EV71中和抗体的竞争酶联免疫检测方法、试剂盒或试剂及其制备方法.pdf

本发明公开了EV71中和抗体的竞争酶联免疫检测方法、试剂盒或试剂及其制备方法。试剂盒利用标记的对EV71病毒A、B、C三基因型均有较高中和效价的单克隆抗体、EV71中和抗体参考品和包被酶标板，能够简单快速准确的定量、定性的检测人与动物样本中的EV71中和抗体含量。采用EV71病毒颗粒包被于酶标板，将酶标记的EV71中和抗体按照一定比例稀释后与待检样本及EV71中和抗体参考品分别混合，与包被在酶联板上的EV71抗原反应，显色后根据参考血清反应的OD值的百分吸光率与EV71中和抗体参考品抗体效价的对数绘制半对数标准曲线，将待检样本OD值的百分吸光率代入标准曲线方程，计算相应的中和效价。

1、  一种检测EV71中和抗体含量的试剂盒或试剂，其包含保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。

2、  根据权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的(例如酶标记的或荧光标记的)。

3、  根据权利要求2所述的试剂盒或试剂，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金离子标记的。

4、  根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒或试剂，其进一步包含EV71抗原或包被有EV71抗原的酶标板。

5、  根据权利要求4所述的的试剂盒或试剂，其中EV71抗原是针对选自如下基因型EV71病毒的一种或多种的抗原：A基因型EV71病毒；选自B1、B2、B3、B4和B5型的B基因型EV71病毒；以及选自C1、C2、C3、C4和C5型的C基因型EV71病毒。

6、  根据权利要求5所述的试剂盒或试剂，其进一步包含EV71中和抗体参考品，稀释液，酶标记抗体，显色液A、显色液B，终止液，浓缩洗液，和/或说明书。

7、  权利要求1-6任一项所述的试剂盒或试剂在定量或定性检测EV71中和抗体中的用途，优选地，其中EV71抗体是针对A、B或C基因型的EV71病毒的中和抗体(优选的，所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，和/或C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒)。

8、  一种定量或定性检测EV71中和抗体或评价针对EV71的疫苗的有效性的方法，其中包括使用权利要求1-6任一项所述的试剂盒或试剂或使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段，优选地，其中EV71中和抗体是针对A、B或C基因型的EV71病毒的抗体(优选的，所述B基因型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C基因型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒)或是用针对EV71的疫苗免疫或接种人或动物后产生的抗体，其中优选所述的检测方法是竞争酶联免疫方法。

9、  一种制备权利要求1-6任一项所述的试剂盒或试剂的方法，其中使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。

10、  根据权利要求9所述的方法，其中所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段生物标记或化学标记的(例如酶标记的或荧光标记的)，优选地，所述标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金。

EV71中和抗体的竞争酶联免疫检测方法、试剂盒或试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于对人和动物EV71中和抗体(即针对EV71的中和性抗体)进行竞争酶联免疫定性、定量的检测方法和试剂盒或试剂，具体可涉及用于对血清(浆)中EV71中和抗体进行检测的的检测方法和试剂盒或试剂，其中尤其涉及EV71中和抗体的竞争酶联免疫检测方法。
背景技术
EV71病毒(enterovirus)颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，极其渺小，直径约24～30nm，其基因组为单股正链RNA。EV71病毒在病毒学上的分类是属于微小RNA病毒科中的肠病毒属，分为A、B、C三种基因型。EV71病毒主要经粪口途径传播，易感人群为5岁以下的婴幼儿，主要引起手足口疾病，此外还可引发心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，导致儿童死亡，感染性强且致残致死率高。
EV71病毒于1969年首次被分离，随后世界许多国家都有EV71流行的报道。近几年来，EV71在亚太地区的流行呈逐年上升的趋势。国内1981年上海首次报道本病；此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等10几个省市均有报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发，其中5-10月间发生了7000余病例。其后，经过2年低水平散发后，1986年再次暴发。
2007年山东临沂、青岛和济南等地发生主要由EV71引起的手足口病的流行，其中报告病例近4万例，报告死亡病例14例。2008年到2009年期间，国内的手足口病形势更加严峻。但是目前由EV71带来的手足口病尚无有效的药物治疗方式，也无相关疫苗问世，所以预防控制难度大。同时，该病具有隐性感染和轻症病例多、传染源难以发现和控制、儿童普遍易感、传播途径多、难以有效阻断等特点，在我国已纳入丙类传染病管理。
国内外学者正致力于EV71疫苗的研究。疫苗的免疫保护性主要在于诱导机体产生高滴度的中和抗体，然后中和抗体与病毒结构蛋白上的中和抗原表位结合，阻断该表位与敏感细胞细胞膜上的相应受体结合，以阻止病毒感染细胞发挥疫苗的保护作用。中和抗体活性是疫苗免疫效果的重要依据与指标。目前EV71研究缺少有效的动物模型，对EV71敏感的动物只有刚出生3-5天的乳鼠，而使用该动物无法进行免疫后攻毒保护性研究，否则动物就达到安全年龄段从而对该病毒不再敏感。另外，在利用WHO认定的体外中和试验参考方法(检测体外中和抗体滴度)评价疫苗的有效性时，其体内免疫攻毒实验和体外中和试验不仅耗时，还需要进行细胞培养，方法繁琐，价格昂贵，试验周期长，需要有较好的实验室设备及技术人员。因此开发一种简便、安全、快捷的EV71中和抗体的检测方法，具有重要的实用价值。
发明内容
本发明公开了一种EV71病毒A、B、C三基因型广谱中和抗体竞争酶联免疫检测方法，能够快速有效的检测人和其他动物样本中的EV71中和抗体，代替EV71病毒动物体内攻毒试验与抗血清体外中和试验，克服体内攻毒试验无法进行的缺点，用于评价疫苗的有效性以及对待测受试者样本中针对EV71的抗体进行定性、定量检测。
具体的，本发明一方面提供了一种检测EV71的中和抗体(本文中也将其称为“EV71抗体”或“EV71中和抗体”)的含量的试剂盒或试剂，其包含保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
另一方面，本发明提供了本发明所述的试剂盒或试剂在定性或定量检测EV71中和抗体中的用途。
再一方面，本发明提供了一种定性或定量检测EV71中和抗体的方法，其中包括使用本发明所述的试剂盒或试剂。
还一方面，本发明提供了一种制备本发明所述的试剂盒或试剂的方法，其中使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
另外，本发明还提供了一种评价针对EV71疫苗的有效性的方法，其包括使用本发明的试剂盒或试剂或使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
优选地，本发明所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的(例如酶标记的或荧光标记的)，进一步优选地，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素标记、生物素、胶体金离子、碱性磷酸酶标记的。
优选地，本发明的试剂盒或试剂进一步包含EV71抗原或包被有EV71抗原的酶标板；和/或优选地进一步包含EV71中和抗体参考品，酶标记抗体，稀释液，显色液A、显色液B，终止液，浓缩洗液，和/或说明书。
优选地，本发明的EV71抗原选自A、B、C三种基因型的EV71病毒的抗原。进一步优选的，所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。
优选地，本发明所述的检测方法是通过竞争酶联免疫检测方法来实现的；本发明的试剂盒或试剂优选是用于通过竞争酶联免疫检测方法对EV71中和抗体进行定量和/或定性的。
另外，对于本发明所述的抗体或单克隆抗体，其是指针对EV71病毒或EV71抗原的抗体或单克隆抗体。
对于本发明的试剂盒或试剂和检测方法的施用对象，优选是哺乳动物受试者(例如人)，更优选的是血清样本。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1、本试剂盒检测的是EV71中和抗体，对于疫苗研究与生产过程中的免疫效果的评价具有重要的指导意义，可用于科研院所与生物公司开发EV 71疫苗的实验评价以及流行病学调查。
2、本试剂盒采用HD6单克隆抗体作为酶标记抗体(酶标记竞争结合物)，该抗体与其他肠道病毒无交叉反应，能与其产生竞争的仅有EV 71中和抗体，有效的保证了试剂盒的特异性。
3、本试剂盒用于酶标记的单克隆抗体，对于A、B、C三种基因型EV71病毒均有较高的中和效果，该试剂盒检测的对象为抗EV71病毒的中和抗体。由于中和抗体是疫苗免疫效果的最直接评价指标，因此，该方法检测到的中和抗体反映了疫苗的有效性或保护性，从而可用于疫苗保护性的分析，以建立体外中和抗体检测方法。这样可代替EV71病毒动物体内攻毒试验与抗血清体外中和抗体试验来检测中和抗体滴度，克服体内攻毒试验无法进行的缺点。
4、该试剂盒可用于A、B、C三基因型EV71中和抗体的检测，具有广泛适用性，即广谱性。
5、包被抗原可以是A、B、C三基因型EV71病毒纯化液或者单一的病毒纯化液。
6、使用的EV71中和抗体参考品可指采用自然感染的人血清、血浆或者EV71抗原免疫人和动物获得的血清、血浆或者制备的单抗腹水及其纯化物作为标准曲线绘制的参考品。
7、肠道病毒存在着众多的型内、型间交叉反应性，EV71与Cox A16的相似性高达80％，拥有很多共同表位，许多抗EV71的单抗具有与Cox A16的交叉反应性。本发明所筛选的单克隆抗体具有高效的EV71病毒A、B、C三基因型的中和效果，与Cox A16无交叉反应性。从而，更加有利于EV71疾病的筛查、手足口病的疾病调查；对于EV71与Cox A16引起的疾病调查与相关疫苗的区别、分析、比较至关重要。
8、EV71病毒感染在我国连年攀升，导致不少儿童死亡，对我国的经济与人民生命安全造成很大的威胁，所以EV71疫苗研发已在紧锣密鼓的进行，建立的简便安全快捷有效的EV71疫苗评价方法，能对其有效性进行科学的评价，具有良好的社会效益。而本发明的酶联免疫检测方法实现了这一目的。而且，由于使用竞争酶联免疫检测法或ELISA方法，试验试剂成本低，克服了体内攻毒试验无法进行的缺点，同时也避免了体外中和试验接触活病毒的情况，安全性较好。
9、本发明的试剂盒或方法可以准确的定量或定性检测EV71病毒中和抗体，其操作简单，所用时间短，且其结果与中和试验方法检测的结果具有较好的一致性。
附图说明
图1为根据试验结果绘制的半对数标准曲线图以及获得的标准曲线方程。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例1：EV71包被抗原的制备
将C4基因型EV71病毒接种于Vero细胞，培养后加入裂解液以裂解细胞，收获培养液，灭活后纯化EV71病毒，并通过除菌过滤后制得EV71纯化液，即为包被抗原。(可参见：Bishop NE，Hago DL，Borovec SVet al.Rapid and efficient purification of hepatitis Avirus fromcell culture(快速高效的从细胞培养物中纯化肝炎病毒).J VirolMethods，1994，47：203-216)。然后对EV71纯化液采用BCA试剂盒(Micro BCA^TM Protein Assay Kit PIERCE公司，货号23235)检测蛋白浓度。
当然，本领域技术人员明白，采取上述方法也可制备出其他基因型的EV71纯化液，且制备出的纯化液可用于下面的实施例中。具体而言，包被抗原可来自EV71病毒A、B、C三基因型的纯化液，其中它们各自可单独或组合形成包被抗原。
实施例2：抗EV71单克隆抗体的制备与鉴定
采用实施例1制备的EV71纯化液三次免疫BALB/c小鼠，对间接ELISA法效价最高的BALB/c小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按比例融合，并于HAT培养液上培养融合杂交的瘤细胞。进行三次亚克隆，每次亚克隆时，分别采用A、B3、C4基因型EV71纯化液单独包被酶标板，检测各细胞孔细胞上清的间接ELISA法效价，对于与A、B、C三基因型OD值均大于0.4的孔进行克隆化。从而，获得了与A、B、C三基因型均有较强反应的HD6单克隆细胞株。将上述HD6单克隆细胞株进行扩大培养，并将扩大培养后的细胞注射BALB/c小鼠腹腔，约7-14天后，待小鼠腹部明显膨大时，穿刺采集腹水，制备抗EV71单克隆抗体腹水(可参见：金伯泉主编.2002.《细胞和分子免疫学试验技术》.第四军医大学出版社.9-17.)。
上述HD6单克隆抗体腹水间接ELISA法效价检测程序与结果如下：将按照实施例1所制备的EV71纯化液采用0.01M PBS按1∶100稀释后以100ul/孔包被于酶标板，4℃包被过夜；将包被后的酶标板洗板3次，加入封闭液，37℃封闭1小时，甩去酶标板孔内的封闭液，拍干，室温放置备用。将HD6单克隆抗体腹水及阴性对照血清以1∶10²、1∶10³、1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶和1∶10⁷的比例稀释，并以100ul/孔加样于封闭后的酶标板；37℃反应1小时后洗板5遍，加入羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson Immunoresearch公司)；37℃避光反应1小时后洗板5遍，然后加入显色液于37℃避光显色10分钟；然后加入终止液50ul/孔终止反应；450nm读数。结果见表1。
表1HD6单克隆抗体腹水间接法效价检测450nm吸光度结果

结果显示：HD6单克隆抗体对于A、B、C基因型EV71病毒均有较强的间接ELISA活性。
对制备的抗EV71的HD6单克隆抗体腹水进行体外中和试验以检测中和抗体滴度：
培养Vero细胞，将上述HD6单克隆抗体腹水由1∶8开始进行2倍系列稀释至适宜稀释度，每份样品平行稀释2孔。不同稀释度的单克隆抗体腹水0.05ml分别与0.05ml的A、B、C基因型EV71病毒液混匀于细胞板，于36℃下在CO₂培养箱中孵育。孵育结束后每孔加入Vero细胞悬液100ul，于36℃下在CO₂培养箱中培养7天，观察病变。试验设立阴性对照、标准阳性血清对照、空白样品对照及正常细胞对照。根据病变结果确定HD6单克隆抗体腹水的中和抗体滴度。结果见表2。
表2HD6单克隆抗体腹水A、B、C基因型EV71病毒中和实验结果

从上表可以看出，阴性对照＜1∶8，实验成立。进一步地，HD6单克隆抗体腹水是对EV71病毒A、B、C三基因型均具有较高的中和活性的单克隆抗体细胞株，具有广谱中和活性。
由于单克隆抗体所识别的完整病毒颗粒的表位能够与其结合，失去对细胞的感染能力，也说明HD6单克隆抗体所对应的抗原表位位于EV71病毒的表面，同时说明，EV71病毒表面存在抗原表位。
对制备的抗EV71的HD6单克隆抗体腹水进行特异性试验：
培养Vero细胞，将单抗腹水由1∶8起始进行2倍系列稀释，每份样品平行稀释2孔。取稀释样品0.05ml分别与0.05ml Cox A16病毒液和甲肝病毒液混匀，加样于细胞板，置36℃下的CO₂培养箱中孵育后，然后每孔加入细胞悬液0.1ml，置36℃ CO₂培养箱中培养7天，观察细胞病变。同时设立阴性对照、阳性对照、空白样品对照及正常细胞对照。根据病变结果确定HD6单抗的中和抗体滴度。HD6单克隆抗体对Cox A16和甲肝病毒的中和效价结果如下：
表3HD6单抗腹水对Cox A16、甲肝病毒中和实验结果

肠道病毒存在着众多的型内、型间交叉反应性，EV71与CoxA16的相似性高达80％，拥有很多共同表位，许多抗EV71的单抗具有与Cox A16的交叉反应性。该实验结果显示，HD6单克隆抗体腹水对Cox A16病毒无中和活性；同时该单抗对于甲肝病毒(EV72)也无交叉中和活性。同时本申请的发明人对HD6单抗与制备的Cox A16纯化液和甲肝病毒纯化液进行点杂交试验，结果HD6单抗与Cox A16和甲肝病毒均无交叉反应性。因此该单抗与Cox A16与甲肝病毒无交叉反应性与交叉中和活性。
最终，本申请的发明人经过上述筛选获得了与A、B、C三基因型均有良好间接ELISA反应性及中和效价的理想的杂交瘤细胞株HD6，申请人于2009年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏，保藏号为CGMCC No.2937(所对应的本发明的编号为HD6)。
实施例3：抗EV71单克隆抗体的纯化
将实施例2获得的HD6单克隆抗体腹水采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法(可参见：Valdés Veliz R，García J，Reyes B，et al.A very sensitive enzyme-linked immunoabsorbent assay to staphy-lococcal Protein A in the presence of immunoglobulins(在免疫球蛋白存在下葡萄球菌A蛋白的高灵敏性酶联免疫吸附试验).Biochem Biophys Res Commun，2003，303(3)：863-867.)纯化。对纯化抗体采用BCA试剂盒检测蛋白浓度为1.2mg/ml；将纯化抗体进行SDS-PAGE还原型电泳，并将电泳胶采用考马斯亮蓝染色。脱色后采用KODAK Gel200凝胶成像仪扫描电泳图，分析纯化抗体的纯度为93.2％(纯度较高)。由此，可制得可用于酶标试验的、高纯度的抗EV71单克隆抗体。
实施例4：酶标记抗体的制备
将实施例3获得的纯化抗体，采用改良的过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记(可参见：金伯泉主编.2002.《细胞和分子免疫学试验技术》.第一版，西安：第四军医大学出版社.31-35.)。标记完成后在酶标记抗体中加入50％终浓度(体积/体积)的甘油，-20℃保存。
实施例5：EV71中和抗体参考品的制备
1.人抗体参考品的制备
对病人恢复期血清进行体外中和实验测定其EV71中和抗体滴度，将体外中和实验的滴度的倒数定义为人中和抗体参考品的效价，单位为HbU/ml。例如体外中和试验的滴度为1∶256，则其中和抗体参考品效价为256HbU/ml。无菌分装血清-20℃保存。实验时将其稀释成0HbU/ml，1HbU/ml，2HbU/ml，4HbU/ml，8HbU/ml使用。
2.动物抗体参考品的制备
采用EV71纯化液加佐剂后免疫兔子、大鼠或者小鼠或者筛选单克隆细胞株，制备免疫血清或腹水，采用体外中和实验法测定血清或者腹水的抗EV71中和抗体滴度，同上述1中所述那样，确定EV71中和抗体参考品的效价，无菌分装，并于-20℃保存备用。实验时可将其稀释成0HbU/ml，1HbU/ml，2HbU/ml，4HbU/ml，8HbU/ml进行使用。
实施例6：EV71抗原酶标板的制备
将EV71纯化液用0.01M PBS稀释成250ng/ml的蛋白浓度，100ul/孔包被酶标板，4℃包被过夜，将包被酶标板用0.01MPBST-20(Tween20，万分之五终浓度，体积/体积)洗涤3遍，每孔加入150ul的封闭液(10％小牛血清、10％蔗糖、0.01M PBS)，37℃封闭1小时；弃去封闭液，拍干，室温风干，然后采用铝箔袋真空封装。所得酶标板置2-8℃保存。
实施例7：试剂盒的其他组分、组装及保存
作为本发明的一个具体实施例，本发明的试剂盒可包括：EV71抗原酶标板1块，酶标记抗体1瓶，EV71中和抗体参考品1瓶，稀释液1瓶，显色液A1瓶、显色液B1瓶，终止液1瓶，浓缩洗液1瓶，和/或说明书1份。本发明的试剂盒较适于在2-8℃下保存。当然，本领域技术人员明白，对上述有关本发明的试剂盒组份的各数量均可以进行变化，例如EV71中和抗体参考品可以为2瓶，EV71抗原酶标板可以为2块等。另外，对于EV71抗原酶标板，其可以为按照实施例6的方法制备的C4基因型的EV71抗原的酶标板。上述组分可为实施例8中所配制的相应试剂，例如稀释液、浓缩洗液和显色液等。
实施例8：稀释液、浓缩洗液、终止液的配制
1、稀释液
小牛血清          100ml
0.01M PBS         900ml
2、浓缩洗液
NaH₂PO₄.2H2O      2.96g
Na₂HPO₄.12H2O     29.0g
NaCl              234g
Tween-20          20ml
加纯化水至        1000ml
3、终止液
浓硫酸            112ml
纯化水            888ml
实施例9：显色液的配制
1)显色液A
醋酸钠            27.2g
柠檬酸            3.2g
30％H₂O₂          0.6ml
双蒸水            至1000ml
2)显色液B
TMB               0.4g
EDTA-Na2          0.4g
柠檬酸            1.9g
甘油              100ml
双蒸水至        1000ml
实施例10：EV71中和抗体的竞争酶联免疫检测方法的测定程序
对于本发明的试剂盒，可采用如下步骤进行使用：
1.配液：将30ml浓缩洗液(20x)用蒸馏水或去离子水稀释至600ml备用。
2.加样：将EV71中和抗体参考品用稀释液稀释至0HbU/ml，1HbU/ml，2HbU/ml，4HbU/ml，8HbU/ml；样品用稀释液适当稀释，分别在酶标板的相应孔中加入稀释后的EV71中和抗体参考品或稀释待测样品50ul。每个样本和EV71中和抗体参考品做2孔平行，并标记抗体参考品和样本孔所在的位置。
3.反应：每孔加入适当稀释的酶标记抗体50ul，轻拍混匀，并置37℃下避光温育60分钟。
4.显色：将酶标板孔内液体甩干，用洗涤液300ul/孔充分洗涤5遍，扣干。每孔加显色液A液、显色液B液各50ul，轻拍混匀，37℃避光温育10分钟。
5.测定：加入终止液50ul/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，测定每孔的OD值。
6.结果判定：结果判定有两种方法，定性判定采用第1种方法，定量判定采用第2种方法。注意样本吸光值与其所含的EV71中和抗体的含量成负相关。
6.1定性分析：根据样品的平均吸光度值所处的EV71中和抗体参考品的OD值范围，可得出样品中和抗体含量(HbU/ml)的范围。例如，假设样本平均吸光度值为0.600，标准品0HbU/ml，1HbU/ml，2HbU/ml，4HbU/ml，8HbU/ml的平均吸光度值依次为2.050，1.556，0.905，0.460，0.212，则样本的中和抗体含量范围为：2HbU/m-4HbU/ml；乘以稀释倍数即为样本中EV71抗体的实际含量范围。
6.2定量分析：
计算百分吸光率：EV71中和抗体参考品或者样品的百分吸光率等于EV71中和抗体参考品或者样本的平均吸光度值除以0HbU/ml EV71中和抗体参考品的平均吸光度值，再乘以100％。
标准曲线的绘制与计算：以EV71中和抗体参考品的百分吸光率为纵坐标，以EV71中和抗体参考品的中和抗体含量的对数为横坐标，绘制半对数标准曲线图。将样本的百分吸光率带入标准曲线的方程中，计算样本的中和抗体含量，再乘以稀释倍数即为样本的EV71中和抗体含量。
实施例11：包被抗原、酶标记抗体最适工作浓度的选择
以方阵滴定法(可参见：Caruanal JF，Poirier B.Inactivated rabies vaccine control and release：use ofan ELISA method[J].BIOLOGICALS，2003，31：9-16.)对本发明的试剂盒中抗原抗体最适工作浓度进行选择。除非另有指出，本实施例中所涉及的试剂或其他原料，均为上述实施例中所具体描述制备的试剂或原料。
将包被抗原稀释成不同浓度，按实施例6所述步骤包被酶标板，与不同稀释度的酶标记抗体进行方阵滴定，以酶标仪读取各孔的OD450值，选取无阻断时OD450为1.5-2.0左右的抗原包被浓度与酶标记抗体的使用浓度为工作浓度。结果：酶标记抗体的工作浓度为1∶2000，相应的包被抗原浓度为250ng/ml。方阵滴定结果见表4。
表4包被抗原与酶标记抗体方阵实验OD450值

实施例12：EV71中和抗体效价检测定量分析方法及线性
计算样品和EV71中和抗体参考品的平均OD值与0HbU/ml的平均吸光度值的比值，乘以100％得百分吸光率；以EV71中和抗体参考品的百分吸光率为纵坐标，以EV71中和抗体参考品的中和抗体含量的对数为横坐标，绘制半对数标准曲线图。将样本的百分吸光率带入标准曲线方程中，计算样本的EV71中和抗体含量，再乘以稀释倍数即为样本的EV71中和抗体含量。以下表的试验结果为例，绘制了半对数标准曲线图并获得了标准曲线方程(见图1)。
表5线性试验结果示例

实施例13：EV71中和抗体竞争酶联免疫试剂盒的应用
采用该EV71中和抗体竞争酶联免疫方法，按照实施例10的试验流程，对样品进行EV71中和抗体含量的检测；同时采用体外中和实验法检测相应样品的体外中和抗体滴度，对两种方法的检测结果进行比较，分析该方法的准确性。除非另有指出，本实施例中所涉及的试剂或其他原料，均为上述实施例中所具体描述制备的试剂或原料。
1、人血清EV71中和抗体的检测分析
将20份由健康人群收集到的待检人血清(编号依次为1-20)采用体外中和试验法检测血清对A、B3基因型EV71病毒的体外中和抗体滴度。同时对上述20份待检人血清，分别采用A、B3基因型EV71纯化液包被的酶标板，按照实施例10检测EV71中和抗体效价。结果如下：
表620份人血清对于EV71病毒A基因型竞争ELISA中和抗体效价与体外中和试验法中和抗体滴度的比较

表720份人血清对于EV71病毒B3基因型竞争ELISA中和抗体与体外中和试验法中和抗体滴度比较

结果显示：20个样品采用两种方法及A、B3两基因型EV71病毒的检测结果变异系数＜20％，该检测结果与体外中和试验的结果一致性好。该方法与WHO推荐的参考方法检测结果无差异。
2、大鼠、小鼠免疫血清中和抗体的检测
采用实施例1中所述的方法制备铝吸附EV71病毒C4基因型纯化液免疫5只大鼠，并对这5只大鼠进行编号(编号为1-5)；对免疫后的大鼠分别进行0周、2周、3周、4周、5周、6周眼眶采血，血清编号为1-30。采用体外中和试验法检测血清的体外中和抗体滴度。同时对上述样品应用本发明的EV71中和抗体竞争酶联免疫检测方法(包被物为C4基因型EV71纯化液)检测其中和抗体的产生情况。结果见下表。
表85只大鼠0-6周血清中和抗体效价及体外中和试验中和滴度比较

结果显示：1.竞争ELISA检测结果与体外中和试验的中和抗体滴度结果吻合较好；2.大鼠免疫自2周开始，血清抗EV71中和抗体有明显升高，至第六周依然呈上升趋势。3.该方法的检测结果反映了免疫应答的趋势。证明该方法检测EV71中和抗体行之有效，可用于疫苗的筛选与评价。
需要申明的是，发明人对其他基因型的中和抗体也进行了类似的检测，其结果与上述一致，在此不一一赘述。