技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定蛋白制品中残留杂蛋白的抗体和检测方法。
背景技术
宿主蛋白(HCPs)(残留杂蛋白)是重组蛋白质药物的一个主要杂质成分，是生物制品的重要安全隐患，过多的HCPs可能会引起免疫等一系列不良反应，但即使在最严格的纯化工艺和质量控制下进行生产，微量的HCPs残留也不可避免。有时即使痕量的残留宿主杂蛋白就有可能引起剧烈的免疫反应，而且其潜在的“佐剂效应”也可能会引起机体对药物产生抗体，进而影响药物的疗效。对残留杂蛋白的质量控制是生物安全性评估的重中之重。因此，在工艺开发中，应尽量去除这些宿主残留蛋白，同时建立快速、准确且灵敏的HCPs检测方法。
宿主残留杂蛋白的鉴定与检测一直是重组蛋白药物发展过程中的一个重大难题，特别是对于极高纯度的样品，以往的研究大部分都是针对前期工艺的研究，为工艺发展提供必要的帮助，而对最终样品的检测分析往往显得无力，往往只能鉴定一个或几个高浓度的宿主残留杂蛋白。在残留杂蛋白鉴定的过程中，首先要考虑的就是如何有效减少目的蛋白的干扰，达到浓缩这些痕迹量的宿主残留蛋白，以达到质谱的检测范围内。同时，在宿主残留杂蛋白检测技术中，痕迹量的目的蛋白会严重干扰和影响检测的精度，因此如何从基因工程的蛋白制品制备具有专一性的抗体是建立稿精度检测宿主残留杂蛋白的关键。
在制备重组蛋白的质量控制中，如何从表达重组蛋白的提取液中分离制备没有与目的蛋白交叉反应的宿主残留杂蛋白是建立检测重组蛋白提取物的残留杂蛋白检测方法的关键，尤其是如何彻底地去除目的蛋白是一个非常棘手的技术难题，也是建立高精度的宿主残留杂蛋白检测方法的关键因素；目前国际上采用宿主残留杂蛋白的检测方法由于宿主细胞高效表达重组蛋白后，宿主蛋白的成分和种类均发生了较大变化，利用非基因工程宿主蛋白来建立重组蛋白的宿主杂蛋白检测方法具有极高的风险，也是目前还没很好地解决的技术难题。
用于HCPs分析的主要技术包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、高效液相色谱法和免疫印迹法，但是通常最终产品中HCPs含量都在ppm级，而上述方法的检测灵敏度和准确性明显不够，无法对高纯度的样品进行有效的HCPs定量分析。因此，酶联免疫吸附(ELISA)技术由于其高灵敏度和准确性被认为是行业内的黄金标准检测方法。到目前为止，绝大多数通过FDA批准认可的重组蛋白药物残留HCPs含量定量都是通过ELISA进行测定，检测含量一般在1–100ppm之间。因而建立高精度的ELISA方法来检测宿主残留杂蛋白的关键在于具有专一性识别抗原(宿主残留杂蛋白)的特异性抗体。
检测残留杂蛋白的ELISA方法主要有两种，一种是利用商业化的试剂盒，但需要有成熟的商业化抗体，另一种是通过制备特异性抗体进行检测。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种特异性抗体，其可专一结合重组蛋白提取物中的残留杂蛋白。
本发明的另一个目的在于提供一种免疫检测试剂，该试剂用于检测重组蛋白提取物中的残留杂蛋白，将本发明制备的特异性抗体作为所述免疫检测试剂中的捕获抗体和检测抗体，用双抗体夹心法进行检测。
根据本发明的一方面，一种特异性抗体，用于专一结合重组蛋白中的残留杂蛋白，所述重组蛋白为将外源基因通过基因工程技术重组并在宿主中表达的蛋白质产物，其中含有目的蛋白和残留杂蛋白，其特征在于，通过下述方法制备所述抗体：
1)用第一种蛋白免疫动物，制备抗第一蛋白抗体，所述第一种蛋白为天然存在于生物体的蛋白，所述目的蛋白与第一种蛋白具有相同的蛋白质结构和性质；
2)将步骤1)获得的抗第一蛋白抗体与亲和层析介质偶联，制备抗第一蛋白抗体-免疫亲和层析柱；
3)用步骤2)制备的抗第一蛋白抗体-亲和层析柱去除重组蛋白中的目的蛋白，获得总宿主残留杂蛋白；
4)用步骤3)获得的总宿主残留杂蛋白作为第二种蛋白免疫动物，制备抗第二蛋白抗体；
5)将第一种蛋白与亲和层析介质偶联，制备第一种蛋白-亲和层析柱；
6)用步骤5)制备的第一种蛋白-亲和层析柱去除步骤4)制备的抗第二蛋白抗体中的痕迹量的抗第一种蛋白的抗体，获得能专一结合重组蛋白提取物中残留杂蛋白的抗体。
优选地，在步骤1)和步骤4)之后可以进一步包括纯化免疫动物获得的抗第一蛋白抗体和抗第二蛋白抗体的步骤。并且必要时可以重复步骤3)和步骤6)，以获得更好的去除目的蛋白和抗第一蛋白的抗体的效果。
在上述步骤中，术语“天然存在于生物体的蛋白”是指直接从生物体中分离的具有生物活性的蛋白质。
术语“重组蛋白”是指应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。
术语“残留杂蛋白”或者“宿主残留杂蛋白”是指在重组蛋白表达和分离纯化过程中来源于宿主细胞的非目的蛋白的蛋白质。
用于表达重组蛋白的表达载体包括原核细胞如大肠杆菌、真核细胞如酵母、昆虫细胞以及CHO细胞等，重组蛋白也可利用动物表达系统或植物表达体系产生，例如转基因动物的乳腺或者转基因植物的胚乳或叶片。本发明的一个代表性示例即通过水稻胚乳表达的人血清白蛋白。
根据本发明的另一方面，提供一种酶联免疫检测试剂，用于定量检测基因工程重组蛋白提取物中的残留杂蛋白，其使用本发明的特异性抗体作为捕获抗体包被固相载体，并用本发明的特异性抗体作为检测抗体与标记物结合制备酶结合物；优选的检测试剂为使用双抗体夹心法的ELISA检测试剂。
更具体的，本发明以转基因水稻胚乳表达的重组人血清白蛋白的制备为典型示例，提供一种酶联免疫检测试剂，其中所述能专一结合重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特性抗体通过下述方法制备：
i)用人源血清白蛋白作为抗原免疫兔子，制备兔抗人血清白蛋白多克隆抗体并纯化；
ii)将步骤i)制备的纯化的兔抗人血清白蛋白多克隆抗体与亲和层析介质偶联，制备免疫亲和层析柱A；
iii)用步骤ii)的免疫亲和层析柱A从表达重组人血清白蛋白的基因工程 水稻种子提取物中去除目的蛋白，进而制备水稻种子总残留杂蛋白，通过3次的亲和层析，彻底去除目的蛋白的目的，收集含水稻种子总残留杂蛋白的流出液；
iv)用步骤iii)获得的含水稻种子总残留杂蛋白的流出液免疫兔子，获得抗基因工程水稻水稻种子总杂蛋白的多克隆抗体并纯化；
v)以血浆来源人血清白蛋白与亲和层析介质偶联，制备亲和层析柱B；
vi)用步骤V)的亲和层析柱B对步骤iv)的获得的抗基因工程水稻水稻种子总杂蛋白多克隆抗体进行亲和层析，通过3次的亲和层析，去除痕迹的抗重组人血清白蛋白的抗体，收集流出物为专一结合表达重组人血清白蛋白的基因工程水稻种子总提取物中残留杂蛋白的特异性抗体。
优选地，其中步骤ii)和步骤v)所述的亲和层析介质为CNBr-activativedSepharoseTM 4Fast Flow。
优选地，其中步骤i)所述的纯化包括下述步骤：
ia)硫酸铵沉淀粗纯化制备的兔抗人血清白蛋白多克隆抗体得到粗纯液；以及
ib)用proteinA亲和层析纯化粗纯液获得纯化的多克隆抗体。
其中步骤iv)所述的纯化包括用IgG层析柱纯化获得的抗体基因工程水稻宿主杂蛋白的多克隆抗体。
所述的免疫检测试剂中，优选的捕获抗体包被浓度可以在为5～40μg/ml，更优选捕获抗体浓度为20μg/ml，检测抗体浓度优选为0.2～1.6μg/ml，更优选的检测抗体浓度为0.8μg/ml，以辣根过氧化物酶标记检测抗体。
也可以将生物素与辣根过氧化物酶结合，其中优选的捕获抗体包被浓度为2～16μg/ml，检测抗体浓度为0.5μg/ml，更优选的捕获抗体浓度为2μg/ml，以生物素标记检测抗体后再与辣根过氧化物酶结合。
本发明的免疫检测试剂，其检测的重组蛋白提取物中残留杂蛋白含量优选为2.5ng/ml–25ng/ml。
本发明的特异性抗体可专一结合重组蛋白提取物中的宿主残留杂蛋白，利用本发明特异性抗体的ELISA检测实践可对重组蛋白提取物中的残留杂蛋白进行定量鉴定，对于重组蛋白产物的质量控制有重要的用途和意义。
附图简述
图1为检测水稻宿主残留杂蛋白的ELISA方法建立的技术路线图；
图2为抗人血清白蛋白血清的滴度与覆盖度的Western Blotting检验；其中：1:商业购买兔抗人血清白蛋白，2：自制兔抗人血清白蛋白，M:Marker；
图3为水稻种子抗总杂质兔血清的粗纯化路线图；
图4为纯化后抗体的Native PAGE图；其中：1为白蛋白抗体，M为蛋白marker.纯化后抗体的Native PAGE图，1为白蛋白抗体，M为蛋白marker。
图5为抗体偶联填料载量的测定；其中：左向箭头：洗脱溶液(即结合的人血清白蛋白)，右向箭头：穿透溶液(即未结合杂质蛋白)；
图6为水稻种子杂蛋白标准品样品的SDS-PAGE与专一性抗体的WesternBlotting图；
图7为水稻种子总杂质抗血清的初步纯化路线图；
图8为抗体的抗原覆盖度及专属性分析；其中：抗杂质抗体对各层析步骤的杂质的SDS-PAGE(左)和Western blot图(右)；泳道1-9为不同纯化步骤的样品。M为蛋白Marker；
图9为ELISA检测试剂的标准曲线的线性验证结果。
具体实施方式
下面通过对优选实施例的描述，详细说明但不限制本发明。
描述本发明的特异性抗体和ELISA检测试剂的一个示范性实施方式是用基因工程水稻胚乳细胞表达的重组人血清白蛋白(OsrHSA)。在重组人血清白蛋白的提取物中除目的蛋白(重组人血清白蛋白)外，包含来自植物源(水稻)宿主的残留杂蛋白，天然蛋白为人源血清白蛋白。
利用水稻胚乳细胞作为生物反应器表达重组的人血清白蛋白的方法，可以参见如中国专利申请No.200510019084，其涉及利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产OsrHSA的方法，或者如No.201010597544.2，其涉及从水稻种子中提取重组人血清白蛋白的方法，No.201010606635.8涉及从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法。
以下实施例所使用的材料和设备如无特别说明均为市售商业购买。
人血清白蛋白(human serum Albumin)Sigma；
弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)Sigma F-5881；
弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant,FIA)Sigma F-5506；
新西兰兔(New Zealand rabbits)中科院武汉病毒所；
植物源重组人血白蛋白粗提液由武汉禾元生物科技有限公司提供；(制备方法参考上述引用的专利申请)
抗人血清白蛋白抗体(Anti-Human Serum Albumin antibody)abcam ab2406；
用于多克隆抗体的纯化与偶联的试剂：
层析填料：CNBr-activatived SepharoseTM 4Fast Flow；
层析仪：AKATA Purifier 100UPC,Bio-rad Duoflow；
载量测定：BCA法测定提取溶液蛋白含量(ThermoScientific)；
Equlibration buffer:20μM Na2HPO4·12H2O+4μMNaH2PO4·2H2O+0.5MNaCl pH7.6；
Elution buffer:20μM Na2HPO4·12H2O+0.15M NaCl pH2.8
饱和硫酸铵：50％饱和硫酸铵。
用于免疫亲和层析与NanoLC-ESI-MS/MS的设备：
膜包：U650599PelliconXL5KD Millipore PXC005C50，100％TCA，丙酮；
Agilent 1200系列快速高分辨液相色谱仪(Rapid Resolution LiquidChromatography,Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)，
真空浓缩离心机(SpeedVac device，Thermo)，胰蛋白酶(modified,sequencing grade)，Promega(Madison,WI)
四级离子陷阱质谱分析仪Thermo(Palo Alto,CA)；
非冗余蛋白数据库下载于NCBI’s GenBank；
所有在蛋白酶解和HPLC用到的化学试剂均来自Sigma(St.Louis,MO,USA)。
【实施例1】特异性抗体制备
1、技术路线
由于目前还没有可用于检测水稻宿主残留杂蛋白的ELISA商业试剂盒。为了开发适用水稻表达体系制备的重组人血清白蛋白提取物的检测方法，在重组蛋白水稻胚乳细胞过量表达时，产生内质网胁迫，而从导致一些内源蛋白的组分发生一些改变，为了更准确地检测宿主蛋白，本检测方法利用基因工程水稻种子全杂质，建立了具有灵敏度高、重复性好的检测方法，用于水稻种子生物反应器系列产品的检测和质量控制。
本检测方法应用基因工程水稻的提取工艺的粗提取物的全杂质成分，采用双抗体夹心法测定植物源重组人血清白蛋白中的水稻种子宿主蛋白残留量水平；检测抗体分别采用HRP标记和生物素标记。
实验技术路线如图1所示，实验制备抗人血清白蛋白(天然蛋白，第一种蛋白)的免疫层析柱，用于去除基因工程全提取物中的重组人血清白蛋白(目的蛋白)，剩余的全蛋白作为总残留杂蛋白(第二种蛋白)抗原，免疫兔子获得抗宿主总杂蛋白的多克隆抗体，纯化后的抗宿主总杂蛋白的多克隆抗体作为包被和检测抗体，并以免疫抗原作为标样，建立夹心ELISA定量方法。
2、抗人血清白蛋白多克隆抗体制备
取20只成年新西兰兔，每4周注射一次人源的人血清白蛋白，共注射3次，在最后一次注射后的7-10天后放血采集血液。将收集血液在37℃恒温箱中放置30分钟，在4℃放置过夜。将血凝块从管壁上拨落，转移至塑料离心管中，在4℃下10,000g离心10分钟，收集上清液即为血清，血清样品随即用抗IgG的免疫亲和层析对血清中的抗体进行进一步纯化，获得高纯度抗人血清白蛋白抗体，纯化后的抗体在-20℃冰箱保存以备用。
表1抗人血清白蛋白多克隆抗体制备流程
在第三次免疫后一个星期，制备血清经过Western检测，同样在1:10000稀释度的条件下，实验制备的抗人血清白蛋白的血清与市场销售的抗人血清白蛋白抗体(US Biological，A1327-30A)进行比较，Western Blotting结果如图2所示，制备的抗人血清白蛋白的血清效价跟市场经过纯化后的效价接近，制备多克隆抗体还能有效地与人血清白蛋白的降解片段反应，表明制备的抗体不仅能有效地去除完整重组人血清白蛋白分子，而且能有效地去除人血清白蛋白的降解片段，因而可以提高对残留杂蛋白鉴定的精确度。
3、抗人血清白蛋白多克隆抗体的纯化
为了消除任何血清不纯物对检测结果的影响，先对抗血清进行粗纯化，具体纯化的过程见图3。经二级硫酸铵沉淀的粗纯化抗体用25mM PBS复溶，经过透析去除硫酸铵用HCl调节pH值至7.6，用于免疫亲和层析的制备样品。
抗人血清白蛋白抗体经粗纯化后，用于抗原免疫亲和层析。人血清白蛋白抗原首先偶联至CNBr-activatived SepharoseTM 4Fast Flow。偶联方法具体流程参照厂家说明书为：先用0-4℃的HCl(pH 2-3)溶液去除填料的保护剂，以人血清白蛋白溶液(pH8.0)：填料按照1:2的比例进行混合偶联，混合后摇床里室温放置3小时，随后加入0.1M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液放置2小时，对未偶联残基进行封闭。封闭结束后用缓冲液(0.5M NaCl,0.1M acetate,pH 3-4)和缓冲液(0.5M NaCl,0.1M Tris-HCl,pH 8–9)反复清洗人血清白蛋白偶联的填料，最后制备的填料装入层析柱，上样前采用3倍柱体积的平衡液(20μM Na2HPO4,0.5MNaCl pH7.6)对免疫亲和层析柱进行平衡，上样后用洗脱液(20μMNa2HPO4,0.5M NaCl pH 2.1)对结合在免疫亲和层析填料的抗人血清白蛋白抗体进行洗脱收集，洗脱后的层析柱经过再平衡进行下一次的纯化收集。
本试验共利用700mg人血清白蛋白偶联了6.5g CNBr-activativedSepharoseTM 4Fast Flow填料，获得层析柱载量约为100mg。对抗原免疫亲和层析后的抗体通过12％的Native PAGE分析，结果显示纯化的抗体具有较高纯度(图4)，纯化后的抗体经过BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein assay kits,BioRad,Pierce,CA USA)测定，总抗体量约为1.5g。
4、抗人血清白蛋白抗体偶联亲和层析填料的载量测定
纯化后的抗体按照同样偶联方法偶联至CNBr-activatived SepharoseTM 4FastFlow，偶联的流程跟抗原人血清白蛋白的偶联流程相同。偶联完后对层析柱进行载量的确定，在增加上样量的情况下，非吸附蛋白(穿透液)增加，吸附的人血清白蛋白保持不变，即柱子已饱和，在饱和状态下最低上样量即为柱子的载量。以含植物源重组人血清白蛋白(8mg/ml)上样，上样体积从4ml逐步增加，随着上样体积增加，当洗脱体积逐渐平稳，当只有析出体积增加时，即可确定此上样量即为柱子载量。
从图5可以看出，植物源重组人血清白蛋白(8mg/ml)上样体积从4ml逐步增加到24ml。结果显示：在上样量4ml至12ml之间结合的人血清白蛋白和穿 透的杂蛋白具有量效关系，即随着上样量增加，结合蛋白峰和穿透蛋白峰随着上样量的增加而增加，当上样量达到12ml时，基本达到饱和，即增加上样量并没有增加结合蛋白的峰值，表明12ml的上样量已经达到饱和，在该免疫层析树脂的装柱体积下，捕获人血清白蛋白的总载量为96mg。
5、宿主总残留杂蛋白抗原的制备
重组人血清白蛋白基因工程水稻原料大米经过研磨，称取米粉0.1g，加入提取缓冲液25mM PBS,pH7.5,(1:5)。用旋转仪混匀60min，12,000g离心，收集上清液后，以每次100mg的量进行anti-HSA免疫亲和层析，去除重组人血清白蛋白，分离宿主杂蛋白。
上样前先对偶联好的anti-HSA免疫亲和层析柱进行三倍体积的平衡液(20μM Na2HPO4,0.5M NaCl,pH7.6)进行平衡，流速为5ml/min,收集穿透液，然后用洗脱液(20μM Na2HPO4,0.5M NaCl,pH2.7)进行洗脱。上样过程中，收集的宿主总残留杂蛋白溶液，一次上样量为100mg，穿透液重复过柱两次，以彻底地去除宿主总残留杂蛋白中的人血清白蛋白，经过三次免疫层析收集的宿主总残留杂蛋白经过5kD膜包的超滤浓缩。收集的宿主总残留杂蛋白样品经浓缩后分别经12％的SDS-PAGE跑胶确定杂质组成。(参照《分子克隆》第三版)。
从图6结果可看出，所制备的宿主总残留杂蛋白抗原条带清晰，分子量范围广泛，用BCA法测纯化出来的抗原标准品，其蛋白浓度不低于1.5mg/ml。
6、抗总宿主杂蛋白多克隆抗体的制备过程
以基因工程水稻提取物的经纯化后的总残留杂蛋白为抗原，取4-6个月龄的纯种雄性新西兰大白兔作为免疫动物，初次免疫部位在淋巴结和背部多点注射，加强免疫部位在脚底和背部多点注射；初次免疫剂量为1.5mg/ml总残留杂蛋白抗原，初次免疫时加入等体积弗氏完全佐剂，以提高抗原的免疫原性，初次免疫后2周后进行加强免疫，加强免疫为1mg/ml总残留杂蛋白抗原，共3次，每次间隔2周。最后一次加强免疫后7-10天内采血,装于试管中，于37℃静置30min，使血球凝固，再置于4℃冰箱过夜，第二天离心收集上清液，并对上清液中的抗体进行纯化制得。具体纯化方法参见上述抗人血清白蛋白多克隆抗体的纯化。
抗水稻总残留杂蛋白的血清按照图7进行粗纯化，再经过protein A亲和层析，获得抗水稻总残留杂蛋白的多克隆抗体混合液，再用血浆来源的人血清白 蛋白偶联的亲和层析，去除可以识别重组人血清白蛋白的抗体成分，获得专一识别水稻宿主残留杂蛋白的特异性抗体。粗纯化的过程同上，纯化后的抗残留杂蛋白的血清沉淀用25mM PBS复溶，经过透析去除硫酸铵，然后用HCl调节pH至7.6，用作protein A亲和层析的上样品。选用protein A对粗纯化后的样品进一步的纯化，层析条件为平衡缓冲液20mM PBS pH 7.4，洗脱缓冲液0.1mM甘氨酸－盐酸缓冲液pH 2.7，流速2ml/min。再经重复三次的人源血清白蛋白偶联的亲和层析，以彻底地去除特异性抗体中的anti-HSA抗体，具体方法同上，唯一区别为收集穿透液为目标特异性抗体溶液。
【实施例2】ELISA检测试剂制备
1、特异性抗体的HRP的偶联
采用过碘酸钠法对实施例1制备的特异性抗体进行HRP标记，即在低PH下使NaIO 4氧化HRP，HRP经NaIO 4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，后者可进一步用NaBH 4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。具体步骤如下：标记步骤:
(1)称取20mgHRP溶解于4ml 0.3M碳酸氢盐(pH8.1)；
(2)于上述溶液中加入0.4ml新配的0.1％的FDNP溶液，室温下搅拌1小时；
(3)加4ml 0.5M NaIO 4,室温搅拌30min,待溶液变为黄绿色；
(4)加4ml乙二醇，室温搅拌1小时；
(5)将上述溶液装入透析袋中，用0.01M pH9.5的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(6)加入20mg抗体到15ml HRP溶液，室温搅拌2-3小时；
(7)加入20mg NaBH4混匀，再置4℃2小时；
(8)装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
偶联后的抗体需要去除未被偶联的多余酶，采用硫酸铵沉淀法去除未被偶联上的酶(硫酸铵沉淀方法同上面的抗体的预处理)，偶联完后的抗体经过OD208nm和OD403nm检测计算最终获得的偶联的抗体总量。计算公式如下：
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
2、Biotin与特异性抗体的偶联
3.5mg由实施例1制备的抗体溶液移入透析袋中，用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸，pH 9.4)透析过夜，加入1.5mg的Biotin于抗体溶液中。混匀后常温搅拌反应2小时。过G-25柱进行标记产物的纯化，去除游离生物素。蛋白含量用紫外分光光度计进行测定。
3、鉴定宿主残留杂蛋白ELISA方法的二抗制备过程
待标记的抗体为宿主残留杂蛋白ELISA捕获一抗，将3.5mg待标记的抗体溶液移入透析袋中，用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸，pH 9.4)透析过夜。加入1.5mg的生物素于抗体溶液中，混匀后常温搅拌反应2小时。过G-25柱进行标记产物的纯化，去除游离生物素后制得ELISA检测二抗。用BCA法检测宿主蛋白ELISA检测二抗蛋白浓度，检测结果应不低于1mg/ml。
【实施例3】ELISA检测影响因素的确定：
为了检测由本发明制备的抗体在检测宿主残留杂蛋白的可行性，对影响宿主杂蛋白残留量检测的影响因素进行了研究，分别对1)杂质的浓度与纯度；2)捕获一抗与检测二抗的抗原覆盖度与特异性；3)检测抗体HRP标记与生物素标记的选择及捕获抗体与检测抗体最佳配比；4)样品的测定范围。
我们对各检测影响因素进行实验确定后得出结果，杂质的浓度为2.5mg/ml，且在Western Blotting中用检测二抗检出单一条带；捕获一抗和检测二抗均对抗原具有很好的覆盖度且与目的蛋白OsrHSA(水稻胚乳表达的重组人血清白蛋白)间无交叉反应；最终确定的生物素体系中，捕获抗体包被浓度为2μg/ml，检测抗体浓度为0.5μg/ml，最低检测限可降低至1.25ng/ml；将酶标板包被抗体且封闭制成干板后本底值更低；稀释液使用PBS+0.1％BSA，检测结果更加准确；产品稀释比例为128倍时，结果最为可信。
【实施例4】特异性抗体的抗原覆盖度：
用Western Blotting法对获得的特异性抗体用抗原杂质检测，不管是标样抗原杂质还是部分纯化后的杂质，绝大部分都能有效地被特异性抗体检测，结果表明所制备的特异性抗体对前期产品和后期产品都具备很好的覆盖度。
交叉反应:在SDS-PAGE上，人血清白蛋白的带非常的明显(66.5kD),但Western Blotting结果显示，所有的层析样品包括最终样品没有重组人血清白蛋白对应的条带显示，表明所制备的特异性抗体不存在重组人血清白蛋白的交叉反应，图8。
【实施例5】检测抗体标记HRP或生物素的影响
为了比较HRP标记抗体与生物素标记抗体在本检测中的适用性，比较了两种标记抗体在灵敏度，检测限及本底上的区别。
基于HRP标记的检测抗体ELISA抗体浓度优化
实验首先建立了基于HRP标记抗体的ELISA方法，从
表2可以看出，在抗原浓度为250、50、10ng/ml条件下，HRP捕获抗体量在20-40μg/ml之间没有明显差异，而在20μg/ml时，OD值明显高于10μg/ml和5μg/ml，同样检测抗体在1.6与0.8μg/ml之间没有明显差异，而0.8μg/ml与0.4、0.2μg/ml则出现明显不同。在抗原浓度为2ng/ml时，OD检测值在各个浓度的捕获和检测抗体浓度下都很低，没有规律可循，可能是由于本身的检测限度所限。基于以上实验结果，我们最终选择捕获抗体浓度为20μg/ml，检测抗体浓度为0.8μg/ml(1:5000)。
表2不同抗原浓度在不同捕获抗体及检测抗体组合下OD450吸光值比较
基于生物素标记的检测抗体ELISA抗体浓度优化
在建立基于HRP标记抗体的ELISA方法时，比较50ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml抗原浓度在不同捕获抗体及检测抗体组合下OD450吸光值，由表3结果可看出，抗原浓度为1.25ng/ml仍有阳性信号，且所使用的捕获抗体浓度也较低，但在捕获抗体浓度高于2本底值μg/ml时，检测本底值大于0.2过高。因而需找到最佳的检测抗体与捕获抗体浓度组合，由表4不同抗原浓度50ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml在2μg/ml捕获抗体+0.5μg/ml检测抗体组合及 4μg/ml捕获抗体+0.5μg/ml检测抗体组合OD450吸光值比较可看出，当用2μg/ml捕获抗体进行包被，用0.5μg/ml检测抗体进行检测时，本底最低，且重复性较好。
表3不同抗原浓度在不同捕获抗体及检测抗体组合下OD450吸光值比较
生物素偶联检测抗体浓度为0.5μg/ml，Blank行为实验中阴性对照吸光值。
表4检测抗体与捕获抗体组合试验
生物素偶联检测抗体浓度为0.5μg/ml，每组实验独立重复3次。抗原吸光值为减去阴性对照后吸光值，Blank行为实验中阴性对照吸光值。
通过比较基于HRP标记与生物素标记的检测抗体ELISA方法数据，发现，由于生物素标记体系中，检测抗体孵育完成后，需辣根酶标记链亲和素进一步 进行交叉反应从而显色，因此生物素标记体系中，检测信号进一步放大，灵敏度提高，HRP标记体系中，2ng/ml抗原无阳性检测信号；而生物素体系中，捕获抗体及检测抗体浓度降低的情况下，1.25ng/ml抗原有稳定的阳性检测信号，灵敏度较HRP体系的5ng/ml提高到1.25ng/ml。
生物素标记检测抗体ELISA方法中，捕获抗体浓度为4μg/ml以上时，抗原检测吸光值趋于稳定，捕获抗体包被浓度在4μg/ml即可满足检测，但本底值稍高，高于0.2，不利于低浓度抗原检测数据的稳定；当捕获抗体浓度降低为2μg/ml时，除高浓度抗原吸光值稍有下降外，低浓度抗原吸光值较为稳定，且显著高于空白对照+3×SD，OsrHSA中杂质含量较低，低本底值及更稳定的低浓度样品检测对于方法的稳定性更为重要，故最终选择2μg/ml的捕获抗体进行包被，0.5μg/ml的检测抗体进行检测。
【实施例6】样品测定范围
为了确定样品的测定范围，将OsrHSA原液(浓度为200mg/ml)进行倍比稀释后进行测定，结果如表所示。OsrHSA产品中OsrHSA浓度较高，在ELISA中对杂质含量测定可能存在一定影响。由表中结果可以看出，当其稀释比例为64-256梯度范围内时，杂质含量测定值基本呈同等倍比关系，稀释倍数过大，导致杂质含量接近定量限时，数值偏差会较大。故稀释梯度为128倍时，测定结果最为可信，即OsrHSA浓度最好为3mg/ml以下时，产品中杂质含量测定值较为准确可信。
表5样品倍比稀释测定值
【实施例7】ELISA方法验证
1、专属性
阳性样品：1.25ng/ml标准品
阴性样品：人血白蛋白，用稀释液稀释128倍
空白：样品稀释液
点样序列：阳性样品、阴性样品、空白每块ELISA干板上各点样6个复孔，独立重复3次
专属性验证结果：
可接受标准：阳性样品有信号，OD值大于空白OD平均值+5×SD；阴性样品无信号，OD值与空白接近
结果：3次独立重复实验均显示，阳性样品OD450大于空白OD+5×SD；阴性样品无阳性信号，OD值与空白值接近，符合标准规定
表6宿主蛋白残留量测定方法专属性验证结果
2、线性
方法：以吸收值(OD)对抗原标准品的浓度(Concentration)做4-parameter模式的标准曲线。标准曲线的R2应不得小于0.99，结果如图9.
点样序列：
表7线性验证点样序列
点样次序 溶液名称 点样复孔次数 1 标样50ng/ml 3 2 标样25ng/ml 3 3 标样12.5ng/ml 3 4 标样5ng/ml 3 5 标样2.5ng/ml 3 6 标样1.25ng/ml 3 7 标样0.5ng/ml 3 8 空白0ng/ml 3
表8宿主蛋白残留量测定方法线性验证结果
3、定量限
方法：将抗原标准品溶液稀释至最低可准确定量的浓度，点样测试。
点样序列：定量限溶液点样6个复孔，试验独立重复3次
定量限度样品：1.25ng/ml标准品抗原，点样6个复孔，独立重复3次(n＝18)
定量限验证结果：
可接受标准：实际定量限为1.25ng/ml，测定结果的回收率在75％-125％之间，测得值的RSD不得大于25％
定量限为1.25ng/ml，测定结果的回收率为96.5％，且测得值的RSD(n＝18)＝16.7％，符合标准规定
表9宿主蛋白残留量测定方法定量限度验证结果
4、重复性
方法：将同一样品稀释后重复点样，计算结果间的RSD。
点样序列:标准品点样序列同2。
供试品批号：201310035、201310036、201310037。
供试品点样序列：各批次供试品稀释后点样9个复孔(3个复孔为一组，板内重复性，n＝9)，独立重复3次(板间重复性，n＝9)。
重复性验证结果:
可接受标准：
各批次样品板内测定结果(n＝9)与板间测定结果(n＝9)的RSD值不大于20％
结果：各批次样品板内测定结果(n＝9)及板间测定结果(n＝9)的RSD值均小于20％，符合标准规定
表10宿主蛋白残留量测定方法重复性验证结果
5、准确度
方法：样品溶液中添加浓度为25ng/ml、10ng/ml和2.5ng/ml的标准品溶液，计算加标回收率。
点样序列：标准品抗原点样序列同2。
加标样品：加标25ng/ml、加标10ng/ml、加标2.5ng/ml、加标0ng/ml(阴性对照)。
加标样品点样序列：各浓度加标样品每块板各点样3个复孔，独立重复3次。
回收率计算公式：
回收率％＝(加标样品测定值-未加标样品测定值)/标准品理论添加量×100％。准确度验证结果
可接受标准：回收率在75％-125％之间，回收率间的RSD不得超过20％
结果：
标准品添加回收率均在75％-125％之间，回收率间的RSD值均小于20％，符合标准规定
表11宿主蛋白残留量测定方法准确度验证结果
6、精密度
方法：准确度项下各回收率间的RSD来确定方法的精密度。
点样序列：同2
精密度计算方法：各浓度加标样品回收率间RSD值(n＝9)。
精密度验证结果：可接受标准：各浓度回收率间的RSD值不得超过20％(n＝27)。
结果：各浓度回收率间的RSD值为8.3％(n＝27)，小于20％，符合标准规定
表12宿主蛋白残留量测定方法精密度验证结果
7、范围
线性、精密度和准确度都符合可接受标准的样品测定范围为：2.5ng/ml–25ng/ml。