蚂蚁类毒素的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102796793 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796793 A *CN102796793A* (21)申请号 201210315591.2 (22)申请日 2012.08.31 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C07K 1/00(2006.01) (71)申请人 哈尔滨工业大学 地址 150000 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大 直街 92 号 (72)发明人 徐华民 赵荣华 赵艳琨 徐萌 (54) 发明名称 蚂蚁类毒素的制备方法 (57) 摘要 蚂蚁类毒素的制备方法， 涉及一种药品原料 的制备。

2、方法。 鉴于蚂蚁作为药材时具有毒副作用， 本发明的蚂蚁类毒素的制备方法是通过以下技术 案实现的 ： 1、 以蚂蚁为原料， 经粉碎处理后酶解 ； 2、 分离机固液分离 ； 3、 脱毒 ； 4、 化学法或物理法 灭活 ； 5、 微滤过滤除杂及超滤法浓缩 ； 6、 超声驻 波液相制备色谱纯化 ； 7、 稳定化处理。本发明制 备的蚂蚁类毒素是以中药材蚂蚁或蚂蚁干为原料 制备的一种类毒素， 制备过程不涉及传统类毒素 生产的菌种和培养基筛选， 生产工艺简单， 节能、 无环境污染， 工艺过程易于控制， 制备的蚂蚁类毒 素成分明确， 成本较低， 适合工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说。

3、明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 蚂蚁类毒素的制备方法， 其特征在于所述制备方法如下 ： （1） 以蚂蚁为原料， 经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应 ； （2） 用分离机以 3000-15000r/min 分离上述酶解液 ； （3）收集液体进行脱毒处理， 成为蚂蚁类毒素粗品液相， 控制 pH=5.8-8.0， 温度 25-45 ； （4） 蚂蚁类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理 ； （5） 用膜孔径 0.2-5m 微孔过滤机过滤， 并且用膜孔径 10-100nm 超滤机超滤处理， 收 集。

4、超滤液 ； （6） 超滤液溶于溶剂体系中， 泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化， 超声驻波频 率 2450-5000kHz， 声强 0.2-1.5kw， 流量 0.2-1.0L/min， 紫外分光光度检测器波长 260nm ； （7） 稳定化处理 ： 分离纯化蚂蚁类毒素中加入稳定剂， 在 20-30条件下吸附 10-24h， 成为稳定性蚂蚁类毒素。 2. 根据权利要求 1 所述的蚂蚁类毒素的制备方法， 其特征在于所述蛋白酶为胃蛋白酶 或胰蛋白酶。 3. 根据权利要求 1 所述的蚂蚁类毒素的制备方法， 其特征在于所述溶剂体系由甲基叔 丁基醚 - 正丁醇 - 乙腈 - 水按照 2:2:1:6 。

5、的体积比组成。 4. 根据权利要求 3 所述的蚂蚁类毒素的制备方法， 其特征在于所述溶剂体系的有机相 中加入 10-30mmol/L 三氟乙酸， 水相中加入 1-5mmol/L 氨水。 5. 根据权利要求 1 所述的蚂蚁类毒素的制备方法， 其特征在于所述稳定剂为 Al(OH)3 溶液或 Ca3(PO4)2溶液。 权 利 要 求 书 CN 102796793 A 2 1/3 页 3 蚂蚁类毒素的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种药品原料的制备方法， 尤其是一种蚂蚁类毒素的制备方法。 背景技术 0002 一种致病性细菌所产生的特异性毒性物质细菌毒素经脱毒处理而保留免疫原 性， 称之为类毒。

6、素。类毒素是一种自动免疫制剂， 用于细菌毒素性疾病的预防及治疗。 0003 现常用生产类毒素的方法是选择培养基和菌种， 菌种经人工培养后产生毒素， 毒 素脱毒后形成类毒素。 目前非常成熟的类毒素有破伤风类毒素、 白喉类毒素、 霍乱类毒素等 产品。 0004 CN101869704A 公开了单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法， 其特征是 ： 由破伤风类毒素通过静电作用后载在阳离子甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球上制 得 ； CN87104279 公开了类毒素制备新方法， 包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素 以对所说毒素进行化学灭活， 但同时保留其免疫性， 此后从中获得灭活的毒素 ；。

7、 CN1798548 公开了基于含吸附类毒素或含多糖抗原微球体的免疫原性组合物， 该发明是将类毒素抗原 或含多糖的抗原吸附在微粒体上形成免疫原性组合物。 0005 蚂蚁是一种有社会性的生活习性的昆虫， 属于节肢动物门、 昆虫纲、 膜翅目、 蚁科。 0006 蚂蚁功效 ： 补肾益精、 通经活络、 解毒消肿、 强身壮骨、 扶正祛邪。 0007 蚂蚁体内含有 28 种氨基酸， 其中苏氨酸、 苯丙氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 赖 氨酸、 蛋氨酸为人体必需的氨基酸， 并含有多种微量元素及多种维生素。 含有的蚁酸具有腐 蚀性， 蚁醛对人危害较大。 0008 现代药理研究表明 ： 蚂蚁具有抗衰老、。

8、 抗炎、 双向调节免疫、 护肝、 影响内分泌、 抗 菌、 抗癌、 平喘、 解痉的作用。 0009 市场上已有多种蚂蚁制品， 例如蚂蚁酒、 蚁王口服液、 蚂蚁茶等。 0010 CN101810644A公开了蚂蚁精油的生产方法及蚂蚁油软胶囊。 本发明是将蚂蚁用植 物油炸过之后， 去掉蚂蚁， 待油冷却后即成蚂蚁精油。 0011 CN101928745A 公开了蚂蚁多肽的制备方法及用途， 该发明将蚂蚁清洗、 干燥、 粉 碎、 超临界 CO2制备蚂蚁蛋白质， 再用酶解、 灭酶、 消毒、 过滤、 浓缩、 干燥制成蚂蚁多肽。 0012 CN101991841A 公开了一种治疗癌症的药物组合物及其制备方法， 。

9、该组合物由黑蚂 蚁、 灵芝、 硒、 蛋白粉组成。 0013 CN102145127A 公开了一种治疗类风湿关节炎的药物及其制备方法， 药物由马钱 子、 黑蚂蚁、 全蝎、 蜈蚣、 雷公藤、 川乌、 细辛、 当归、 人参、 田七、 川芎、 天麻、 寻骨风、 蜂蜜组 成。 0014 CN101954034A 公开了一种治疗艾滋病的中药制剂及其制备方法， 由党参、 白术、 黑 蚂蚁、 黄芩、 绞股蓝、 茯苓、 砂仁、 穿心莲、 灵芝等组成药剂配方。 0015 CN101919997A 公开了一种治疗神经性皮炎的配方， 由活黄蚂蚁、 陈茶叶、 陈艾叶、 老姜、 大蒜组成。 说 明 书 CN 102796。

10、793 A 3 2/3 页 4 0016 杨桂平等人研究蚂蚁的化学成分， 拟黑多刺蚁蛋白质含量达 40-67%。 0017 原则上蚂蚁作为中药材， 可以用于多种药物的配伍中， 但是蚂蚁的化学成分中不 仅含有蛋白质、 氨基酸、 维生素、 微量元素、 蚁醛、 蚁酸， 还有许多成分尚需确定。因此， 综合 开发、 物尽其材、 生产时可检、 可控、 产品的一致性是中药材用于药品制备中需解决的问题。 发明内容 0018 本发明的目的是提供一种蚂蚁类毒素的制备方法， 该方法消除了蚂蚁机体具有的 过敏源及毒副作用， 充分利用了蚂蚁资源。 0019 本发明的目的是通过以下技术案实现的 ： 1、 以蚂蚁为原料， 。

11、经粉碎处理后加入蛋 白酶进行酶解反应 ； 2、 分离机固液分离 ； 3、 脱毒 ； 4、 化学法或物理法灭活 ； 5、 微滤过滤除杂 及超滤法浓缩 ； 6、 超声驻波液相制备色谱纯化 ； 7、 稳定化处理。具体步骤如下 ： （1） 以蚂蚁为原料， 经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应 ； （2） 用分离机以 3000-15000r/min 分离上述酶解液 ； （3） 调节收集液体 pH=5.8-8.0， 控制温度 25-45， 加 H2O2溶液或甲醛进行脱毒处理， 成为蚂蚁类毒素粗品液相 ； （4） 蚂蚁类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理 ； （5） 用膜孔径 0.2-5m 微孔过滤机。

12、过滤， 并且用膜孔径 10-100nm 超滤机超滤处理， 收 集超滤液 ； （6） 超滤液溶于溶剂体系中， 泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化， 超声驻波频 率 2450-5000kHz， 声强 0.2-1.5kw， 流量 0.2-1.0L/min， 紫外分光光度检测器波长 260nm ； （7） 稳定化处理 ： 分离纯化蚂蚁类毒素中加入稳定剂， 在 20-30条件下吸附 10-24h， 成为稳定性蚂蚁类毒素。 0020 本发明制备的蚂蚁类毒素是以中药材蚂蚁或蚂蚁干为原料制备的一种类毒素， 其 相对分子量为 35104Da， 制品振摇后为乳黄色均匀悬浮液， pH=6.6-7.4， 氢氧化铝。

13、含量少 于 2.5mg/mL， 游离甲醛含量小于 0.02% （g/mL） 。蚂蚁中的拟黑多刺蚁是国家卫生部指定的 唯一一种药食兼用蚁， 蚂蚁含蛋白质 45%， 并含有脂肪及脂肪酸以及醛类化合物等成分， 经 化学去毒处理后， 蚂蚁的过敏源被消除。本发明的制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种 和培养基筛选， 生产工艺简单， 节能、 无环境污染， 工艺过程易于控制， 制备的蚂蚁类毒素成 分明确， 产品一致性好， 成本较低， 适合工业化生产。 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。 0022 实施例 1 ： （1） 选用新鲜中药材蚂蚁放入绞肉机绞碎蚂蚁机体， 用高压匀浆破碎法进。

14、一步破碎机 体， 调节压力 100000kpa， 流速至 70cm/ml， 重复破碎 2-5 次， 以离心机 1250-3000r/min 固液 分离， 收集液相 ； （2） 收集液相 1000ml 加入 2000-10000ml 纯净水混合均匀后加入 0.5-10g 胃蛋白酶， 保 持温度 20-50， 酶解 6h-48h ； （3）用 分 离 机 以 3000-15000r/min 分 离 上 述 酶 解 液，收 集 液 体 用 0.2mol/ 说 明 书 CN 102796793 A 4 3/3 页 5 LNa2HPO4-0.2mol/LNaH2PO4组 成 的 缓 冲 液 调 节 pH。

15、=5.8-8.0，控 制 温 度 25-45 ，加 10-100gH2O2溶液脱毒处理 15-45d， 成为蚂蚁类毒素粗品液相 ； （4） 1L 蚂蚁类毒素粗品液相置于微波炉中， 在功率 0.5-2kw 加热 1-10min 进行灭活 ； （5） 将 100ml 蚂蚁类毒素粗品液相加入 0.2mol/LNa2CO3-0.2mol/LNaHCO3缓冲溶液调 pH=8-12， 再加入 50-100gNa2SO4及 20-200g 活性白土， 在 10-30条件下生成沉淀并放置 10h-24h ； （6） 上述物料用膜孔径0.2-5m微孔过滤机过滤， 并且用膜孔径10-100nm超滤机超滤 处理， 。

16、收集超滤液 ； （7） 收集的 1L 超滤液溶于 2-10L 由甲基叔丁基醚 - 正丁醇 - 乙腈 - 水按照 2:2:1:6 的体积比组成的溶剂体系中， 其中有机相中加入 10-30mmol/L 的三氟乙酸， 水相中加 入 1-5mmol/L 氨水， 泵入超声驻波液相制备色谱中， 超声驻波频率 2450-5000kHz， 声强 0.2-1.5kw， 流量 0.2-1.0L/min， 紫外分光光度检测器波长 260nm， 连续分离纯化 ； （8） 分离纯化蚂蚁类毒素 1000L 加入 200-1000L 含量为 5-20g/L Al(OH)3溶液中， 在 20-30条件下吸附 10h-24h，。

17、 成为稳定性蚂蚁类毒素。 0023 实施例 2 ： （1） 1000g 蚂蚁干品用粉碎机以 275-500r/min 连续粉碎， 并用 100-200 目筛子筛选， 收 集粉末 ； （2） 将 1000g 粉末放入微波炉中以功率 0.5-2kw， 加热 10-20min 杀菌处理， 然后自然冷 却至 25-30 ； （3） 上述杀菌处理后蚂蚁干品粉末加入1-10L纯净水混合均匀后， 加入1.5-50g胰蛋白 酶， 保持温度 25-50， 酶解 5-48h ； （4）用 分 离 机 以 3000-15000r/min 分 离 上 述 酶 解 物， 收 集 的 液 体 用 0.2mol/L Na2。

18、CO3-0.2 mol/LNaHCO3组成的缓冲溶液调 pH=5.8-8， 控制温度 25-45， 加 10-100g 甲醛 脱毒处理 30-45d， 成为蚂蚁类毒素粗品 ； （5） 1000ml 蚂蚁类毒素粗品用 10000-15000 高斯磁感强度处理 2-5min， 处理 3-5 次灭 活 ； （6） 将 1Kg 蚂蚁类霉素粗品加入氨水调整 pH=7-9， 加入 100-300g(NH4)2SO4及 150-500g 沸石， 常温条件下生成沉淀并吸 10-24h ； （7） 上述脱毒液用膜孔径 0.2-10m 微滤机过滤再用膜孔径 10-100nm 超滤机超滤浓 缩， 收集浓缩液。 00。

19、24 （8） 1L 浓缩液溶于 2-10L 由甲基叔丁基醚 - 正丁醇 - 乙腈 - 水按照 2:2:1:6 的体 积比组成的溶剂体系中， 其中有机相中加入 10-30mmol/L 三氟乙酸， 水相中加入 1-5mmol/ L 氨水， 泵入超声驻波液相制备色谱中， 超声驻波频率 2450-5000kHz， 声强 0.2-1.5kw， 流量 0.5-1.0L/min， 紫外分光光度检测器波长 260nm， 连续分离纯化 ； （9） 分离纯化的 1L 蚂蚁类毒素加入 20.0-50.0L 含量为 10-20g/LCa3(PO4)2溶液中， 在 20-30条件下吸附 10-24h， 成为稳定性蚂蚁类毒素。 说 明 书 CN 102796793 A 5 。