一种采用组合抑菌剂从天然水域中快速分离异养微藻的方法.pdf

本发明公开了一种采用组合抑菌剂从天然水域中快速分离纯化异养微藻的方法。其特点是该方法包括以下步骤：a)配制微藻自养液体培养基；b)配制微藻固体异养培养基(在微藻自养液体培养基中加入1％葡萄糖及1.5-2％琼脂)；c)制备含组合抑菌剂(20-60μg/mL氨苄青霉素，200-600μg/mL纳他霉素)的培养基平板；d)将天然水样或经过增殖培养的水样涂布于含组合抑菌剂的培养基平板，于温度25-35℃的恒温培养箱中培养；e)待平板上长出有色藻落后，用接种环挑取到空白的含组合抑菌剂的培养基平板上划线，然后于25-35℃恒温培养箱中培养；f)重复步骤e)3-5次，即可获得纯化的可异养培养的微藻。本发明具有操作简便、快速、可靠，能在较短时间内从天然水域中分离纯化出可异养培养微藻的优点。

1.  一种从天然水域中快速分离可异养培养微藻的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)配制微藻自养液体培养基：将配制好的液体培养基装入三角瓶中，加硅胶塞，在温度121℃灭菌15-20min，冷却备用；
(2)配制微藻固体异养培养基：在微藻自养液体培养基中加入1％葡萄糖及1.5-2％琼脂，在水浴中加热搅拌煮沸，装入三角瓶中，加硅胶塞，在温度121℃灭菌15～20min，冷却备用；
(3)含组合抑菌剂的培养基平板制备，将微藻固体异养培养基加热融化后冷却至50-60℃，加入20-60μg/mL的氨苄青霉素和200-600μg/mL的纳他霉素，混匀后倒平板；
(4)取天然水样：如水样中微藻数量较多，直接进入步骤(5)；如水样中微藻数量较少，则将水样高速离心，转速≥3000rpm，时间≥15min，弃去上清液，重复离心并弃去上清液3-5次，加入微藻自养液体培养基，自然光照增殖培养一周左右；
(5)将水样或经过步骤(4)增殖培养的培养液均匀涂布于含组合抑菌剂的培养基平板，于温度25-35℃恒温培养箱中倒置培养；
(6)待平板上长出有色藻落后，用接种环挑取到空白的含组合抑菌剂的培养基平板上划线，然后于恒温培养箱中倒置培养2-3天；
(7)重复步骤(6)3-5次，获得纯化的可异养培养的微藻。

一种采用组合抑菌剂从天然水域中快速分离异养微藻的方法
技术领域
本发明涉及一种采用组合抑菌剂从天然水域中快速分离异养微藻的方法，属于微藻生物技术领域。
背景技术
微藻富含蛋白质、脂肪、EPA、DHA等多种功能活性物质，具有重要的经济价值。开发利用微藻已成为人类获得食品、药品、生物燃料等的新途径。微藻属于低等植物，主要是利用光合作用转化无机碳源而进行生长。传统的开放光合自养方式存在光照限制、易污染和占地面积大等问题，因而生产效率不高。研究表明，某些单细胞微藻(如小球藻)可在无光照条件下利用有机碳源进行异养生长，其生物量及生产效率均得到大幅度提高，这为微藻的高效规模化生产提供了可能。
从自然界筛选异养微藻，是为工业生产提供高效藻株，以及进一步深入研究微藻异养生长的机制的需要。到目前为止，常用的微藻纯化方法主要是在光照自养或混养条件下，采用物理方法如涂布、划线、毛细吸管等方法。对于异养藻株筛选来说，这些研究的主要不足之处在于；(1)主要依赖于光照自养培养的反复分离纯化，周期长，设备要求较高(一般需要光照培养装置)；(2)分离的藻株缺乏针对性，大多数藻株不能在异养条件下生长；(3)藻种的无菌化效率较低，在多次传代培养、尤其是异养培养之后易污染杂菌；(4)目前采用抗生素的微藻无菌化方法主要针对细菌，然而在我们的研究中发现，对于异养藻种的筛选来说，克服霉菌污染是一个更为困难的问题。
通过对国内专利和文献检索，还未见关于从天然水域中直接分离纯化异养微藻方法的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种采用组合抑菌剂从天然水域中快速地分离异养微藻的方法。
本发明的目的由以下技术措施实现
采用组合抑菌剂从天然水域中快速分离异养微藻的方法包括以下步骤：
(1)配制微藻自养液体培养基(如水生4号培养基、Basal培养基或Kuhl培养基等)；将配制好的液体培养基装入三角瓶中，加硅胶塞，在温度121℃灭菌15-20min，冷却备用。
(2)配制微藻固体异养培养基：在微藻自养液体培养基中加入1％葡萄糖及1.5-2％琼脂，在水浴中加热搅拌煮沸，装入三角瓶中，加硅胶塞，在温度121℃灭菌15～20min，冷却备用；
(3)含组合抑菌剂的培养基平板制备：将微藻固体异养培养基加热融化，冷却至50-60℃，加入20-60μg/mL的氨苄青霉素和200-600μg/mL的纳他霉素，混匀后倒平板；
(4)取天然水样：如水样中的微藻数量较多，直接进入步骤(5)；如水样中微藻数量较少，则将水样高速离心(转速≥3000rpm，时间≥15min)，弃去上清液，重复离心并弃去上清液3-5次，加入微藻自养液体培养基，自然光照增殖培养一周左右；
(5)将水样或经过步骤(4)增殖培养的培养液均匀涂布于含组合抑菌剂的培养基平板，然后于恒温培养箱中倒置培养；
(6)待平板上长出有色藻落后，用接种环挑取到空白的含组合抑菌剂的培养基平板上划线，于温度25-35℃恒温培养箱中倒置培养2-3天；
(7)重复步骤(6)3-5次，获得纯化的可异养培养的微藻。
本发明具有如下优点：
1.不依赖于光照自养培养的反复分离纯化，周期短，操作简单，设备要求低，不需要光照培养装置。
2.分离藻株具有明确的针对性，可确保分离到的藻株能在异养培养条件下生长。
3.藻种的无菌化效率高，在多次异养传代培养之后不易污染杂菌。
4.能够有效克服异养藻种筛选过程中的霉菌污染问题。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
(1)配制Basal液体培养基(1000mL)：KNO₃ 1.25g，KH₂PO₄ 1.25g，MgSO₄ 1g，A液100mL，B液10mL。其中A液配方(1000mL)：H₃BO₃ 1.142g，CaCl₂·2H₂O 1.11g，ZnSO₄·7H₂O 0.882g，MnCl₂·4H₂O 0.142g，CuSO₄·5H₂O 0.157g，MoO₃ 0.071g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.049g，EDTA 4g；B液配方(100mL)：FeSO₄·7H₂O 0.498g，EDTA1g。用5％的NaOH将培养基的pH调为6.1。在500mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal培养基，将瓶口用硅胶塞封闭后在温度121℃灭菌15min，冷却备用。
(2)配制异养Basal固体培养基：在Basal液体培养基中加入1％的葡萄糖和1.5％的琼脂，在水浴中加热搅拌煮沸，稍冷却后，用5％的NaOH将培养基的pH调为6.1，将调好pH的培养基放入三角瓶，将瓶口用硅胶塞封闭后在温度121℃灭菌15min，冷却备用。
(3)抑菌剂平板制备：将异养Basal固体培养基加热融化后冷却至50℃，加入40μg/mL的氨苄青霉素和400μg/mL的纳他霉素，迅速混匀后倒平板。
(4)将含有微藻的成都府南河水样，经离心机离心(3000rpm，15min)后倒去上清液，重复3次后，摇匀离心管底部的藻细胞溶液悬浮，并将此溶液(约共有50mL)移入装有50mL灭菌Basal液体培养基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培养一周。
(5)将增殖培养的培养液均匀涂布于含组合抑菌剂的培养基平板，然后于28℃恒温培养箱中倒置培养。
(6)待平板上长出绿色藻落后，用接种环挑取到空白的含组合抑菌剂的培养基平板上划线，然后于温度28℃恒温培养箱中倒置培养2天。
(7)重复步骤(6)3次，获得纯化的可异养培养的绿藻(初步鉴定为小球藻)。
该藻株可在含葡萄糖的液体或固体Basal培养基上生长。
实施例2
(1)配制水生4号液体培养基(1000mL)：(NH₄)₂SO₄ 0.2g，过磷酸钙Ca(H₂PO₄)·H₂O+2(CaSO₄·H₂O)0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.08g，NaHCO₃ 0.10g，KCl 0.025g，FeCl₃(1％溶液)0.15mL，土壤浸出液0.5mL；用5％NaOH将pH调为6.1。在500mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal培养基，将瓶口用硅胶塞封闭后在温度121℃灭菌15min，冷却备用。
(2)配制异养水生4号固体培养基：在水生4号液体培养基中加入1％的葡萄糖和1.5％的琼脂，在水浴中加热搅拌煮沸，稍冷却后，用5％的NaOH将培养基的pH调为6.1，将调好pH的培养基放入三角瓶，将瓶口用硅胶塞封闭后在温度121℃灭菌15min，冷却备用。
(3)抑菌剂平板制备：将异养水生4号固体培养基加热融化后冷却至50℃，加入60μg/mL的氨苄青霉素和600μg/mL的纳他霉素，迅速混匀后倒平板。
(4)将含有微藻的成都江安河水样，经离心机离心(3000rpm，15min)后倒去上清液，重复3次后，摇匀离心管底部的藻细胞溶液悬浮，并将此溶液(约共有50mL)移入装有50mL灭菌Basal液体培养基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培养一周。
(5)将增殖培养的培养液均匀涂布于含组合抑菌剂的培养基平板，然后于35℃恒温培养箱中倒置培养。
(6)待平板上长出绿色藻落后，用接种环挑取到空白的含组合抑菌剂的培养基平板上划线，然后于温度35℃恒温培养箱中倒置培养3天。
(7)重复步骤(6)5次，获得纯化的可异养培养的绿藻。该藻株可在含葡萄糖的液体或固体水生4号培养基上生长。
实施例3
(1)配制Basal液体培养基(1000mL)：KNO₃ 1.25g，KH₂PO₄ 1.25g，MgSO₄ 1g，A液100mL，B液10mL。其中A液配方(1000mL)：H₃BO₃ 1.142g，CaCl₂·2H₂O 1.11g，ZnSO₄·7H₂O 0.882g，MnCl₂·4H₂O 0.142g，CuSO₄·5H₂O 0.157g，MoO₃ 0.071g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.049g，EDTA 4g；B液配方(100mL)：FeSO₄·7H₂O 0.498g，EDTA1g。用5％的NaOH将培养基的pH调为6.1。在500mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal培养基，将瓶口用硅胶塞封闭后在121℃灭菌15min，冷却备用。
(2)配制异养Basal固体培养基：在Basal液体培养基中加入1％的葡萄糖和2％的琼脂，在水浴中加热搅拌煮沸，稍冷却后，用5％的NaOH将培养基的pH调为6.1，将调好pH的培养基放入三角瓶，将瓶口用硅胶塞封闭后在温度121℃灭菌15min，冷却备用。
(3)抑菌剂平板制备：将异养Basal固体培养基加热融化后冷却至50℃，加入20μg/mL的氨苄青霉素和200μg/mL的纳他霉素，迅速混匀后倒平板。
(4)将含有微藻的成都府南河水样，经离心机离心(3000rpm，15min)后倒去上清液，重复3次后，摇匀离心管底部的藻细胞溶液悬浮，并将此溶液(约共有50mL)移入装有50mL灭菌Basal液体培养基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培养一周。
(5)将增殖培养的培养液均匀涂布于含组合抑菌剂的培养基平板，然后于25℃恒温培养箱中倒置培养。
(6)待平板上长出红色藻落后，用接种环挑取到空白的含组合抑菌剂的培养基平板上划线，然后于温度25℃恒温培养箱中倒置培养3天。
重复步骤(6)4次，获得纯化的可异养培养的红球藻。该藻株可在含葡萄糖的液体或固体Basal培养基上生长。