以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103667367 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667367 A (21)申请号 201310537851.5 (22)申请日 2013.11.01 CGMCC No.1.10327 2009.12.31 C12P 7/18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 天津志卓生物科技有限公司 地址 300000 天津市河西区围堤道中豪国际 大厦 B1201 (72)发明人 金红星 (74)专利代理机构 天津市三利专利商标代理有 限公司 12107 代理人 闫俊芬 (54) 发明名称 以红糖为碳源明串珠菌发酵产。

2、甘露醇的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种以红糖为碳源明串珠菌发 酵产甘露醇的方法， 涉及微生物发酵工艺， 该培养 基的配方为红糖 19 21 克、 酵母浸粉 1.9 2.1 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬酸铵 2 克， 溶于1000ml水中 ； 250ml三角瓶中分装50ml培养 基后灭菌 ； 活化好的明串珠菌菌种以 1% 接菌量加 入到培养基中， 于 30 120 转 / 分振荡养16 18 小时 ； 培养液经10000转/分离心10分钟， 去除沉 淀(菌体)， 往上清液中加入等量的乙醇， 经12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除沉淀 ( 葡聚糖 )， 将上。

3、清 液在 4结晶而获得甘露醇 ； 从而有效地降低了 培养基的成本。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103667367 A CN 103667367 A 1/1 页 2 1. 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 其特征在于具体步骤如下 ： （1） 以红糖为碳源制备培养基 ： （1.1） 准备原料 准确称取红糖 19 21 克、 酵母浸粉 1.9 2.1 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬 酸铵 2 克备用 ； 。

4、（1.2） 调配与溶化 磁力搅拌器上放置装 300ml 水的烧杯， 将步骤 （1.1） 称取的原料加入到烧杯的水中， 充 分溶化后补加 700ml 水， 即制成培养基 ； （1.3） 分装与灭菌 在 250ml 三角瓶中加入步骤 （1.2）制备的培养基 50ml 后封口， 置于高压灭菌锅中 121灭菌 20 分钟 ； （2） 明串珠菌发酵产甘露醇 （2.1） 活化菌种 将明串珠菌以 1% 接菌量加入到 50ml 三角瓶内的 10ml MRS 培养基中， 振荡培养 12 16 小时 ； （2.2） 接菌 在超净工作台将步骤 （2.1）活化好的菌种以 1% 接菌量加入到步骤 （1.3）灭菌后的 2。

5、50ml 三角瓶内的 50ml 培养基中 ； （2.3） 培养 将步骤 （2.2） 接菌后的三角瓶置于摇床中， 在 30下以 120 转 / 分的速度振荡培养 16 18 小时， 得培养液 ； （2.4） 分离纯化 将步骤 （2.3） 制得的培养液经 10000 转 / 分离心 10 分钟， 去除菌体沉淀得上清液 A ； 在 上清液 A 中加入等量的乙醇， 经 12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除葡聚糖沉淀得上清液 B， 将 上清液 B 在 4结晶即制得甘露醇。 权 利 要 求 书 CN 103667367 A 2 1/5 页 3 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法 技术领域 0。

6、001 本发明涉及发酵生产甘露醇技术领域， 具体地说是涉及以红糖为碳源制备培养基 以及应用该培养基通过明串珠菌发酵产甘露醇的方法。 背景技术 0002 甘露醇被广泛的应用于医药、 食品、 化工和电子等行业。 全球甘露醇消费量约占多 元醇总量的 11%， 每年约为 15 万吨。美国是甘露醇的最大消费国。其它如欧洲国家， 用于生 产口香糖、 口含片、 嘴嚼片的用量均较大。 我国目前甘露醇消费主要是直接用于生产甘露醇 注射液、 药品辅助添加剂和无糖型食品添加剂等。由于食品行业尤其是口香糖对甘露醇需 求量快速增加， 甘露醇市场容量迅速扩大。 甘露醇在医药行业用量较大， 目前我国仅甘露醇 注射液每年就要。

7、消耗甘露醇 4500 吨， 2003 年医药行业消费甘露醇 5600 吨。近年来我国肥 胖和糖尿病较为严重， 而且有越来越严重的趋势， 因此对无糖并具有营养的甜味剂甘露醇 需求潜力巨大， 2004 年我国食品及其添加剂领域对甘露醇的需求量约 3000 吨。 0003 目前生产甘露醇的方法主要有四种 ： 0004 (1)海藻提取法 ： 提取1吨甘露醇约需1315吨干海带， 生产过程产生大量废水， 能耗高， 污染严重， 收率低 ； 0005 (2) 催化加氢法 ： 以蔗糖或葡萄糖为原料的催化加氢法具有原料来源稳定， 生产 期限不受限制， 成本低， 但是其产率较低， 且有山梨醇伴生 ； 0006 (。

8、3) 酶转化法 ： 酶法氢化须要在体系中加入价格昂贵的辅酶， 不经济 ； 0007 (4) 微生物发酵法 ： 自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多， 细菌、 酵母和霉菌 中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。 在乳酸菌转化甘露醇的过程中， 甘露醇为主要产物， 同时产乳酸、 乙酸、 乙醇和二氧化碳， 而不产生其它多元醇等副产物， 因而易于纯化分离及 精制， 并且条件温和、 转化率较高。同时乳酸菌是一种相对安全的菌种， 用乳酸菌来生产甘 露醇的研究有着明显的优势。目前， 微生物发酵法处于实验室研究阶段。 发明内容 0008 本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷， 而提供一种以红糖为碳源的制 备培。

9、养基和明串珠菌应用该培养基发酵产甘露醇的方法 ； 该培养基是根据红糖的成分改进 MRS 培养基而制成的， 降低了培养基的成本， 缩短了发酵时间， 从而克服了微生物发酵法生 产甘露醇的瓶颈问题。 0009 本发明解决该技术问题所采用的技术方案是 ： 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露 醇的方法， 其特征在于具体步骤如下 ： 0010 （1） 以红糖为碳源制备培养基 ： 0011 （1.1） 准备原料 0012 准确称取红糖 19 21 克、 酵母浸粉 1.9 2.1 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬酸铵 2 克备用 ； 说 明 书 CN 103667367 A 3 2/5 页 4 。

10、0013 （1.2） 调配与溶化 0014 磁力搅拌器上放置装 300ml 水的烧杯， 将步骤 （1.1） 称取的原料加入到烧杯的水 中， 充分溶化后补加 700ml 水， 即制成培养基 ； 0015 （1.3） 分装与灭菌 0016 在 250ml 三角瓶中加入步骤 （1.2） 制备的培养基 50ml 后封口， 置于高压灭菌锅中 121灭菌 20 分钟 ； 0017 （2） 明串珠菌发酵产甘露醇 0018 （2.1） 活化菌种 0019 将明串珠菌以 1% 接菌量加入到 50ml 三角瓶内的 10ml MRS 培养基中， 振荡培 养 12 16 小时 ； 所述明串珠菌的分类命名为肠膜明串珠菌。

11、， 拉丁文学名是 Leuconostoc mesenteroides, 保藏人与 2009 年 12 月 31 日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 ( ) 进行保藏， 保藏单位根据保藏人的申请于 2013 年 9 月 18 日出具 存活证明。 0020 （2.2） 接菌 0021 在超净工作台将步骤 （2.1） 活化好的菌种以 1% 接菌量加入到步骤 （1.3） 灭菌后的 250ml 三角瓶内的 50ml 培养基中 ； 0022 （2.3） 培养 0023 将步骤 （2.2） 接菌后的三角瓶置于摇床中， 在 30下以 120 转 / 分的速度振荡培 养 16 18 小时， 得培。

12、养液 ； 0024 （2.4 分离纯化 0025 将步骤 （2.3） 制得的培养液经 10000 转 / 分离心 10 分钟， 去除菌体沉淀得上清液 A ； 在上清液 A 中加入等量的乙醇， 经 12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除葡聚糖沉淀得上清液 B， 将上清液 B 在 4结晶即制得甘露醇。 0026 上述步骤 （2） 中明串珠菌发酵产甘露醇的工艺中， 所用到的试剂由供应商提供， 成分均是公知的 ； 所涉及到的设备和工艺操作方法均为本技术领域技术人员所公知的。需 要说明的， 本发明所用的明串珠菌的分类命名为肠膜明串珠菌， 拉丁文学名是 Leuconostoc mesenteroi。

13、des ； 保藏日期为2009年12月31日， 保藏单位全称是中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心 ； 保藏编号 ： CGMCC1.10327。 0027 本发明的有益效果是 ： 0028 （1） 与海藻提取法、 催化加氢法、 酶转化法相比， 本发明的特别之处在于 ： 通过乳酸 细菌专一性地产生甘露醇这一主产物， 因此生产过程是环境友好的， 符合产业发展方向 ； 0029 （2） 与现有微生物发酵法生产甘露醇的技术相比， 本发明的以红糖为碳源明串珠 菌发酵产甘露醇的方法与以蔗糖或果糖、 葡萄糖为碳源发酵乳酸细菌生产甘露醇的方法相 比， 有效地降低了培养基的成本。这是因为红糖是从甘蔗或甜。

14、菜中粗提的产物， 价格较低 ； 蔗糖是高纯度的化工原料， 蔗糖或果糖、 葡萄糖的价格相对要高 ； 相比于现有技术中以蔗糖 为原料明串珠菌发酵生产甘露醇的工艺， 本发明的原料组成中去除了蛋白胨、 酵母浸粉的 用量减少很多， 因此制备成本便降低很多。 0030 生物材料保藏说明 0031 分类命名 ： 肠膜明串珠菌 说 明 书 CN 103667367 A 4 3/5 页 5 0032 拉丁文学名 ： Leuconostoc mesenteroides ； 0033 保藏日期 ： 2009 年 12 月 31 日 0034 保藏单位全称 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0035 保。

15、藏单位简称 ： 0036 保藏编号 ： 1.10327 具体实施方式 0037 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解， 此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。 0038 实施例 1 0039 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 其步骤如下。 0040 第一步， 准备原料 0041 准确称取红糖 19 克、 酵母浸粉 1.9 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬酸铵 2 克 ； 0042 第二步， 调配与溶化 0043 磁力搅拌器上放置装 300ml 水的烧杯， 按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水 中， 充分溶化后补加 700ml。

16、 水。 0044 第三步， 分装与灭菌 0045 250ml 三角瓶中加入 50ml 培养基后封口， 置于高压灭菌锅中 121灭菌 20 分钟。 0046 第四步， 活化菌种 0047 于零下80冰箱保存的菌种， 以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基 中， 振荡培养 14 小时。 0048 第五步， 接菌 0049 在超净工作台将活化好的菌种以 1% 接菌量加入到 250ml 三角瓶的 50ml 培养基 中。 0050 第六步， 培养 0051 接好菌的三角瓶置于摇床中， 于 30 120 转 / 分振荡养 18 小时。 0052 第七步， 分离纯化 0053 培养液经10。

17、000转/分离心10分钟， 去除沉淀(菌体)， 往上清液中加入等量的乙 醇， 经 12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除沉淀 ( 葡聚糖 )， 将上清液在 4结晶而获得甘露醇。 0054 实施例 2 0055 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 其步骤如下。 0056 第一步， 准备原料 0057 准确称取红糖 21 克、 酵母浸粉 2.1 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬酸铵 2 克。 0058 第二步， 调配与溶化 0059 磁力搅拌器上放置装 300ml 水的烧杯， 按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水 中， 充分溶化后补加 700ml 水。 0060 第。

18、三步， 分装与灭菌 说 明 书 CN 103667367 A 5 4/5 页 6 0061 250ml 三角瓶中加入 50ml 培养基后封口， 置于高压灭菌锅中 121灭菌 20 分钟。 0062 第四步， 活化菌种 0063 于零下80冰箱保存的菌种， 以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基 中， 振荡培养 13 小时。 0064 第五步， 接菌 0065 在超净工作台将活化好的菌种以 1% 接菌量加入到 250ml 三角瓶的 50ml 培养基 中。 0066 第六步， 培养 0067 接好菌的三角瓶置于摇床中， 于 30 120 转 / 分振荡养 18 小时。 0068 。

19、第七步， 分离纯化 0069 培养液经10000转/分离心10分钟， 去除沉淀(菌体)， 往上清液中加入等量的乙 醇， 经 12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除沉淀 ( 葡聚糖 )， 将上清液在 4结晶而获得甘露醇。 0070 实施例 3 0071 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 其步骤如下。 0072 第一步， 准备原料 0073 准确称取红糖 20 克、 酵母浸粉 2 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬酸铵 2 克。 0074 第二步， 调配与溶化 0075 磁力搅拌器上放置装 300ml 水的烧杯， 按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水 中， 充分溶化。

20、后补加 700ml 水。 0076 第三步， 分装与灭菌 0077 250ml 三角瓶中加入 50ml 培养基后封口， 置于高压灭菌锅中 121灭菌 16 分钟。 0078 第四步， 活化菌种 0079 于零下80冰箱保存的菌种， 以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基 中， 振荡培养 14 小时。 0080 第五步， 接菌 0081 在超净工作台将活化好的菌种以 1% 接菌量加入到 250ml 三角瓶的 50ml 培养基 中。 0082 第六步， 培养 0083 接好菌的三角瓶置于摇床中， 于 30 120 转 / 分振荡养 18 小时。 0084 第七步， 分离纯化 00。

21、85 培养液经10000转/分离心10分钟， 去除沉淀(菌体)， 往上清液中加入等量的乙 醇， 经 12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除沉淀 ( 葡聚糖 )， 将上清液在 4结晶而获得甘露醇。 0086 实施例 4 0087 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法， 其步骤如下。 0088 第一步， 准备原料 0089 准确称取红糖 21 克、 酵母浸粉 1.9 克、 乙酸钠 5 克、 磷酸氢二钾 2 克、 柠檬酸铵 2 克， 溶于 1000ml 水中。 0090 第二步， 调配与溶化 0091 磁力搅拌器上放置装 300ml 水的烧杯， 按照第一步中准备的原料加入到烧杯的水 说 明。

22、 书 CN 103667367 A 6 5/5 页 7 中， 充分溶化后补加 700ml 水。 0092 第三步， 分装与灭菌 0093 250ml 三角瓶中加入 50ml 培养基后封口， 置于高压灭菌锅中 121灭菌 20 分钟。 0094 第四步， 活化菌种 0095 于零下80冰箱保存的菌种， 以1%接菌量加入到50ml三角瓶的10ml MRS培养基 中， 振荡培养 15 小时。 0096 第五步， 接菌 0097 在超净工作台将活化好的菌种以 1% 接菌量加入到 250ml 三角瓶的 50ml 培养基 中。 0098 第六步， 培养 0099 接好菌的三角瓶置于摇床中， 于 30 12。

23、0 转 / 分振荡养 17 小时。 0100 第七步， 分离纯化 0101 培养液经10000转/分离心10分钟， 去除沉淀(菌体)， 往上清液中加入等量的乙 醇， 经 12000 转 / 分离心 15 分钟， 去除沉淀 ( 葡聚糖 )， 将上清液在 4结晶而获得甘露醇。 0102 硫酸镁和硫酸锰是在发酵过程中必需的成分， 但本专利中使用了红糖就不用添加 硫酸镁和硫酸锰， 这是因为红糖中都含有镁离子和锰离子。经过测定， 实施例 1-4 中发酵所 获得的甘露醇含量如表 1 所示。 0103 表 1 实施例 1-4 所获得的甘露醇含量 0104 项目实施例 1实施例 2实施例 3实施例 4 甘露醇含量7.18g/L7.21g/L7.30g/L7.25g/L 0105 上述实施例14中， 所述红糖、 酵母浸粉、 乙酸钠、 磷酸氢二钾和柠檬酸铵由供应 商提供， 成分均是公知的 ； 所用的菌种是本公司保存的 ； 所涉及到的设备和工艺操作方法 均为本技术领域技术人员所公知的。 0106 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出的是， 对于本技术领域的普通技 术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103667367 A 7 。