀， 将培 养基分装到试管中， 每支试管 10ml， -20保存。 权 利 要 求 书 CN 103667154 A 2 1/5 页 3 支原体培。
8、养基及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于农业微生物技术领域， 尤其涉及一种支原体培养基及其制备方法。 背景技术 0002 支原体 （Mycoplasma） 是一类无细胞壁、 介于病毒和细菌间的原核微生物， 能引起 人和动物的多种疾病， 危害极大。该菌 DNA 分子量比细菌少， 生物合成能力较弱， 对培养基 营养要求较高， 生长除依赖基础营养外， 尚需牛心浸液、 酵母膏、 辅酶、 氨基酸等， 需要甾 醇的支原体， 还要加入 10% 20% 的动物血清。 0003 目前， 支原体分离培养常用培养基 Hartleys、 PPLO、 Hayflick， 或其他改良的培养 基， 它们都是以牛心汤。
9、为基础配制而成的， 此类培养基成本高， 培养时间长、 效率低， 不利于 支原体的大量培养， 制约了疫苗生产。因此， 研究和探求一种材料易得、 价格低廉的支原体 培养基变得十分迫切。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种材料易得、 价格低廉、 培养效果好的支原体 培养基及其制备方法， 以降低支原体的培养成本， 便于实现人工大规模培养支原体。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案 ： 支原体培养基， 包括基础培养 液， 基础培养液主要由猪肺消化汤、 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母浸出液组成。 0006 基础培养液由猪肺消化汤、 1% 水解乳。
10、蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母浸出液按体 积百分数 48%、 50%、 2% 组成。 0007 上述支原体培养基， 还包括动物血清。 0008 每 90 95ml 基础培养液中加入 5 10ml 无菌的动物血清。 0009 动物血清为马血清或小牛血清。 0010 上述支原体培养基的制备方法， 包括以下步骤 ： 0011 胰腺提取液的制备 0012 取经检疫合格猪的新鲜胰脏， 去除脂肪组织， 切碎 ； 500g胰脏加入1500ml ddH2O和 500ml 无水乙醇， 室温振荡， 100rpm ； 72h 后用滤纸过滤即得 ； 0013 猪肺消化汤的制备 0014 取经检疫合格猪的新。
11、鲜猪肺， 去除气管和淋巴结缔组织， 切碎， 1500g 猪肺加入 2000ml ddH2O， 搅拌加热至 80， 再加入质量浓度 0.8% 的无水 NaHCO32500ml， 混匀后冷至 45， 加入胰腺提取液 500ml、 氯仿 50ml， 混匀置 37 6 7h， 之后加浓硫酸 40ml， 100蒸 汽加热 1h， 纱布过滤， 用 1mol/L NaOH 溶液调 pH 至 8， 100蒸汽加热 1h， 趁热滤纸过滤， 调 节 pH 值至 7.6， 121高压灭菌 20min， 冷却即得 ； 0015 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液的制备 0016 配制原液甲 ： NaCl68.0g， 。
12、KCl4.0g， NaH2PO42H2O1.4g， 葡萄糖 20.0g， 将以上各成 分溶解于 500ml 水中， 即得 ； 说 明 书 CN 103667154 A 3 2/5 页 4 0017 配制原液乙 ： NaCl2.0g， MgCl26H2O1.7g， 0.4% 酚红液 50ml， 将以上各成分溶解于 500ml 水中， 即得 ； 0018 配制 Earle 液 ： 原液甲 1 份， 原液乙 1 份， 水 18 份， 混合均匀即得 ； 0019 将水解乳蛋白胨和 Earle 液按质量体积比 1:100 混合完全溶解， 装瓶， 115高压 灭菌 20min， 冷却即得 ； 0020 2。
13、5% 新鲜酵母浸出液的制备 0021 将 250g 干面包酵母或啤酒酵母置于 1L 的 ddH2O 中， 浸泡 1h 后加热至沸腾、 冷却， 3000r/min 离心 20min， 取上清液， 用 1mol/L NaOH 溶液调节 pH 至 8， 滤纸初滤后， 0.22l 滤膜过滤除菌， 即得 ； 0022 将步骤 至 获得的猪肺消化汤、 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母 浸出液按体积百分数 48%、 50%、 2% 在无菌条件下混合， 即得基础培养液。 0023 上述支原体培养基的制备方法， 还包括以下步骤 ： 0024 培养基的完善 0025 根据不同支原体的培养特性。
14、， 在无菌状态下， 每 90 95ml 基础培养液中加入 5 10ml 无菌的动物血清 （马血清、 小牛血清或其他动物血清） ， 混匀， 将培养基分装到试管中， 每支试管 10ml， -20保存。 0026 发明人近年来对牛、 羊和猪等动物疾病的研究发现， 由支原体引起的动物肺炎的 病例很常见， 据此推测肺脏组织中的某些成分可能更适应支原体的快速生长繁殖。 由此， 发 明人用猪肺消化汤取代牛心汤制作支原体培养基， 试验证明以该培养基进行支原体培养增 殖快、 浓度高、 效果切确， 还可使支原体培养时动物血清的用量降低 50% 左右， 这使人工大 规模培养支原体成为可能。 本发明原料猪肺脏市场量大。
15、、 材料易得、 价格低廉， 因此， 应用本 发明可大幅降低动物支原体培养成本。 具体实施方式 0027 实施例 1 制备基础培养液 0028 胰腺提取液的制备 0029 取经检疫合格猪的新鲜胰脏， 去除脂肪组织， 切碎 ； 500g胰脏加入1500ml ddH2O和 500ml 无水乙醇， 室温振荡， 100rpm ； 72h 后用滤纸过滤即得 ； 0030 猪肺消化汤的制备 0031 取经检疫合格猪的新鲜猪肺， 去除气管和淋巴结缔组织， 切碎， 1500g 猪肺加入 2000ml ddH2O， 搅拌加热至 80， 再加入质量浓度 0.8% 的无水 NaHCO32500ml， 混匀后冷至 45。
16、， 加入胰腺提取液 500ml、 氯仿 50ml， 混匀置 37 6 7h， 之后加浓硫酸 40ml， 100蒸 汽加热 1h， 纱布过滤， 用 1mol/L NaOH 溶液调 pH 至 8， 100蒸汽加热 1h， 趁热滤纸过滤， 调 节 pH 值至 7.6， 121高压灭菌 20min， 冷却即得 ； 0032 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液的制备 0033 配制原液甲 ： NaCl68.0g， KCl4.0g， NaH2PO42H2O1.4g， 葡萄糖 20.0g， 将以上各成 分溶解于 500ml 水中， 即得 ； 0034 配制原液乙 ： NaCl2.0g， MgCl26H2O1。
17、.7g， 0.4% 酚红液 50ml， 将以上各成分溶解于 500ml 水中， 即得 ； 说 明 书 CN 103667154 A 4 3/5 页 5 0035 配制 Earle 液 ： 原液甲 1 份， 原液乙 1 份， 水 18 份， 混合均匀即得 ； 0036 将水解乳蛋白胨和 Earle 液按质量体积比 （w/v） 1:100 混合完全溶解， 装瓶， 115 高压灭菌 20min， 冷却即得 ； 0037 25% 新鲜酵母浸出液的制备 0038 将 250g 干面包酵母或啤酒酵母置于 1L 的 ddH2O 中， 浸泡 1h 后加热至沸腾、 冷却， 3000r/min 离心 20min，。
18、 取上清液， 用 1mol/L NaOH 溶液调节 pH 至 8， 滤纸初滤后， 0.22l 滤膜过滤除菌， 即得 ； 0039 将步骤 至 获得的猪肺消化汤、 1% 水解乳蛋白胨 Earle 液和 25% 新鲜酵母 浸出液按体积百分数 48%、 50%、 2% 在无菌条件下混合， 即得基础培养液。 0040 实施例 2 含 5% 马血清猪肺消化汤支原体培养基 0041 取实施例 1 的基础培养液， 在无菌状态下， 每 95ml 基础培养液中加入 5ml 无菌的 马血清， 混匀， 将培养基分装到试管中， 每支试管 10ml， -20保存备用。 0042 实施例 3 含 10% 马血清猪肺消化汤。
19、支原体培养基 0043 取实施例 1 的基础培养液， 在无菌状态下， 每 90ml 基础培养液中加入 10ml 无菌的 马血清， 混匀， 将培养基分装到试管中， 每支试管 10ml， -20保存备用。 0044 实施例 4 牛支原体在三种培养基中培养效果的比较 0045 1、 材料 0046 E、 含 5% 马血清猪肺消化汤支原体培养基 （实施例 2） 。 0047 F、 含 10% 马血清猪肺消化汤支原体培养基 （实施例 3） 。 0048 G、 含 10% 马血清 PPLO 汤支原体培养基。 0049 菌株 ： 牛支原体广西分离株 gx1 株， 由广西兽医研究所细菌研究室分离鉴定。 005。
20、0 2、 方法 0051 1） 菌种的复苏将在 -70冻存的牛支原体广西分离株 gx1 种子移入 10ml 含 10% 马血清 PPLO 汤培养中复苏， 复苏后按 10%（v/v） 比的接种量传代 3 5 代， 待生长稳定后 将其在 5%CO2 环境中培养了 48h 的培养物作为接种用菌种。 0052 2） 三种培养基接种培养取第 1） 步 48h 的牛支原体培养物作为接种用菌种， 同样 按 10%（v/v） 的接种量接种到 E、 F、 G 三种培养基中， 每种培养基接种 3 管， 作为待测菌液置 37含 5%CO2 环境中培养， 每间隔 24h 取样待检。 0053 3） 活菌计数每间隔 2。
21、4h 从待测菌液中取样， 每个时间点、 每种培养基均取样 3 份， 每份 0.2ml。用含 10% 马血清 PPLO 汤作 10 倍梯度的倍比稀释法进行计数， 将稀释好的试 管置于 37恒温箱中培养， 以未接种菌液的培养基为阴性对照， 每天观察试管颜色的变化， 连续计数 4d。以培养基由红色变为黄色时的最高稀释度作为待测菌液的颜色改变单位 (colorchangeimit， ccu)， 也就是支原体的最大代谢活力， 则菌液浓度以 ccu/ml 计。3 份样 品的平均滴度即为该时间点牛支原体最大生长滴度。 0054 3、 结果 0055 表 1 牛支原体在三种培养基中培养效果 0056 说 明 。
22、书 CN 103667154 A 5 4/5 页 6 0057 从表 1 可以看出 F 培养基的培养效果最好， 在相同培养时间点生长滴度最大， 在 48h 生长滴度可达到 71011ccu/ml， 72h 生长滴度可达到最大值 11012ccu/ml。E 和 G 培 养基牛支原体生长滴度最大值相同， 都达到了41011ccu/ml， 但E培养基比G培养基提前了 24h 达到了相同的效果， 说明牛支原体更适合在肺消化汤中生长， 而且也使动物马血清的用 量降低了 50%， 从而大幅降低了培养基的成本。 0058 实施例 5 绵羊肺炎支原体在三种培养基中培养效果的比较 0059 1、 材料 0060。
23、 E、 含 5% 马血清猪肺消化汤支原体培养基 （实施例 2） 。 0061 F、 含 10% 马血清猪肺消化汤支原体培养基 （实施例 3） 。 0062 H、 含 20% 马血清 PPLO 汤支原体培养基。 0063 菌株 ： 绵羊肺炎支原体广西马山分离株 gm 株， 由广西兽医研究所细菌研究室分离 鉴定。 0064 2、 方法 0065 1） 菌种的复苏将在 -70冻存的绵羊肺炎支原体广西马山分离株 （gm 株） 种子移 入 10ml 含 20% 马血清 PPLO 汤培养中复苏， 复苏后按 5%（v/v） 比的接种量传代 3 5 代， 待生长稳定后将其在含 5%CO2 环境中培养了 3d 。
24、的培养物作为接种用菌种。 0066 2） 三种培养基接种培养取第 1） 步 3d 的绵羊肺炎支原体培养物作为接种用菌种， 同样按 10%（v/v） 的接种量接种到 E、 F、 H 三种培养基中， 每种培养基接种 3 管， 作为待测菌 液置 37含 5%CO2 环境中培养， 48h 后开始取样， 后每间隔 24h 取样待检。 0067 3） 活菌计数每间隔 24h 从待测菌液中取样， 每个时间点、 每种培养基均取样 3 份， 每份 0.2ml。用含 20% 马血清 PPLO 汤作 10 倍梯度的倍比稀释法进行计数， 将稀释好的试管 置于 37恒温箱中培养， 以未接种菌液的培养基为阴性对照， 连续。
25、计数 3d， 后每天观察试 管颜色的变化， 直至无试管颜色发生变化为止， 以最后一个变色的试管稀释度即为待测菌 液的生长滴度， 用颜色变化单位 （ccu） 表示， 3 份样品的平均滴度即为该时间点绵羊肺炎支 原体最大生长滴度。 0068 3、 结果 0069 表 2 绵羊肺炎支原体在三种培养基中培养效果 0070 说 明 书 CN 103667154 A 6 5/5 页 7 0071 从表 2 可以看出 E、 F 培养基在 48h 取样点时绵羊肺炎支原体生长的滴度要好于 H 培养基， 说明绵羊肺炎支原体在猪肺汤中适应期短， 生长起动快， 增殖迅速。但随着培养时 间的延长 H、 F 培养基的培养效果要好于 E 培养基， 这可能与培养基中血清含量有关， H 培养 基和 F 培养基的培养效果相当， 但 F 培养基马血清用量较 H 培养基降低了 50%， 从而也大幅 降低了培养基的成本。 说 明 书 CN 103667154 A 7 。