花生抗黄曲霉侵染室内检测方法.pdf

一种花生抗黄曲霉侵染的室内检测方法，其包括如下步骤：花生收获种子干燥至含水量8～10％，将黄曲霉菌株配成浓度为0.05～1×108个/mL的孢子悬浮液；将于燥花生种子用常规方法灭菌并用无菌水漂洗使种子含水量恢复至15～20％；花生种子采用种皮横向环割和在籽粒直径最大处垂直子叶截面均匀钻孔方法创造伤口，用于黄曲霉菌侵染；将滤纸放入培养皿后加入所述孢子悬浮液润湿，将经上述处理后的花生种子浸入孢子悬浮液中3～5min，种子取出后用无菌滤纸将表面吸干后置于所述培养皿的滤纸上，随后盖上皿盖置于培养箱中培养5～6天，培养条件是湿度80～90％、湿度28～30℃；根据花生籽粒表面和孔内感染黄曲霉菌结果对抗性进行评价。

1.  一种花生抗黄曲霉侵染的室内检测方法，其包括如下步骤：
花生收获种子干燥至含水量8～10％，将黄曲霉菌株配成浓度为0.05～1×10⁸个/mL的孢子悬浮液；
将干燥花生种子用常规方法灭菌并用无菌水漂洗使种子含水量恢复至15～20％，在花生种子上创造伤口；
将滤纸放入培养皿后加入所述孢子悬浮液润湿，将经上述处理后的花生种子浸入孢子悬浮液中3～5min，种子取出后用无菌滤纸将表面吸干后置于所述培养皿的滤纸上，随后盖上皿盖置于培养箱中培养5～6天，培养条件是湿度80～90％、温度28～30℃；
根据花生籽粒表面和孔内感染黄曲霉菌结果对抗性进行评价。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收获的花生种子干燥至含水量9～10％。

3.  如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述花生种子资源收获后，利用7～9天太阳的照射和空气的流动将荚果中水分蒸发，如果遇阴雨天气则利用干燥机械在35～40℃范围内加速水分散发，干燥后室温下保存。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述创造伤口的方法包括采用种皮横向环割和在籽粒直径最大处垂直子叶截面均匀钻孔方法。

5.  如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述黄曲霉菌株在察氏培养基中于电热恒温培养箱28-30℃培养7天后，在超净工作台用无菌水配成浓度为0.05-1×10⁸/mL的孢子悬浮液。

6.  如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述察氏培养基包括硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，去离子水(ddH₂O)定容至1000mL。

7.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述干燥花生种子用0.8％的HgCl₂溶液灭菌6～8min，并用无菌水漂洗3～4次。

8.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养条件是湿度85～90％、温度29～30℃。

花生抗黄曲霉侵染室内检测方法
发明领域
本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种花生抗黄曲霉侵染的室内快速、高效检测方法。
背景技术
花生是世界上五大油料作物之一，也是我国重要的油料作物和经济作物。黄曲霉毒素是黄曲霉侵染花生后产生的次级代谢产物，可使人类和多种动物诱发实验性肝癌，是目前已发现的最强的化学致癌物。黄曲霉侵染花生所导致的黄曲霉毒素污染是影响我国花生生产、加工和贸易的主要因素。更为严重的是95％用于国内消费的花生黄曲霉毒素污染的严重程度远高于出口的花生，对国内消费者的健康构成严重威胁，这都成为我国花生产业长远发展的限制因素。
黄曲霉属子囊菌纲、散囊菌目、曲霉属，也有人仍将其列为半知菌纲的丛梗孢目。菌丝体由许多复杂的分枝菌丝构成，菌丝具横隔。由气生菌丝形成的分生孢子梗，顶端膨大为顶囊，顶囊上产生许多小梗，小梗有单层与双层之分，小梗顶端着生成串的圆球形的分生孢子。大量分生孢子的产生，使得整个菌落呈现黄绿色。
在自然条件下，黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2，以后又发现这类毒素在动物体内的代谢产物，如黄曲霉毒素M1、M2、GM1和P1等。黄曲霉毒素的毒性是已知100余种霉菌毒素中毒性最大的毒物之一，其中尤以黄曲霉毒素B1产量最高、毒性最大、致癌性最强。实验表明，雄性大白鼠半数致死量为7.2毫克/公斤，雌性为7.9毫克/公斤。国内外均有因食用霉变食品引起人类中毒的报道。如1974年印度西部曾发生一次急性黄曲霉毒素中毒事件。居民吃了发霉(黄曲霉菌感染)的玉米后，有397人发生急性中毒肝炎，死亡106人。还有成批的狗发生腹水和黄疸，多在2～3周内死亡。该毒素中毒的症状主要为发热、呕吐、食欲不佳，继而出现黄疸，重者可出现腹水。动物实验表明，长期摄入低浓度黄曲霉毒素或短期摄入高浓度后均可诱发肝癌。
由于黄曲霉菌侵染粮食作物，其产生的毒素能引起人畜中毒及诱发肝癌，那么怎样才能避免它的危害呢？首先要控制黄曲霉菌生长繁殖所需的温度、湿度及氧气等条件，避免黄曲霉菌的侵染。这里最有意义的方法是控制粮食的含水量，即粮食收获后及时晒干，降低其含水量(如稻谷含水量低于30％，玉米低于12.5％等)。最易霉变的花生还应注意其外壳的完整。其次是已经发生黄曲霉菌感染，应及时采取适当措施来解决。如为花生，则应及时拣去霉粒，霉粒不可再食；如为大米，因毒素仅存于表层，食用前应于水中搓洗干净；如为玉米，因毒素存于胚部，应碾轧数次以脱胚；如为食用油，应加适量碱，使毒素的六碳环内酯打开形成水溶性的香豆素钠盐，可弃去。黄曲霉毒素的危害作用，已经引起国内外的普遍重视。1966年世界卫生组织规定，食品中黄曲霉毒素最高限量为30微克/公斤。我国规定的最高限量是：(单位：微克/公斤)玉米、花生油、花生及其制品为20；大米及其它食用油为10；其它粮食、豆类食品为5，但婴儿代乳食品不得检出。
研究表明，黄曲霉菌侵染花生种子，其种皮起着重要的保护作用。花生种皮完整性对提高抗性极为有利，花生的种皮成分与黄曲霉抗性密切相关。花生种子抗黄曲霉侵染首先要求具有完整无缺的荚壳和种皮。显微和超显微观察显示，抗感品种间种皮的结构存在较大的差异，即抗性品种的种皮具较厚细胞壁，表皮细胞间结合紧密，栅栏细胞层较密和厚，裂缝和孔较少等，而感病品种的种皮细胞壁相对较薄，细胞间结合较疏松，裂缝和气孔较大。常规的黄曲霉侵染方法存在侵染时间长、侵染率低、成本高等缺点。国内现有的花生品种抗黄曲霉侵染室内鉴定方法基本主要的缺点是耗时长、效率低、不利于大批量花生种子资源的抗性鉴定。
发明内容
(发明目的)本方法的目的是通过对不同花生品种资源进行抗黄曲霉侵染鉴定，解决当前黄曲霉菌侵染检测过程中成本高、侵染时间长、效率低等问题，实现快速检测花生抗黄曲霉侵染鉴定，为筛选鉴定抗黄曲霉花生种子资源奠定基础。
(技术方案)本发明提供一种花生抗黄曲霉侵染的室内快速、高效检测方法，其包括如下步骤：
花生收获种子干燥至含水量8～10％，将黄曲霉菌株配成浓度为0.05～1×10⁸个/mL的孢子悬浮液；
将干燥花生种子用常规方法灭菌并用无菌水漂洗使种子含水量恢复至15～20％；花生种子采用种皮横向环割和在籽粒直径最大处垂直子叶截面均匀钻孔方法创造伤口，用于黄曲霉菌侵染；
将滤纸放入培养皿后加入所述孢子悬浮液润湿，将经上述处理后的花生种子浸入孢子悬浮液中3～5min，种子取出后用无菌滤纸将表面吸干后置于所述培养皿的滤纸上，随后盖上皿盖置于培养箱中培养5～6天，培养条件是湿度80～90％、湿度28～30℃；
根据花生籽粒表面和孔内感染黄曲霉菌结果对抗性进行评价。
本发明检测方法要求花生种子具有一定的新鲜程度，要求黄曲霉菌侵染时花生籽粒含水量为8～10％及收获后及时自然风干或常温机器干燥的新鲜种子，另外，黄曲霉菌侵染花生所需要的环境温度是28-30℃，环境湿度是80-90％的环境湿度。
与现有的现有的花生抗黄曲霉菌侵染鉴定方法不同的是，本发明采用种皮横向环割以及垂直子叶平面径向钻孔方式进行黄曲霉菌侵染，不仅加快了黄曲霉侵染进程，更重要的是可以达到花生种皮与籽仁内部同时进行抗性鉴定目的。
根据本发明的一个优选实施方式，所述收获的花生种子干燥至含水量9～10％。
根据本发明的一个优选实施方式，所述花生种子资源收获后，利用7～9天太阳的照射和空气的流动将荚果中水分蒸发，如果遇阴雨天气则利用干燥机械在35～40℃范围内加速水分散发，干燥后室温下保存。
根据本发明的一个优选实施方式，所述黄曲霉菌株在察氏培养基中于电热恒温培养箱28-30℃培养7天后，在超净工作台用无菌水配成浓度为0.05-1×10⁸/mL的孢子悬浮液。
根据本发明的一个优选实施方式，所述察氏培养基包括硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，去离子水(ddH₂O)定容至1000mL。
根据本发明的一个优选实施方式，将所述干燥花生种子用0.8％的HgCl₂溶液灭菌6～8min，并用无菌水漂洗3～4次。
根据本发明的一个优选实施方式，所述培养条件是湿度85～90％、湿度29～30℃。
(发明效果)本发明的优点是：减少了黄曲霉菌侵染通过花生种皮的限制，缩短侵染时间2～3天，减少黄曲霉菌孢子悬浮液使用量30％～40％，提高检测效率，降低了黄曲霉菌对检测人员的污染风险，尤其针对大批量花生种子资源的抗黄曲霉侵染快速鉴定。
具体实施方式
供试花生种子资源收获后，利用7～9天太阳的照射和空气的流动将荚果中水分蒸发，如果遇阴雨天气则利用干燥机械在35～40℃范围内加速水分散发至含水量8～10％，室温下保存；
黄曲霉菌株(Aspergillus Flavus)用无菌水配成浓度为0.05～1×10⁸个/mL的孢子悬浮液；
将干燥花生种子用0.8％的HgCl₂溶液灭菌6～8min，并用无菌水漂洗3～4次，种子含水量恢复至15～20％。花生种子采用种皮横向环割和在籽粒直径最大处垂直子叶截面均匀钻孔方法创造伤口，用于黄曲霉菌侵染；
121℃高压灭菌培养皿和滤纸，将滤纸放入培养皿后加入孢子悬浮液润湿，将处理后花生籽粒浸入孢子悬浮液中3～5min，取出种子并用无菌滤纸将种子表明吸干，置于培养皿中的滤纸上，盖上皿盖置于培养箱中保持80～90％湿度、28～30℃培养5～6天；
根据花生籽粒表面和孔内感染黄曲霉菌结果对抗性进行评价。
优选实施例
实验材料：
花生材料：高抗黄曲霉侵染花生种子J11和高感黄曲霉品种金花1012；
供试菌株及培养：黄曲霉菌株为本实验室保存。菌株在察氏培养基(硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，去离子水(ddH₂O)定容至1000mL。)于电热恒温培养箱28-30℃培养7天后，在超净工作台用无菌水配成浓度为0.05-1×10⁸/mL的孢子悬浮液。
实验方法：
对根据上述方法所得花生种子表面和孔内感染黄曲霉菌结果对抗性进行评价。
表1 不同鉴定方法抗黄曲霉鉴定效果比较(2006年)

由表1、2中看出，改良技术在用时、鉴定每个品种所用孢子悬浮液使用量以及准确率方面均优于常规鉴定技术。
表2 不同鉴定方法抗黄曲霉鉴定效果比较(2007年)