技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，是一种提高植物耐盐性的棉花GarCIPK基因。
背景技术
土壤盐渍化是当今全球性的资源环境问题和生态问题。据统计，全世界约有10亿公顷的土地存在不同程度的盐渍化， 占世界陆地总面积的约10%，而我国就有近一亿公顷盐渍化土地，随着经济的发展，工业污染的加剧, 不合理的灌溉和化肥施用不当等原因, 次生盐渍化土壤面积在逐年扩大,使农业可持续发展受到严重阻碍。改良利用、综合治理盐渍土，培育耐盐新品种以提高植物耐盐性已成为发展未来农业及环境治理的重大课题。因此，探讨盐适应机理、挖掘耐盐功能基因、培育耐盐新品种以提高植物抗盐性具有重要的理论意义。
利用转基因技术将具有优良性状的基因转入植物中，以此开发高效的转基因新品种具有广阔的应用前景。一些研究已表明将植物本身及其他植物中耐盐相关基因转入植物中，通过转录表达可以提高转基因植物的耐盐性。
CIPK与CBL有效结合形成CBL-CIPK复合体，参与Ca2 + 信号系统应答逆境胁迫，将信号传递到终端调控下游的胁迫相应基因的表达，最终使植物体内某种胁迫达到平衡。目前，已鉴定出部分CBL-CIPK信号系统的成员，并在一些模式植物的研究中解析了该信号网络在植物应答逆境胁迫的功能，但棉花中的相关研究较少。
发明内容
本发明提供一种提高植物耐盐性的棉花蛋白磷酸激酶CIPK类蛋白基因GarCIPK，所述基因cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的提高植物耐盐性的棉花GarCIPK基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
本发明提供了含有上述棉花蛋白磷酸激酶基因GarCIPK的植物表达载体pCAMBIA2301。将棉花蛋白磷酸激酶基因GarCIPK克隆到pCAMBIA2301，获得pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK。
本发明所述基因GarCIPK在培育耐盐植物中的应用。所述植物优选是烟草。
本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR技术，分离与鉴定棉花耐盐相关基因序列信息，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过耐盐表型鉴定证明转基因植株的耐盐力明显提高。
附图说明
图1 GarCIPK基因全长cDNA序列的扩增结果
图2、3实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）分析盐处理不同时期GarCIPK基因在叶片和根中的表达情况
图4植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301- RD29A-GarCIPK的构建
（a）大肠杆菌pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK PCR检测电泳结果；（b）大肠杆菌pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK PCR检测电泳结果；（c）pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK的酶切鉴定；（d）pCAMBIA2301 -RD29A-GarCIPK质粒酶切鉴定
图5 转基因植株的PCR鉴定
(a) PCR 扩增载体pCAMBIA2301-CaMV35S-CIPK抗性烟草目的基因；(b) PCR 扩增载体pCAMBIA2301-RD29A-CIPK抗性烟草目的基因
图6 转基因烟草及野生型对照在不同浓度NaCl处理下的生长
（a）、（b）、（c）：生长在含不同浓度NaCl的MS培养基上
图7根系长度的测量 NaCl 条件下，25°C 培养第 10 天的根长表现。此图表示0mM、 150mM 和 200mM NaCl 条件下野生型和转基因株系萌发率的统计分析
具体实施方式
实施实例1、GarCIPK基因的获得
1.1 RNA的提取
提取RNA
（1）取0.5g新鲜棉花组织，加入0.1g交联聚乙烯砒咯烷酮（PVPP），在液氮中充分研磨至粉末，将冻粉末迅速转入10ml离心管中，加5ml CTAB提取液与500μL0.1M pH8.0的Tris-HCl，65℃水浴20min，中途翻转混匀；
（2）加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10min；
（3） 4℃，10000rpm 离心20min。分装于4个1.5ml离心管；
（4） 吸上清，加入1/3体积的8M LiCl混匀，-70℃ 30min或-20℃过夜；
（5） 4℃，10000rpm 离心20min。弃上清，70%乙醇洗涤两次后，吹干沉淀溶解于30μL DEPC水；
（6）加入10U无RNase活性的DNase和25U RNase Inhabitor，10×buffer消化30min后加等体积氯仿，抽提一次；
（7）上清转移到新管中，加1/10体积的3M pH 5.2 NaAc和等体积的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜或-70℃ 冰浴3h；
（8） 4℃，10000rpm 离心20min，弃上清，70%乙醇洗涤两次后溶解于30μL DEPC水。即得棉花RNA。
1.2 cDNA的合成
体系:
cDNA第一链的合成
模板（上述无DNA污染的RNA 100ng） 6 μL
OligdT 通用引物（50μM） 1 μL
dNTP（10mM） 2 μL
RNase抑制剂（40U/μL ） 0.5 μL
DEPC水 6 μL
65 °C（10 min）→ 冰上放置（2 min）
M-MLV(反转录酶，takara，200U μL -1 ) 0.5 μL
5×buffer 4 μL
42 °C（2h）→ 70 °C （10min）→ 4 °C
1.3 cDNA克隆
根据本实验室旱地棉转录组测序获得的约576bp蛋白磷酸激酶特异序列(SEQ ID NO.9)为探针，利用电子克隆的方法，NCBI在线分析获得一系列同源EST(NP_851258.2 、BAB11035.1、ABF99892.1、AAB65477.1、AAA02840.1、AAB65483.1、AAM13129.1、AAM60822.1、AAP68289.1)。拼接序列，经基因预测，然后用软件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf /gorf. html）预测完整ORF。
在ORF 序列两侧设计上游引物5’- GATGGTG GTGAGA AAAGTAGGGAA GTA-3’（ SEQ ID NO.3）和下游引物5’- CAGGTCAACGT- CTTTTA CTCCTAGA – 3’ （SEQ ID NO.4），用旱地棉cDNA(由步骤1.2合成的)进行RT-PCR，得到包含整个编码框的GarCIPK cDNA克隆，全长1350bp（图1）。回收该片段，克隆至T-载体中鉴定、测序。测序结果经Blast比对，证明所扩序列正确，与电子克隆序列相比，序列相似度为97.34%。
1.3.1 PCR反应体系（20μL）
cDNA 1μL
10×PCR buffer 2μL
MgCl2(10mmol/L) 1.6μL
10mM dNTP 0.4μL
Primer1(10μM) 1μL
Primer1(10μM) 1μL
rTaq 0.2μL
ddH2O 12.8μL
1.3.2 PCR扩增程序：94℃ 5min ；94℃ 30sec,55℃ 45sec, 72℃ 1 min30sec, 36个循环；72℃ 10 min；4℃保温。
C、扩增得到该基因的ORF序列，回收扩增产物，并克隆到PTG19-T载体，筛选阳性克隆， 测序由上海英俊公司完成。
1.4 基因表达分析（qRT-PCR）
1.4.1 盐胁迫下RNA的提取
材料棉属野生种旱地棉，将旱地棉种子播于盆钵中，待长至约20cm的小苗从土中取出，洗去根上的泥土，将苗浸在含200 mM NaCl溶液（其中CNa+ : CCa2+为15:1）的营养液中，按不同的处理时间处理小苗（0h、1h、3h、6h、12h、24h、36 h 、48 h 、72h），分别取叶片、根，提取RNA，方法同上。
1.4.2 逆转录（RT）产生cDNA
方法同上。
1.4.3 PCR反应
① 以cDNA为模板，引物为
GarCIPK-RT-F：5‘-CGAAAGCGTTGCCATGAAAGTCCTC-3’（ SEQ ID NO.5）
GarCIPK-RT-R：5‘-GCTTCCGCTTCACTAAGACGACCTT-3’（ SEQ ID NO.6）
②PCR反应体系：
SYBR Premix Ex Taq（2×） 10μL
GarCIPK-RT-F（10μM） 0.4μL
GarCIPK-RT-R（10μM） 0.4μL
ROX Reference Dye ll (50×) 0.4μL
cDNA 2.0μL
ddH2O 6.8μL
③ PCR程序：
将PCR反应的组分别加于qRT-PCR专用 96-孔板（Applied Biosystems）中，加盖专用的高透光率封口膜（Applied Biosystems），用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System）进行 qRT-PCR，采用两步法PCR扩增标准程序：95℃30 sec；95℃40 sec，60℃ 30 sec共40个循环；95℃ 15sec , 60℃ 1min, 95℃ 15 sec。
每个样品三次重复。
反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，可以通过溶解曲线分析确认PCR反应大的特异性。计算CT值，结果见图2、3。
实施例2、植物表达载体的构建
2.1 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK植物表达载体的构建
植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S(购自Biovector Science Lab)质粒，选用BamHⅠ和KnpⅠ分别对pCAMBIA2301和目的基因片段进行酶切，回收载体大片段和目的基因片段，用T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。
pCAMBIA2301质粒和目的基因片段的酶切
质粒双酶切体系如下：
10×K buffer 5μL
2301质粒 25μL
BamHⅠ 0.5μL
KnpⅠ 0.5μL
无菌dd H2O 19μL
于30℃酶切5h。双酶切后琼脂糖凝胶对双酶切产物进行电泳检测，结果见图3。
GarCIPK片段双酶切体系：
10×K buffer 5μL
纯化的GarCIPK PCR产物 30μL
BamHⅠ 1μL
KnpⅠ 1μL
无菌dd H2O 13μL
30℃酶切12h
回收pCAMBIA2301载体大片段和目的基因片段。
2.1.1 基因与酶切得到的pCAMBIA2301大片段的连接
连接反应体系：
pCAMBIA2301 5μL
CIPK片段双酶切产物 3μL
10×ligase buffer 1μL
T4 DNA ligase 1μL
4℃连接过夜或16℃连接2h。
2.1.2 转化大肠杆菌
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含Amp100mg/l的LB液体培养基中37℃振荡培养。
2.1.4 重组子的鉴定
① PCR鉴定
挑取单菌落接种于1.5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养，用GarCIPK基因特异性引物GarCIPK-F-BamHI：5’CGCGGATCCGATGGTGGTGAGAAAAGTAGGGAAGTA3’ （ SEQ ID NO.7）和GarCIPK-R-KpnI:5’-GGGGTACCCAGGTCAACGTCTT TTACTCCTAGA-3’ （ SEQ ID NO.8）进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下：：94℃ 5min ; 94℃ 30sec,55℃ 45sec, 72℃ 1 min30sec, 36个循环；72℃ 10 min；4℃保温。
② 质粒的酶切鉴定
用碱变性法提取质粒，选取BamHⅠ和KnpⅠ酶进行酶切，酶切体系同上，琼脂糖凝胶电泳检测是否有预期片段。
2.2 pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK植物表达载体的构建
植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S(购自Biovector Science Lab)表达载体含有CaMV35S和NPTⅡ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶KnpⅠ和XbaⅠ位点。分别用KnpⅠ和XbaⅠ双酶切载体pCAMBIA2301-CaMV35S和RD29A片段，将切除CaMV35S启动子的pCAMBIA2301载体与RD29A酶切片段连接，获得pCAMBIA2301-RD29A载体。再用pCAMBIA2301-RD29A与GarCIPK基因片段构建植物表达载体pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK，方法同上，结果见图4。
实施例3、农杆菌感受态的制备与转化
3.1 农杆菌EHA105感受态的制备
（1）挑取EHA105单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4；
（2）以1：100接种于400-500ml LB培养基中（1L三角瓶中），摇菌至OD600为0.6-0.8，冰浴10min；
（3）预冷的50ml离心管中收集菌液，4℃，5000rpm，离心5min；
（4）弃上清，沉淀用10ml 预冷的0.1MCaCl2充分悬浮，4℃，5000rpm，离心5min；
（5）加4ml（根据菌体多少而定）预冷含15%0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；
（6）分装成100μL-200μL每管，液氮速冻，置于-80℃备用。
3.2农杆菌EHA105的热激转化
（1）-80℃冰箱中取出感受态，冰上冻融；
（2）分别取1-2μL重组质粒至EHA105热激感受态中，轻打混匀，冰浴5min;
（3）然后用液氮冻8min，再置于37℃5min,；
（4）冰上静置2min后,加入800LB培养液，28℃震荡培养4h；
（5）离心30s，收集菌液，弃去600ml上清，剩下的上清用来重悬菌块，用玻璃棒涂布固体LB培养基平板（含Kan 50mg/L, Rif 50mg/L），28℃，倒置培养48h。
3.3 菌体PCR鉴定
菌体PCR方法及程序同上(同步骤2.1.4)。
实施例4、转化烟草及转基因功能验证
4.1 叶盘化法侵染烟草
4.1.1侵染
从烟草幼苗上摘取完全展开的叶片，置于70%乙醇中浸泡1min，0.1%的升汞中消毒3min，再用无菌水冲洗4-5遍，无菌滤纸吸干表面的水分后，用灭过菌的剪刀将叶片剪成1cm见方的小块；将剪好的叶片分别放入工程菌液pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK中侵染5min，期间不停的摇晃菌液，使叶片的伤口充分与菌液接触；将叶片上的菌液用无菌滤纸吸干。
4.1.2 共培养
侵染过并吸干表面菌液的叶盘，气孔面朝上，紧靠着放在共培养基上（MS+ 6-BA 1.0mg/L+ IAA 0.1mg/L），黑暗处培养2d。
4.1.3筛选及分化培养
暗培养2d后，转换到筛选分化培养基上（MS+ 6-BA 1.0mg/L+ IAA 0.1mg/L+ Kan 100mg/L+ Cef 400mg/L），每15d换一次筛选分化培养基，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中。
4.1.4 生根培养
将分化至3-5cm的烟草分株切下，转移至生根培养基（1/2MS+ IBA 2.0mg/L）
4.1.5移栽
当再生植株的根长至5-8cm时，打开封口膜炼苗2-3d，将幼苗移栽至盆钵内，移栽后最初的5-10d要罩上透明塑料，保持90%-100%的湿度，并在罩上打些小孔以利于气体交换。移栽的基质以及盆钵均预先消毒。
4.2 转基因阳性植株鉴定
4.2.1用CTAB法，提取卡那霉素选择压力下筛选的烟草转化植株
4.2.2 PCR鉴定阳性植株
PCR扩增转基因植株的基因组DNA为模板，引物用基因特异性引物，PCR反应体系和反应条件同上，结果见图5。
4.3 烟草转化系的抗性鉴定
4.3.1播种
选取T1代烟草转基因种子与野生型种子，用75%的乙醇(v/v)消毒5 min，再用15%的NaClO(v/v)消毒5 min，用无菌水漂洗3-5遍，除净所有残留的NaClO溶液；将消毒的野生型（作为对照）及T1代纯合体种子分别平铺到1/2MS(K+25mg L-1)及1/2MS播种培养基上，暗培养2-3 d；然后放置25/28℃，相对湿度70%，每天16hr光照/8hr黑暗的条件下培养。
4.3.2幼苗耐逆性试验的鉴定
取形态长势基本一致的野生型植株和转基因阳性植株，分成两份，一份分别至含0 mM L-1、100 mM L-1和200 mM L-1 不同浓度NaCl的MS固体培养基上，于（25±2）℃，相对湿度70%，每天16hr光照/8hr黑暗的光照培养箱培养中生长，每个处理至少10株苗。继续培养10天后，观察转基因烟草和野生型烟草幼苗的生长情况。整个生长过程中，MS平板垂直放置。结果见图6、7。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种提高植物耐盐性的棉花耐盐基因GarCIPK
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> 棉花
<400> 1
atggtggtga gaaaagtagg gaagtatgag attggaagaa ctataggaga aggaaccttc 60
gctaaggtta agttcgccca aaataccgag accggcgaaa gcgttgccat gaaagtcctc 120
gatcgtagca ccattattaa acacaagatg gttgatcaga tcaaaaggga gatatctata 180
atgaagcttg ttagacatcc ttacgttgtt cgtttgcacg aggtcatagc aagccgaact 240
aagatttata taatcttgga gttcattacc ggtggtgaat tatttgataa aatagttcat 300
aaaggtcgtc ttagtgaagc ggaagctaga agattcttcc aacagctaat tgatggtgtg 360
gaatattgcc atagtaaggg agtctaccac agagatttga agcctgaaaa tcttttactt 420
gactccctgg gaaatttaaa gatttcagat tttggcctta gcgcgttgcc ggaacaagga 480
gttagcctcc tccggacaac atgtggtact ccaaactatg tggcaccaga ggtcctaagt 540
cacaagggat atgatggtgc tgtggcagat gtttggtctt gtggggtcat cctttatgtt 600
ttgatggcag gttatcttcc atttgacgag cttgatctca ccactctcta cagtaagatt 660
gagagagcag acttttcttg cccttcttgg tttcctgtgg gcgcgaaatc cttgattcat 720
agaattctag acccaaatcc tcaaactcgt attacaattg agcaaatcag gagcgatgag 780
tggtttaaca agggctatgt tcctgtcaga cttcttgagt atgaagatat taacttggat 840
gaagtaaatg ctgtttttga tgatccagag gttgataagg aagaaagggg taatgagcct 900
tcaggaaatg aggatatggg tcctttgagt cttaatgcat ttgacttgat cattctttct 960
caaggcttga accttgcaac gctttttgac cgtgggaagg acaatatgaa gtaccagaca 1020
cgatttgttt cacaaaagcc agcaagggtg gttctttcta ccatggaagt tgttgctcaa 1080
tcaatgggat ataagacaca tattcgtaat tataagatga gagttgaagg tccttcagct 1140
aataagaatt ctcatttgtc agttatcctc gaagttttcg aggtcgctcc cacattttta 1200
atggtagata tggaaaaagc agctggtgat gccggagaat acctaaagtt ttaccaggca 1260
ttttatagca acctcgagga gataatatgg aaaccaccaa atgaatcaag caaaaccagg 1320
atcaccaaat ctaggagtaa aagacgttga 1350
<210> 2
<211> 456
<212> PRT
<213> 棉花
<400> 2
Gly Ala Arg Cys Ile Pro Lys Met Val Val Arg Lys Val Gly Lys Tyr
1 5 10 15
Glu Ile Gly Arg Thr Ile Gly Glu Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Phe
20 25 30
Ala Gln Asn Thr Glu Thr Gly Glu Ser Val Ala Met Lys Val Leu Asp
35 40 45
Arg Ser Thr Ile Ile Lys His Lys Met Val Asp Gln Ile Lys Arg Glu
50 55 60
Ile Ser Ile Met Lys Leu Val Arg His Pro Tyr Val Val Arg Leu His
65 70 75 80
Glu Val Ile Ala Ser Arg Thr Lys Ile Tyr Ile Ile Leu Glu Phe Ile
85 90 95
Thr Gly Gly Glu Leu Phe Asp Lys Ile Val His Lys Gly Arg Leu Ser
100 105 110
Glu Ala Glu Ala Arg Arg Phe Phe Gln Gln Leu Ile Asp Gly Val Glu
115 120 125
Tyr Cys His Ser Lys Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn
130 135 140
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asn Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu
145 150 155 160
Ser Ala Leu Pro Glu Gln Gly Val Ser Leu Leu Arg Thr Thr Cys Gly
165 170 175
Thr Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Ser His Lys Gly Tyr Asp
180 185 190
Gly Ala Val Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Val Leu
195 200 205
Met Ala Gly Tyr Leu Pro Phe Asp Glu Leu Asp Leu Thr Thr Leu Tyr
210 215 220
Ser Lys Ile Glu Arg Ala Asp Phe Ser Cys Pro Ser Trp Phe Pro Val
225 230 235 240
Gly Ala Lys Ser Leu Ile His Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Gln Thr
245 250 255
Arg Ile Thr Ile Glu Gln Ile Arg Ser Asp Glu Trp Phe Lys Lys Ser
260 265 270
Tyr Val Pro Ala Arg Leu Ile Glu Tyr Glu Asp Ile Asn Leu Asp Asp
275 280 285
Val Asn Ala Val Phe Asp Asp Pro Glu Ile Asp Lys Glu Glu Arg Gly
290 295 300
Asp Glu Pro Ser Arg Asn Glu Asn Met Gly Pro Leu Asn Leu Asn Ala
305 310 315 320
Phe Asp Leu Ile Ile Leu Ser Gln Gly Leu Asn Leu Ala Thr Leu Phe
325 330 335
Asp Arg Gly Lys Asp Thr Met Lys His Gln Thr Arg Phe Val Ser Arg
340 345 350
Lys Pro Ala Arg Val Val Leu Ser Ser Met Glu Val Val Ala Gln Ser
355 360 365
Met Gly Tyr Lys Thr His Ile Arg Asn Tyr Lys Met Arg Val Glu Gly
370 375 380
Pro Ser Ala Asn Lys Asn Ser His Leu Ser Val Ile Leu Glu Val Phe
385 390 395 400
Glu Val Ala Pro Thr Phe Leu Met Val Asp Met Glu Lys Ala Ala Gly
405 410 415
Asp Ala Gly Glu Tyr Leu Lys Phe Tyr Gln Ala Phe Tyr Ser Asn Leu
420 425 430
Glu Glu Ile Ile Trp Lys Pro Pro Asn Glu Ser Ser Lys Thr Arg Ile
435 440 445
Thr Lys Ser Arg Ser Lys Arg Arg
450 455
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatggtggtg agaaaagtag ggaagta 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caggtcaacg tcttttactc ctaga 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgaaagcgtt gccatgaaag tcctc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcttccgctt cactaagacg acctt 25
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcggatccg atggtggtga gaaaagtagg gaagta 36
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggggtaccca ggtcaacgtc ttttactcct aga 33
<210> 9
<211> 576
<212> DNA
<213> 棉花
<400> 9
atggtggtca gaaaagtagg gaagtatgag attggaagaa caatcggcga aggaactttc 60
gcgaaggtta agttcgcgca aaacacggag accggcgaaa gtgttgccat gaaagtcctc 120
gatcgcagca ccattatcaa gcataaaatg gtcgatcaga tcaaaaggga gatatctata 180
atgaagcttg ttagacatcc ttacgttgtt cgtttgcacg aggttatagc gagtcgaact 240
aggatttata tcatcttgga gttcattact ggtggcgaat tattcgataa attagttcat 300
aatggtcgtt ttagtgaagc tgaagctaga agatatttcc aacagcttat tgatggtgtg 360
gaattttgcc atagcaaggg agtctaccac agagatttga agcctgaaaa tcttttactt 420
gattcccaag gaaatttaaa gatttcagat tttggcctta gcgcgttgcc agaacaagga 480
gttagcctac ttcggaccac gtgtggaact cccaactatg tagcaccaga ggttcttagt 540
cacaaggggt atgatggtgc tgtggcggac gtctgg 576