防治苹果轮纹病的微生物农药.pdf

本发明公开了一种农药，特别是涉及一种防治苹果轮纹病的微生物农药。它是由下述原料按所述重量份数制备而成：拮抗细菌发酵液10-50份；淀粉10-50份；NNO萘磺酸盐甲醛缩合物1-6份；K2CO3 1-4份；MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物3-20份；硅藻土15-50份。本发明的积极效果是将拮抗细菌发酵液与助剂按一定比例制成微生物农药，具有防效好、安全、环境友好等特点，降低了多菌灵的使用次数，减少了多菌灵的抗药性，是生产绿色食品所需的生物农药。

1、  防治苹果轮纹病的微生物农药，其特征在于它是由下述原料按所述重量份数制备而成：拮抗细菌发酵液10-50份；淀粉10-50份；NNO萘磺酸盐甲醛缩合物1-6份；K₂CO₃1-4份；MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物3-20份；硅藻土15-50份。

2、  根据权利要求1所述的防治苹果轮纹病的微生物农药，其特征在于它是由下述原料按所述重量份数制备而成：拮抗细菌发酵液20-40份；淀粉20-40份；NNO萘磺酸盐甲醛缩合物2-4份；K₂CO₃1-3份；MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物6-15份；硅藻土20-40份。

3、  一种权利要求1或2所述防治苹果轮纹病的微生物农药可湿性粉剂的制备工艺，其特征在于取符合所述重量份数的淀粉、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物、K₂CO₃、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将符合所述重量份数的拮抗细菌发酵液与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。

4、  根据权利要求3所述的防治苹果轮纹病的微生物农药可湿性粉剂的制备工艺，其特征在于所述的拮抗细菌发酵液的制备方法如下：取固体培养基，将拮抗细菌接种于固体培养基，在25-30℃下培养60-80小时得菌落；取单菌落，接种于培养液内在25-30℃下在摇床中培养20-30小时，制成种子液；将种子液接种到培养液内，25-30℃下在摇床中60-80小时得拮抗细菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为1∶8-12。

5、  根据权利要求3所述的防治苹果轮纹病的微生物农药可湿性粉剂的制备工艺，其特征在于所述的固体培养基是由下述制备方法制得：取牛肉浸膏3-4份、蛋白胨8-12份、NaCL5-6份、琼脂17-20份、水0.5-1.5份加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得固体培养基，其中接种拮抗细菌为0.001-0.005份。

6、  根据权利要求3所述的防治苹果轮纹病的微生物农药可湿性粉剂的制备工艺，其特征在于所述的培养液是由下述制备方法制得：取淀粉10-30份，蛋白胨10-30份，NaCL4-8份，水0.5-1.5份；加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得液体培养液。

7、  根据权利要求5或6所述的防治苹果轮纹病的微生物农药可湿性粉剂的制备工艺，其特征在于所述的湿热灭菌是装瓶封口的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，0.8-1.2kg/cm²压力，115-130℃，15-30min湿热灭菌。

防治苹果轮纹病的微生物农药
技术领域
本发明涉及一种农药，特别是涉及一种防治苹果轮纹病的微生物农药。
背景技术
苹果轮纹病菌(BotryospHaeria berengeriana f.piricola)属于子囊菌纲，座囊菌目，囊孢菌属。苹果轮纹病俗称水烂病、烂果病，该病在美国、加拿大、日本和我国均有发生，我国尤以辽宁、山东、河北发病严重。轮纹病寄生范围很广，除苹果外还能为害梨、桃、李、杏等多种果树。
苹果轮纹病菌主要为害果实。发病初期在果面部分出现圆形、黑至黑褐色小斑，逐渐扩大成轮纹状。随着症状的进一步发展，病斑呈淡褐至黑褐色，整个果实即变为水渍状软化腐烂。发病后期在病斑表面形成黑色小粒点状的分生孢子器，偶尔从孢子器中溢出白色线头状孢子角。
苹果轮纹病菌不仅侵染田间生长的苹果，引起20％-30％的烂果，由于其潜伏侵染特性，还可引起苹果采后腐烂，成为贮藏期的重要病害，严重影响果实的产质量，给果农造成了很大的经济损失。
目前苹果轮纹病在生产上主要以化学药剂防治为主，采用化学药剂防治容易造成农药在土壤和作物上的残留，对土壤、地下水、河流、湖泊造成污染，尤其是给人类的生存、发展和健康带来危害。化学农药的广泛应用使公众越来越担心其安全性和对环境造成的污染问题；同时，化学农药的大量使用也使病菌对常用药剂产生了一定的抗药性，使其防效不断下降。而且，近年来随着人们生态意识观念的日益增强和生活水平的提高，人们越来越注重生活质量，安全、优质、无公害蔬菜受到人们的青睐。所以必须寻找新的途径以克服化学药剂防治带来的农药残留和病菌抗药性等问题。
随着人们环保意识的增强和对绿色无公害农产品需求的扩大，使得植物病害的生物防治越来越受到人们的关注，生物防治因其具有对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了厂泛的重视并发挥着越来越重要的作用。利用拮抗微生物防治植物病害是当今植病界十分活跃的研究领域之一，并已显示出良好的应用前景。拮抗细菌是一类历史悠久的生防微生物，也是公认的很有前途的生防因子。拮抗细菌以其种类和数量众多、分布广泛、作用方式多样、对非靶标生物安全及不污染环境等优点而倍受重视。在国内外的研究中，利用拮抗细菌防治植物病害特别是土传病害的报道很多。利用拮抗细菌防治疫霉菌(Phytophora)等的研究都取得了良好的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治苹果轮纹病的微生物农药。它具有安全、防治苹果轮纹病效果好，环境友好等特点，降低了多菌灵的使用次数，减少多菌灵的抗性药。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的。
防治苹果轮纹病的微生物农药，它是由下述原料按所述重量份数制备而成：拮抗细菌发酵液10-50份；淀粉10-50份；NNO萘磺酸盐甲醛缩合物1-6份；K₂CO₃1-4份；MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物3-20份；硅藻土15-50份。
防治苹果轮纹病的微生物农药，它是由下述原料按所述重量份数制备而成：拮抗细菌发酵液20-40份；淀粉20-40份；NNO萘磺酸盐甲醛缩合物2-4份；K₂CO₃1-3份；MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物6-15份；硅藻土20-40份。
上述防治苹果轮纹病的微生物农药可湿性粉剂的制备工艺，取符合所述重量份数的淀粉、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物、K₂CO₃、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将符合所述重量份数的拮抗细菌发酵液与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
所述的拮抗细菌发酵液的制备方法如下：取固体培养基，将拮抗细菌接种于固体培养基中，在25-30℃下培养60-80小时得菌落；取单菌落，接种于培养液内在25-30℃下在摇床中培养20-30小时，制成种子液；将种子液接种到培养液内，25-30℃下在摇床中60-80小时得拮抗细菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为1∶8-12。
所述的固体培养基是由下述制备方法制得：取牛肉浸膏3-4份、蛋白胨8-12份、NaCL 5-6份、琼脂17-20份、水0.5-1.5份加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得固体培养基，其中接种拮抗细菌为0.001-0.005份。
所述的培养液是由下述制备方法制得：取淀粉10-30份，蛋白胨10-30份，NaCL4-8份，水0.5-1.5份；加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得液体培养液。
所述的湿热灭菌是装瓶封口的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，0.8-1.2kg/cm²压力，115-130℃，15-30min湿热灭菌。
本发明的使用方法如下：果实幼果期喷施，使用浓度100倍，具有保护作用。果实生长期和其他防治措施结合使用，使用浓度100倍，减少化学药剂抗性药，减少农药残留。
本发明的积极效果是将拮抗细菌发酵液与助剂按一定比例制成微生物农药，具有防效好、安全、环境友好等特点，降低了多菌灵的使用次数，减少多菌灵的抗性药，是生产绿色食品所必须的生物农药。
为了证明本发明对苹果轮纹病的效果进行了多次试验，并与生产上的常用药剂作了对比试验，防治效果效好，下述实验中所用苹果轮纹病拮抗细菌可湿性粉剂是采用实施例1的方法制备的；实验做所用拮抗细菌发酵液也是按照实施例的方法制备的；试验结果如下：
1.抗菌物质对孢子萌发的抑制作用的测定
将拮抗细菌发酵液在3000-4000r/min下离心10min，取上清液分别稀释浓度为5、10、20、30、40、50、100、200、400倍待用。分别量取0.25mL上述上清液液和0.5mL上述分生孢子悬浮液加入指形管(1×7.5cm)中，将指形管放入25℃培养箱中培养。每个处理重复3次。对照加相同体积的无菌水。分别在24h时测定孢子的萌发率。孢子的萌发是以芽管的长度约超过孢子宽度一倍时做为标准。观察时于载玻片上盖上盖玻片，在显微镜下观察计数，每个处理及对照观察计数时计3-5个视野的总孢子数，孢子总数应在200左右，计算萌发率和抑制率。


从表1可以看出，拮抗菌无菌液随着稀释倍数的增加，抑菌率逐渐降低。稀释5倍时，抑制率为93％，稀释400倍时，抑制率为25％。此外，当抑制率为50％时，无菌液的稀释倍数为100倍，因此可初步断定其EC₅₀为100倍。
表1  No.1无菌液抑菌测定

2苹果轮纹病拮抗细菌可湿性粉剂离体果控病试验
在田间选取大小、成熟度基本一致的苹果果实，按下述3种方式处理：(1)先喷布1×10⁸个/mL菌株可湿性菌剂200倍液，24h后刺伤接种轮纹病菌1×10⁶个/mL孢子悬液。(2)先喷布轮纹病菌1×10⁶个/mL孢子悬液，24h后刺伤喷布1×10⁸个/mL菌株可湿性菌剂200倍液(3)先喷无菌水，24h后刺伤接种轮纹病菌1×106个/mL孢子悬液。以上处理每个果面刺伤4处，放到27℃下保温保湿，5d后观察刺伤点发病情况，调查病情指数，计算防治效果。

试验结果见2.先喷拮抗细菌菌株菌液后刺伤接种轮纹病菌的防治效果为73.5％，而先接种轮纹病菌后刺伤喷拮抗细菌菌株菌液的防治效果为38.02％，前者防效显著高于后者，说明先喷拮抗细菌菌株菌液可优先利用伤口的外渗营养，阻止病菌孢子的侵入，并可杀死病菌，从而达到防治病害的目的。
表2  菌株的离体果防治试验结果


I接种轮纹病菌后刺伤喷No.1  II喷No.1后刺伤接种轮纹病菌III先喷无菌水后刺伤接种轮纹病菌
3苹果轮纹病拮抗细菌可湿性粉剂菌剂田间防治试验
试验在辽宁省果树所优质果园12年生富士苹果树上进行。土壤为棕壤，pH7，水肥条件中等，株产40kg左右。共设8个处理：1)菌剂100倍与1∶3∶240波尔多液交替；2)菌剂200倍与1∶3∶240波尔多液交替；3)菌剂300倍液与1∶3∶240波尔多液交替；4)50％多菌灵800倍液与1∶3∶240波尔多液交替；5)常规喷药；6)清水；7)花后喷多菌灵套袋。8)花后喷菌剂100倍套袋.单株小区，重复5次，顺序排列，对照树两边设保护行。全年喷5次药，喷药日期为5月26日，6月9、24日，7月22日，8月7日.常规喷药处理各次分别为6月9日多菌灵800倍、21日中生菌素200倍，7月8日大生M-45800倍，7月22日多菌灵800倍、8月7日1∶3∶240波尔多液。果实采收期每处理调查500个轮纹病发病果实，计算防效；果实采收时每处理采500个未发病果实贮藏1个月后调查发病果数，计算防效。



结果见表5.2.常规喷药和50％多菌灵800倍液与1∶3∶240波尔多液交替防效明显，都在90％以上，但菌剂100倍与1∶3∶240波尔多液交替的防效也接近90％，与常规喷药的效果差异不显著；菌剂200倍与1∶3∶240波尔多液交替和菌剂300倍与1∶3∶240波尔多液交替的防效稍差一些，显著低于常规喷药和50％多菌灵800倍液与1∶3∶240波尔多液交替防效，但也在80％以上，花后一周喷杀菌剂(多菌灵和菌剂)套袋的，果实轮纹病防效均为100％。果实采收贮藏一个月后防效结果与果实采收时表现趋势一致。
表3菌株田间防治试验结果

备注：I：菌剂100倍与1∶3∶240波尔多液交替II：菌剂200倍与1∶3∶240波尔多液交替III：菌剂300倍与1∶3∶240波尔多液交替IV：50％多菌灵800倍液与1∶3∶240波尔多液交替V：常规喷药VI：清水(对照)Water(CK)VII：花后喷多菌灵套袋VIII：花后喷菌剂100倍套袋。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并不能用于限定本发明的保护范围，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1：
取淀粉30g、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物2g、K₂CO₃1.5g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物10g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将拮抗细菌发酵液30g与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
所述的拮抗细菌发酵液是采用下述方法制得：
制作拮抗细菌固体培养基：取牛肉浸膏3-4g，蛋白胨10g，NaCL 5.3g，琼脂17-20g，水1g加入到沸水浴锅中加热熔化，调1mol/L NaOH调pH至7.2；趁热用多层纱布过滤，分装至250mg的三角瓶中，并在三角瓶口塞上棉塞，然后包扎一层牛皮纸；然后将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，1、05kg/cm²压力，121.3℃，20min湿热灭菌；待培养基温度降至50℃左右时，在洁净工作台上将培养基倒在培养皿中，冷却至室温得到固体培养基；
菌落的制备：将拮抗细菌1-5mg接种于上述固体培养基中在28℃下培养72小时，得菌落；
制作培养液：取取淀粉20g、蛋白胨20g、NaCL5.0g、水1g加入到沸水浴锅中加热熔化，调1mol/LNaOH调pH至7.2；趁热用多层纱布过滤，分装至250mg的三角瓶中，并在三角瓶口塞上棉塞，然后包扎一层牛皮纸；然后将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，1、05kg/cm²压力，121.3℃，20min湿热灭菌；待培养基温度降至50℃左右时，在洁净工作台上将培养基倒在培养皿中，冷却至室温得培养液；
种子液的制备：取单菌落，接种于培养液内，在28℃下140r·min^-1的速度在摇床中培养24小，制成种子液；
拮抗细菌发酵液的制备：取上述方法制得的种子液16mg接种于按上述方法制得的培养液中，在28℃下140r·min^-1的摇床中培养72小时，制成发酵液。
实施例2：
取淀粉30g、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物4g、K₂CO₃1.5g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物8g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将拮抗细菌发酵液30g与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
其中细菌发酵液的制备方法同实施例1。
实施例3：
取淀粉20g、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物2g、K₂CO₃1g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物6g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将拮抗细菌发酵液40g与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
所述的拮抗细菌发酵液是采用常规方法制备的。
实施例4：
取淀粉40g、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物4g、K₂CO₃3g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物4g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将拮抗细菌发酵液20g与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
所述的拮抗细菌发酵液是采用常规方法制备的。
实施例5：
取淀粉50g、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物6g、K₂CO₃4g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物20g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将拮抗细菌发酵液50g与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
所述的拮抗细菌发酵液是采用下述方法制得：
制作拮抗细菌固体培养基：取牛肉浸膏3g，蛋白胨8-12g，NaCL5-6g，琼脂17-20g，水0.5或1.5g加入到沸水浴锅中加热熔化，调1mol/L NaOH调pH至7或7.5；趁热用多层纱布过滤，分装至250mg的三角瓶中，并在三角瓶口塞上棉塞，然后包扎一层牛皮纸；然后将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，800-1200kg/cm²压力，115-125℃，15-30min湿热灭菌；待培养基温度降至50℃左右时，在洁净工作台上将培养基倒在培养皿中，冷却至室温得到固体培养基；
菌落的制备：将拮抗细菌1-5mg接种于上述固体培养基中在30℃下培养72小时，得菌落；
制作培养液：取取淀粉20g、蛋白胨20g、NaCL5.0g、水1g加入到沸水浴锅中加热熔化，调1mol/LNaOH调pH至7.2；趁热用多层纱布过滤，分装至250mg的三角瓶中，并在三角瓶口塞上棉塞，然后包扎一层牛皮纸；然后将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，800-1200kg/cm²压力，115-125℃，15-30min湿热灭菌；待培养基温度降至50℃左右时，在洁净工作台上将培养基倒在培养皿中，冷却至室温得培养液；
种子液的制备：取单菌落，接种于培养液内，在25或30℃下140r·min^-1的速度在摇床中培养30小，制成种子液；
拮抗细菌发酵液的制备：取上述方法制得的种子液16mg接种于按上述方法制得的培养液中，在25或30℃下140r·min^-1的摇床中培养60或80小时，制成发酵液。
实施例6：
取淀粉10g、NNO萘磺酸盐甲醛缩合物1g、K₂CO₃1g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物3g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将拮抗细菌发酵液10g与粉碎后的助剂填料混合均匀，既得。
所述的拮抗细菌发酵液是采用常规方法制备的。