新型糖苷酶及编码该酶的多核苷酸.pdf

本发明提供子囊菌类的丝状菌(优选属于木霉属(Trichoderma)的菌，更优选绿色木霉(Trichoderma viride))产生的新型糖苷酶蛋白质及编码该酶蛋白质的基因。由本发明所提供的新型酶蛋白质中，特别优选的实例是从绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141株的培养上清中得到的酶蛋白质。通过用本发明的新型酶对类黄酮类进行糖苷化，能够提高水溶性。

1.  一种多核苷酸，其包含下述(A)～(K)中的任一项：
(A)多核苷酸，其由序列号：6中记载的碱基序列的全部或一部分组成；
(B)多核苷酸，其与由(A)中所述的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(C)多核苷酸，其由(A)中所述的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列组成，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(D)多核苷酸，其与(A)中所述的多核苷酸的碱基序列有至少60％以上的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(E)多核苷酸，其由序列号：9中记载的碱基序列组成；
(F)多核苷酸，其与由(E)中所述的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(G)多核苷酸，其由(E)中所述的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列组成，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(H)多核苷酸，其与(E)中所述的多核苷酸的碱基序列有至少60％以上的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(I)多核苷酸，其编码由序列号：10中记载的氨基酸序列组成的蛋白质；
(J)多核苷酸，其编码由序列号：10中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(K)多核苷酸，其编码由与序列号：10中记载的氨基酸序列有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。

2.  一种多核苷酸，其包含下述(L)～(R)中的任一项：
(L)多核苷酸，其由序列号：25中记载的碱基序列组成；
(M)多核苷酸，其与序列号：25中记载的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(N)多核苷酸，其由序列号：25中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列组成，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(O)多核苷酸，其与序列号：25中记载的碱基序列有至少60％以上的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(P)多核苷酸，其编码由序列号：26中记载的氨基酸序列组成的蛋白质；
(Q)多核苷酸，其编码由序列号：26中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(R)多核苷酸，其编码由与序列号：26中记载的氨基酸序列有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。

3.  根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其来自子囊菌类的丝状菌，优选来自木霉属，更优选来自绿色木霉。

4.  一种载体，其包含权利要求1、2或3所述的多核苷酸。

5.  一种转化体，其由权利要求4所述的载体转化。

6.  一种蛋白质，其包含下述的(i)、(j)或(k)：
(i)蛋白质，其由序列号：10中记载的氨基酸序列组成；
(j)蛋白质，其由序列号：10中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性；
(k)蛋白质，其由与序列号：10中记载的氨基酸序列有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性。

7.  一种蛋白质，其包含下述的(p)、(q)或(r)：
(p)蛋白质，其由序列号：26中记载的氨基酸序列组成；
(q)蛋白质，其由序列号：26中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性；
(r)蛋白质，其由与序列号：26中记载的氨基酸序列有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性。

8.  根据权利要求6或7所述的蛋白质，其被固定在树脂上。

9.  一种多核苷酸，其来自木霉属，优选来自绿色木霉、里氏木霉、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、康氏木霉、钩状木霉、哈茨木霉或多孢木霉，包含序列号：11～24中任一项记载的碱基序列，编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。

10.  一种蛋白质，其来自木霉属，优选来自绿色木霉、里氏木霉、Trichoderma saturnisporum、Trichoderma ghanense、康氏木霉、钩状木霉、哈茨木霉或多孢木霉，由包含序列号：11～24中任一项记载的碱基序列的多核苷酸编码，具有类黄酮类的糖苷化活性。

11.  根据权利要求10所述的蛋白质，其被固定在树脂上。

12.  一种确定编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质的多核苷酸的碱基序列或具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质的氨基酸序列的方法，其特征在于，使用序列号：6、序列号：9、序列号：10、序列号：11～26中任一项记载的碱基序列或氨基酸序列的全部或一部分。

新型糖苷酶及编码该酶的多核苷酸
技术领域
本发明涉及可对类黄酮类进行糖苷化的新型糖苷酶及编码该酶的多核苷酸。通过本发明得到的类黄酮类的糖苷可作为食品、医药品及化妆品使用。
背景技术
有关原花色素(葡萄籽提取物)作为血管治疗药的有效性的研究在不断发展，其原因之一是因为作为对象的物质对热、酸稳定，充分溶于水，吸收性高，所以可成为追踪在生物体内的吸收、代谢的标记物。相对于此，儿茶素等的多酚化合物大多存在难溶于水，且不易被生物体内吸收的问题。
以改善在水中的溶解度、提高稳定性为目的，一直在研究对儿茶素等进行糖苷化的技术。
例如，专利文献1公开了从野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)WU-9701的培养液中回收的分子量约为57000的α-葡萄糖苷酶。该酶以麦芽糖等为供体(麦芽三糖、环糊精、淀粉等不作为供体)，向特定的受体转移葡萄糖以合成糖苷。在此，作为受体，可例举薄荷醇、乙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1-戊醇、2-戊醇、5-壬醇等具有醇羟基的化合物，及辣椒素、二氢辣椒素、壬酸香草酰胺、儿茶素、表儿茶素、香草醛、氢醌、儿茶酚、间苯二酚、3，4-二甲氧基苯酚等具有酚羟基的化合物。且可确认生成的糖苷只有单葡萄糖苷。
专利文献2中公开了使蔗糖磷酸化酶作用于儿茶素类和葡萄糖-1-磷酸或蔗糖的混合液，从而制造儿茶素类糖苷的方法。在此，作为蔗糖磷酸化酶的来源，可例举肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)、腐败假单胞菌(Pseudomonasputrefaciens)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、产糖芽霉菌(Pullularia pullulans)。此处，作为受体，儿茶素类虽可例举(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素3-O-没食子酸酯、(-)-表没食子儿茶素及(-)-表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯，但作为实施例，所记载的只有将(+)-儿茶素用作受体制造(+)-儿茶素3’-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的例子。
专利文献3中公开了在5、7、3’、4’、5’、3″、4″、5″位的至少一个上结合了葡萄糖残基或聚合度为2～8的麦芽低聚糖残基的表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯衍生物。在此，实施例中所记载的与专利文献2同样，只有使蔗糖磷酸化酶作用于(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯和葡萄糖-1-磷酸或蔗糖的混合液，从而制造4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯及4’，4”-O-α-D-二-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯的例子。
专利文献4中公开了通过对多酚类进行糖苷化，从而减少了涩味的茶提取物或茶饮料。其中，作为减少茶提取物或茶饮料的涩味的具体方法，记载了在茶提取物或茶饮料中添加糊精、环糊精、淀粉或这些物质的混合物，并使环麦芽糊精葡聚糖转移酶与其作用的方法。在实施例中，记述了使来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的环麦芽糊精葡聚糖转移酶作用于绿茶提取物和α-环糊精，从而减少所得到反应生成物中的涩味，且还记述了其表明表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯、表儿茶素等的多酚类已被糖苷化。但未明确反应生成物的具体结构。
专利文献5公开了3’位、3’和5位及3’和7位被糖苷化的儿茶素类的糖苷。其中作为进行糖苷化的具体方法，与专利文献4同样，记载了使来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的环麦芽糊精葡聚糖转移酶作用于儿茶素类及糊精、环糊精、淀粉或这些物质的混合物的方法。而且，在基于作为糖供体使用糊精的上述方法的实施例中，对于(-)-表没食子儿茶素、(-)-表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯、(-)-表儿茶素3-O-没食子酸酯的糖苷，从分子吸光系数上也可知，得到了每1分子的各多酚平均结合有6～8个葡萄糖的糖苷。另外，通过使来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的葡萄糖淀粉酶作用于由上述方法得到的糖苷，可确认生成了3’，7-二-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素、3’，5-二-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素、3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素、3’，7-二-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯、3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯、3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-没食子儿茶素、3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基(-)-表儿茶素3-O-没食子酸酯。
此外，作为儿茶素糖苷的效果，非专利文献1中记载了减少涩味、提高水溶性、改善稳定性、阻断酪氨酸酶等效果，非专利文献2中记载了抑制致突变性效果。
专利文献1：日本特开2001-46096
专利文献2：日本特开平5-176786(专利第3024848号)
专利文献3：日本特开平7-10897(专利第3071610号)
专利文献4：日本特开平8-298930(专利第3579496号)
专利文献5：日本特开平9-3089(专利第3712285号)
非专利文献1：Biosci.Biotech.Biochem.，57(10)，1666-1669(1993)
非专利文献2：Biosci.Biotech.Biochem.，57(10)，1290-1293(1993)
发明内容
发明要解决的课题
这些糖苷化技术从使用的酶的糖供体特异性、可进行糖苷化的化合物的特异性、糖苷化效率等观点来看都不能说充分，所以期望开发出更加优异的糖苷酶。
解决课题的方法
本发明者对包括儿茶素等在内的类黄酮的糖苷化技术一直进行锐意的研究。其结果，从绿色木霉(Trichoderma viride)的培养上清中发现了新型糖苷酶，并通过克隆其基因完成了本发明。
〔糖苷酶基因等〕
本发明提供用于编码子囊菌类的丝状菌(优选属于木霉属(Trichoderma)的菌、更优选绿色木霉(Trichoderma viride))产生的糖苷酶蛋白质的多核苷酸或其同源物，即提供包含下述(A)～(K)中任一项的多核苷酸(优选是下述(A)～(K)中任一项的多核苷酸)：
(A)多核苷酸，其由序列号：6中记载的碱基序列的全部或一部分(例如，423～1928位的碱基序列部分的全部或一部分，与序列号：9的碱基序列相对应的部分)组成；
(B)多核苷酸，其与由(A)中所述的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(C)多核苷酸，其由(A)中所述的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列组成，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(D)多核苷酸，其与(A)中所述的多核苷酸的碱基序列具有至少60％以上的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(E)多核苷酸，其由序列号：9中记载的碱基序列组成；
(F)多核苷酸，其与由(E)中所述的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(G)多核苷酸，其由(E)中所述的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列组成，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(H)多核苷酸，其与(E)中所述的多核苷酸的碱基序列具有至少60％以上的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(I)多核苷酸，其编码由序列号：10中记载的氨基酸序列所组成的蛋白质；
(J)多核苷酸，其编码由序列号：10中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(K)多核苷酸，其编码由与序列号：10中记载的氨基酸序列有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。
序列号：6表示从绿色木霉(T.viride)IAM5141株中得到的糖苷酶TRa2的基因组DNA的碱基序列，序列号：9表示其cDNA序列，序列号：10表示TRa2的推定氨基酸序列。
用SignalP分析TRa2的推定氨基酸序列时，推定序列号：10的第1～20位氨基酸序列为分泌信号。因此，认为作为糖苷酶作用时必须的成熟蛋白质是序列号：10中第21位以后的序列，在使该酶在大肠杆菌等异种表达系统中表达时，应除去信号序列再使其表达比较适当。编码此类成熟蛋白质的多核苷酸也包含在本发明的范围内。
因此，本发明还提供包含下述(L)～(R)中任一项的多核苷酸(优选为下述(L)～(R)中任一项的多核苷酸)：
(L)多核苷酸，其由序列号：25中记载的碱基序列组成；
(M)多核苷酸，其与序列号：25中记载的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(N)多核苷酸，其由序列号：25中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列组成，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(O)多核苷酸，其与序列号：25中记载的碱基序列有至少60％以上的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(P)多核苷酸，其编码序列号：26中记载的氨基酸序列所组成的蛋白质；
(Q)多核苷酸，其编码由序列号：26中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质；
(R)多核苷酸，其编码由与序列号：26中记载的氨基酸序列有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。
序列号：25表示编码作为成熟蛋白质TRa2的cDNA的碱基序列、即序列号9中第61-1389位的碱基序列，序列号：26表示作为成熟蛋白质TRa2的氨基酸序列、即序列号10中第21-463位的氨基酸序列。
本发明还提供如下多核苷酸，其来自木霉属(Trichoderma)，优选来自绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Trichodermasaturnisporum、Trichoderma ghanense、康氏木霉(Trichoderma koningii)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)或多孢木霉(Trichoderma polysporum)，包含序列号：11～24中任一项记载的碱基序列，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。此种多核苷酸的优选实例是如下多核苷酸，其包含序列号：11～24中任一项记载的碱基序列，与序列号：6、9或25中记载的碱基序列有高度的同一性，且编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。
本说明书中，“糖苷化活性”是指具有向类黄酮类转移糖残基的活性。某种蛋白质是否具有向类黄酮类转移糖残基的活性，除特殊情况外，例如，如本说明书的实施例所示，可通过在类黄酮(例如儿茶素)和适合的糖供体(例如糊精)的混合液中加入对象酶，进行充足时间的反应，将反应液用高效液相色谱法(HPLC)等进行分析来确认。
由本发明的多核苷酸编码的蛋白质在具有糖苷化活性的同时，还可具有其他活性，例如糊精酶活性。本说明书中，“糊精酶”除特殊情况外，是指可水解淀粉、糊精等α-葡萄糖苷结合的糖质的酶。糊精酶是淀粉酶的一种。对象是否具有糊精酶活性，可通过在适当的条件下，使其作用于市售的糊精(例如，将淀粉通过酸、热或酶进行水解，平均分子量为3500左右的产物)，根据糊精是否被水解来进行判断。只要是本领域技术人员，均可适当设计使对象作用的反应的适当条件、及用于判断糊精是否被水解的方法。
(类黄酮类)
本说明书中，“类黄酮类”除特殊情况外，包括类黄酮及七叶亭。
本说明书中，“类黄酮”除特殊情况外，是指儿茶素类(黄烷醇)、二氢黄酮、黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇、异黄酮、花色素苷及查耳酮、以及其甲基化物。类黄酮中，包含柚皮素、槲皮素、大豆素、金雀异黄素、山奈酚。可在本发明中使用的类黄酮可来自天然物，也可以是合成物。
本说明书中，“儿茶素类”除特殊情况外，使用的是广义的儿茶素的意思，是指儿茶酸(3-oxyflavan)的聚氧衍生物。其中包含儿茶素、没食子儿茶素及这些物质的3-没食子酰基化物，还包含这些物质的光学异构体((+)体、(-)体、(+)-epi体、(-)-epi体)及外消旋体。具体地说，包含儿茶素、没食子儿茶素(gallocatechin；GC)、儿茶素没食子酸酯(catechin-3-O-gallate；CG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin-3-O-gallate；GCG)、表儿茶素(epicatechin；EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin；EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate；ECG)及表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate；EGCG)、以及这些物质的光学异构体。儿茶素类的甲基化物是指在上述儿茶素类中，至少有一个OH基的H被甲基取代后的产物。作为儿茶素类的甲基化物的实例，可例举在表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯中的3’位、4’位、3″位及4″位上的任一个OH基的H被甲基取代的产物。可在本发明中使用的儿茶素类及儿茶素类的甲基化物可来自天然物，也可以是合成物。作为天然物的例子，可例举茶提取物、其浓缩物及纯化物(例如，Teavigo(DSMNutrition Japan)、Polyphenon(三井农林)及Sunphenon(太阳化学)等的绿茶提取物)、及红富贵茶提取物。
本发明中，作为类黄酮类，可使用单一的化合物，也可使用2种以上类黄酮类的混合物。
(糖供体)
本说明书中，“糖供体”除特殊情况外，是指在本发明的方法中可成为酶的底物，水解后可向类黄酮类提供糖残基的糖质。可在本发明中使用的糖供体是包含麦芽三糖残基的糖质，其中包含麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、糊精、γ-环糊精及可溶性淀粉。本说明书中，“糊精”除特殊情况外，是指将淀粉水解后的产物，“可溶性淀粉”除特殊情况外，指淀粉的水解物且可溶于热水的产物。水解可通过酸、热、酶等任何方法进行。本发明中，作为糊精可使用例如平均分子量为约3500的糊精，作为可溶性淀粉可使用例如平均分子量为约100万的淀粉。
本发明中所述的“严谨条件”除特殊情况外，指6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC的条件或与其同等的杂交条件，而且根据需要，本发明中也可适用严谨性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC或与其同等的杂交条件。在各种条件下，温度可设定为约40℃以上，如需严谨性更高的条件，例如可以设定为约50℃、进一步设定为约65℃的条件。
另外，在说明书中，“1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的碱基序列”中发生置换等的核苷酸个数，只要其碱基序列组成的多核苷酸所编码的蛋白质具有所需功能即可，无特别的限定，可为1～9个或1～4个左右，或者，若编码同一或性质相似的氨基酸序列的置换等，则可具有更多个数的置换等。此外，本说明书中，“1个或多个碱基发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列”中发生置换等的氨基酸个数，只要包含该氨基酸序列的蛋白质具有所需的功能即可，无特别的限定，可为1～9个或1～4个左右，或如果是性质相似的氨基酸的置换，可有更多个数的置换等。用于制备与此种碱基序列或氨基酸序列相关的多核苷酸或蛋白质的方法已为本领域技术人员所公知。
关于本说明书中的氨基酸序列，高度同一性是指至少60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的序列的同一性。
与多核苷酸序列或氨基酸序列的同一性有关的检索、分析，可通过本领域技术人员公知的算法或程序(例如，BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)进行。使用程序时的参数，只要是本领域技术人员可适当设定，还可使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体的方法也为本领域技术人员所公知。
本发明的多核苷酸可从天然物中利用杂交的技术、聚合酶链反应(PCR)技术等获得。
本发明的多核苷酸优选来自木霉属(Trichoderma)，更优选来自绿色木霉(Trichoderma viride)。
本发明还提供包含本发明的多核苷酸的重组载体、由该重组载体转化的转化体(例如转化大肠杆菌、转化酵母、转化昆虫细胞)。本发明还进一步提供转化方法，该转化方法包含使用本发明的多核苷酸转化宿主(例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞)的工序(例如，用本发明的重组载体转化的工序)。
插入本发明多核苷酸的载体，只要是能够使插入物在宿主内表达的载体即可，无特别的限制，载体通常具有启动子序列、终止子序列、用于通过外界刺激使插入物诱导性表达的序列、通过用于插入目的基因的限制性内切酶识别的序列及编码用于选择转化体的标记物的序列。重组载体的制备、通过重组载体的转化方法可适用本领域技术人员公知的方法。
〔糖苷酶蛋白质〕
本发明还提供新型糖苷酶蛋白质及其同源物、即包含下述(i)、(j)或(k)的蛋白质(优选下述(i)、(j)或(k)的蛋白质)：
(i)蛋白质，其由序列号：10中记载的氨基酸序列组成；
(j)蛋白质，其由序列号：10记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性；
(k)蛋白质，其由与序列号：10中记载的氨基酸序列具有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性。
本发明还提供上述新型糖苷酶蛋白质中除去了推定分泌信号序列部分后的成熟蛋白质及其同源物，即包含下述(p)、(q)或(r)的蛋白质(优选为下述(p)、(q)或(r)的蛋白质)：
(p)蛋白质，其由序列号：26中记载的氨基酸序列组成；
(q)蛋白质，其由序列号：26记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性；
(r)蛋白质，其由与序列号：26中记载的氨基酸序列具有至少60％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有类黄酮类的糖苷化活性。
本发明还提供来自木霉属(Trichoderma)、优选来自绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Trichodermasaturnisporum、Trichoderma ghanense、康氏木霉(Trichoderma koningii)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)或多孢木霉(Trichoderma polysporum)的、由包含序列号：11～24中任一项记载的碱基序列的多核苷酸编码的、具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质。此种蛋白质的优选实例可举出如下蛋白质，其由包含序列号：11～24中任一项记载的碱基序列、与序列号：6、9或25中记载的碱基序列有高度同一性的多核苷酸编码，具有类黄酮类的糖苷化活性。
本发明的蛋白质可从如下培养上清中分离、纯化，该培养上清为将属于木霉属(Trichoderma)的菌、例如绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Trichoderma saturnisporum、Trichodermaghanense、康氏木霉(Trichoderma koningii)、钩状木霉(Trichodermahamatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)或多孢木霉(Trichodermapolysporum)在公知的培养液中培养后得到的培养上清。另外，可通过由插入本发明多核苷酸的重组载体转化的转化体(例如，转化酵母、转化大肠杆菌)得到重组蛋白质。
〔酶TRa2的酶学性质〕
由本发明提供的新型酶蛋白质中，特别优选的例子是从绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141株的培养上清中得到的、由序列号：10中记载的氨基酸序列组成的糖苷酶(本说明书中，也称为“TRa2”)。该酶在类黄酮与糖供体的反应中，具有以下酶学特征。
糖供体选择性：
该酶在实施例所示的条件下，以麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、可溶性淀粉、糊精、γ-环糊精等为糖供体，但纤维二糖、葡聚糖、麦芽糖一水合物、羧甲基纤维素钠、异麦芽低聚糖、α-环糊精、β-环糊精等不作为糖供体。而且该酶是不仅能够产生葡萄糖为1分子或2分子的糖，还可产生葡萄糖为3分子(G3)以上的糖链长度的糖苷的糖苷酶。
底物特异性：
该酶可广泛作用于包含儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、柚皮素、槲皮素、大豆素、金雀异黄素、山奈酚等主要的类黄酮、七叶亭等的多酚，并可进行糖苷化。
反应最佳温度、pH(反应温度依赖性、pH依赖性)：
该酶在水解反应中，在实施例所示的条件下，约20℃～约60℃、特别是约35℃～约55℃下充分反应，且在pH约4.0～约7.0、特别是pH约4.5～约5.5时充分反应。
此外，该酶在糖转移反应中，在实施例所示的条件下，约20℃～约60℃、特别是约45℃～约55℃下充分反应，且在pH约4.0～约9.0、特别是pH约4.5～约7.0时充分反应。
温度稳定性、pH稳定性：
该酶在实施例所示的条件中，约20℃～约45℃下处理1hr时不丧失活性，且在pH约5.0～约9.0的室温下处理16hr时也不丧失活性。
〔类黄酮类的糖苷的制造方法〕
本发明还提供类黄酮类的糖苷的制造方法，其特征在于，使本发明的新型糖苷酶作用于类黄酮类和糖供体(优选糊精、可溶性淀粉、γ-环糊精)的混合液。
由本发明提供的类黄酮类的糖苷如下式所示：
式(I)
式(I)中：
R¹～R⁵中至少一个是糖残基，其他是OH或OCH₃，或
R¹～R⁴中至少一个是糖残基、其他是OH或OCH₃，R⁵是H；而且
X是H、CH₃、没食子酰基或被甲基化的没食子酰基。
其中进一步包含用下式表示的类黄酮类的糖苷：
5-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素；
5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素；
4’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素；
4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素；
3’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素；
3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素；
7-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯；
7-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯；
3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯；及
3’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯及这些的光学异构体。
〔糖苷的用途〕
通过本发明得到的糖苷可作为食品用组合物、医药用组合物或化妆用组合物使用。更详细地说，例如配合了儿茶素类糖苷的物质与儿茶素同样，可作为用于抗过敏、抗氧化、抗癌、抗炎症、抗菌·抗龋齿、抗病毒、解毒、改善肠内菌群、消臭、抑制血浆胆固醇上升、抑制血压上升、抑制血糖上升、抑制血小板凝集、预防痴呆、燃烧体脂肪、抑制体脂肪积累、提高持久力、抗疲劳、改善肾功能的制剂，或者可作为食品用组合物、医药用组合物或化妆用组合物使用。
食品用组合物包括补充营养食品、健康食品、饮食疗法用食品、综合健康食品、营养强化剂及饮料。饮料包含茶饮料、果汁、清凉饮料、营养剂。医药品组合物可为医药品或医药部外品，优选为口服制剂或皮肤用外用剂，可采用液剂、片剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、或洗剂、喷雾剂、硬膏剂、软膏剂的形态。化妆用组合物可为霜剂、液状化妆水、乳状化妆水、喷雾的形态。
对本发明的食品用组合物、医药用组合物或化妆用组合物中糖苷的配合量无特别限定，只要是本领域技术人员，均可参考对应的类黄酮类的优选一日摄取量，考虑溶解性、呈味等进行适当设定。例如，可将组合物中的本发明的糖苷的配合量设定为0.01～99.9重量％，此外，可将本发明的糖苷按每天100mg～20g分1～数次(例如3次)摄取，来确定组合物中的配合量。
本发明的食品用组合物、医药用组合物或化妆用组合物中可添加作为食品、医药或化妆品允许的各种成分。作为这些添加剂和/或成分的实例，可例举维生素类、糖类、赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、乳化剂、收缩剂(等张剂)、缓冲剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、着色剂、矫味剂、香料、凝固剂、pH调节剂、增稠剂、茶提取物、生药提取物、无机盐等。
〔其他方式〕
本发明中，糖苷酶蛋白质可固定在适当的载体上，从而可作为固定化酶使用。作为载体，可使用以往以相同目的使用的树脂，例如，可使用碱性树脂(例如，MARATHON WBA(Dow Chemical公司制)、SA系列、WA系列或FP系列(三菱化学)、及Amberlite IRA904(ORGANO))、疏水性树脂(例如，DIAION FPHA13(三菱化学)、HP系列(三菱化学)、Amberlite XAD7(ORGANO))等。除此之外，也可适合使用Express-Ion D(Whatman)、DEAE-Toyopearl650M(Tosoh)、DEAE-SepharoseCL4B(Amersham Biosciences)等。作为固定化的方法，可采用以往的物理吸附、通过离子键或共价键进行固定的结合法、用具有二价官能团的试剂进行交联固定的交联法、在网眼结构的凝胶或半透膜中包埋酶的包埋法中的任一种。例如，首先，使溶解于蒸馏水的酶20～2000mg、例如50～400mg吸附于5mL各树脂后，除去上清，进行干燥。
本发明还提供如下方法，其为确定编码具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质的多核苷酸的碱基序列或具有类黄酮类的糖苷化活性的蛋白质的氨基酸序列的方法，其特征在于，使用序列号：6、序列号：9、序列号：10、序列号：11～26中任一项记载的碱基序列或氨基酸序列的全部或一部分。
发明效果
通过本发明，能够提供可对类黄酮进行高效糖苷化的新型酶及其基因。
通过用本发明的新型酶对类黄酮类进行糖苷化，可提高水溶性。因此，通过本发明可提高类黄酮类的口服吸收性。此外，水溶性的提高不仅有助于提高在水中的溶解速度，还有助于提高在生物体内的吸收速度。因此，通过本发明，可使类黄酮类的有效活性、例如使抗氧化活性在生物体内得到高效发挥。
而且，通过用本发明对类黄酮类进行糖苷化，可改变类黄酮类的呈味。特别是通过本发明，对作为类黄酮类的儿茶素类等呈现苦味、涩味的物质进行糖苷化时，可减少此类呈味。
而且通过用本发明对类黄酮进行糖苷化，可提高热稳定性。
附图说明
图1是用绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141粗酶液处理儿茶素时的HPLC分析图。
图2表示对于从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)的基因组信息数据库中提取的、具有alpha-amylase，catalytic domain(accession No.PF00128)的基序的推定ORF的氨基酸序列，通过系统树制作程序Tree view制作的系统树图。
图3是表示对图2中组1的4个氨基酸序列进行比对时保守性高的部分(下划线部)的图。
图4是比较TRa2的基因组DNA序列(序列号6)和cDNA序列(序列号9)的图。
图5是表示TRa2的cDNA碱基序列、及与其对应的推定氨基酸序列的图。双下划线部是推定分泌信号序列。
图6是比较TRa2的推定氨基酸序列和高峰淀粉酶前体氨基酸序列(GBNo.BAA00336)的一级结构的图。下划线部：TRa2的推定分泌信号，虚线下划线部：高峰淀粉酶的分泌信号，双下划线部：α-淀粉酶家族酶中高度保守的4个区域、＊号氨基酸残基：位于催化部位的氨基酸残基。
图7是在绿色木霉(T.viride)IAM5141的培养上清的原液或其浓缩液中加入(+)-儿茶素或(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和糊精使其反应时反应液的HPLC分析图。
图8是表示从由木霉属(Trichoderma)的各种菌株制备的基因组DNA中得到的、TRa2同源物的部分碱基序列的比对结果图。
图9是表示在从转化体(TRa2-1株)的培养上清中制备的TRa2的粗酶液中加入各糖受体底物((+)-儿茶素、(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯、七叶亭、柚皮素、槲皮素、大豆素、金雀异黄素、山奈酚)、糊精并使其反应时的糖苷化活性的图。
图10是表示TRa2的温度稳定性及pH稳定性的图。
图11是表示通过TRa2进行的糖质水解反应的温度依赖性及pH依赖性的图。
图12是表示通过TRa2进行的糖转移反应的温度依赖性及pH依赖性的图。
图13是表示将含有(+)-儿茶素或4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素的溶液在4～100℃的各温度下处理0～4小时后的各个残留量的图。
图14是表示(+)-儿茶素及5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素在水中溶解性的图。
实施例
〔实施例1：木霉属(Trichoderma)培养液的儿茶素糖苷化活性〕
取绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141株的斜面菌，接种于酵母膏(Difco)1％、多聚蛋白胨(日本制药)1％、糊精(Nacalai Tesque)2％的液体培养基10mL中，并在30℃下振荡培养1天，作为前培养液。再将前培养液全部接种于上述液体培养基900mL中，并在30℃下培养3天，通过过滤器过滤制备培养上清液。相对于培养上清690mL，添加硫酸铵387g(80％饱和)并搅拌后，通过离心分离回收沉淀。在所得到的沉淀中加入10mL的0.1M醋酸缓冲液(pH5.0)，制成粗酶液。
相对于粗酶液100μL，添加儿茶素3mg、糊精10mg，在50℃下搅拌24小时以进行酶反应。将反应液用0.1％三氟乙酸(TFA)稀释10倍，取10μL用高效液相色谱法(HPLC)进行分析。
分析条件
色谱柱：Develosil C30-UG-5(4.6×150mm)
梯度条件：5％B液→50％B液/20分钟
洗脱液A：0.1％TFA/蒸馏水
洗脱液B：90％乙腈/0.08％TFA
流量：1mL/min
检测波长：280nm
如图1所示，能够确认通过上述反应生成了儿茶素糖苷。且作为糖供体使用γ-环糊精时也能够确认出有同样的糖苷生成。由此表明，绿色木霉(T.viride)IAM5141株是将糊精或γ环糊精作为糖供体，而分泌产生了对儿茶素进行糖苷化的酶。
〔实施例2：通过PCR克隆α-淀粉酶同源物的部分序列〕
糊精及γ-环糊精是葡萄糖通过α-1，4键结合的聚合物，因目的酶具有分解该聚合物的活性，所以，表明有可能是类似α-淀粉酶家族酶的酶。
因此，在与木霉属同样的子囊菌类的丝状菌的基因组序列已明确的微生物中，从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的基因组信息数据库中，分别选取9个、6个、8个、6个具有蛋白质家族数据库(PFAM)中α-淀粉酶(alpha-amylase)、催化结构域(catalytic domain)(accession No.PF00128)的基序的推定ORF的氨基酸序列。将其通过序列同源性检索程序ClustalW制作比对图，通过系统树制作程序Tree view制成系统树，根据同源性进行分组。将图2中组1的4个氨基酸序列(括号内为Genebank登录号No.)MG02772.4(EAA47529)、MG10209.4(EAA48146)、AN3388.2(EAA63356)、FG03842.1(EAA71544)进行比对，合成与保守性高的部分(图3下划线部)的氨基酸序列相对应的寡聚DNA。
AMY-12f：
5’-TAYTGYGGNGGNACNTTYAARGGNYT-3’(序列号：1)
AMY-15r：
5’-TTYTCNACRTGYTTNACNGTRTCDAT-3’(序列号：2)
AMY-17r：
5’-GGTNAYRTCYTCNCKRTTNGCNGGRTC-3’(序列号：3)
从上述培养的约1g绿色木霉(T.viride)IAM5141菌体的湿菌体中，通过DNeasy plant Maxi Kit(QIAGEN)提取基因组DNA。以该基因组DNA 50ng为模板，使用引物AMY-12f和引物AMY-15r、或引物AMY-12f和引物AMY-17r进行PCR反应。即、使用ExTaq(TAKARA BIO公司制)，进行94℃2分钟、(94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟)30个循环、72℃10分钟的反应。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析时，可确认引物AMY-12f和引物AMY-15r的组合约0.6kbp、引物AMY-12f和引物AMY-17r的组合约1.0kbp的片段。将这些DNA片段从琼脂糖凝胶中切出，通过GFX PCR DNA and Gel BandPurification Kit(Amersham Biosciences)纯化DNA。将其用TOPO-TA cloningkit(invitrogen)进行克隆，用ABI3100Avant(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)公司制)进行碱基序列的分析。前者得到的碱基序列包含在后者得到的碱基序列中。通过Blastx将该碱基序列相对于在GenBank中登录的氨基酸序列进行同源性检索时，与MG10209.4(EAA48146)显示最高的同源性。
〔实施例3：α-淀粉酶同源物的基因组序列的确定〕
根据所得到的约1.0kbp的碱基序列设计以下引物，进行Inverse PCR(反向PCR)。
TRa2-2：
5’-CCAACCTGGTATCTACATAC-3’(序列号：4)
TRa2-3：
5’-AGATGGCATCAAATCCCAT-3’(序列号：5)
首先，将由绿色木霉(T.viride)IAM5141制备的基因组DNA用HindIII或PstI完全酶切，通过ligation high(东洋纺)，在16℃下反应过夜，通过自身环化闭环。以这些DNA 0.1μg为模板，使用上述引物TRa2-2及TRa2-3进行PCR反应。PCR是使用LA Taq(TAKARA BIO)，进行94℃2分钟、(95℃30秒、66℃15分钟)30个循环、72℃10分钟的反应。将所得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析时，在以用HindIII酶切的基因组DNA为模板的分析中，可确认约2kb的DNA片段，在以用PstI酶切的基因组为模板的分析中，可确认约4.5kb的DNA片段。将其分别从琼脂糖凝胶中切出，与前述同样进行克隆。从所插入的片段的两端分别确定碱基序列。来自用HindIII酶切的基因组的片段和来自用PstI酶切的基因组的片段到该限制性内切酶位点的碱基序列一致。将如此得到的碱基序列与之前得到的部分序列连接。该碱基序列如图4(TRa2-gDNA)及序列号：6所示。根据与图2中组1的4个序列的比较及起始密码子、终止密码子出现的位置等推定α-淀粉酶同源物的编码区域。认为起始密码子是碱基位号423-425的ATG、终止密码子是1926-1928的TAA。
〔实施例4：α-淀粉酶同源物的cDNA的克隆〕
从之前培养的约0.1g绿色木霉(T.viride)IAM5141株的菌体中，通过RNeasy plant mini kit提取总RNA。将1μg的总RNA通过SuperScriptFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen)，使用6碱基随机引物(Random Hexamer)合成cDNA。
根据之前得到的基因组序列设计以下引物。
TRa2EcoRI-f2：
5’-GGAATTCATGAAGCTTCGATCCGCCGTCCC-3’(序列号：7)
TRa2XhoI-r2：
5’-CCGCTCGAGTTATGAAGACAGCAGCACAAT-3’(序列号：8)
以合成的cDNA为模板，使用上述引物TRa2EcoRI-f2及TRa2XhoI-r2进行PCR反应。PCR使用Ex Taq(TAKARA BIO)，进行94℃2分钟、(94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟)30个循环、72℃10分钟的反应。对所得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析时，可确认出约1.5kb的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中切出，用GFX纯化。将所得到的DNA片段用TOPO-TAcloning kit(invitrogen)克隆，构建质粒pCRTRa2-cDNA，确定cDNA的碱基序列(图4、图5及序列号：9)。将之前得到的基因组DNA序列与cDNA序列进行比较时，基因组序列中含有2个内含子(图4)。在cDNA序列中有1392bp的ORF，编码由463个氨基酸残基组成的蛋白质(图5及序列号：10)。将该基因命名为TRa2。将由该基因编码的推定氨基酸序列用SignalP(Nielsen H.et.al.，Protein Eng.，10，1-6，1997)分析的结果，认为从N末端开始20个氨基酸残基是分泌信号序列。而且将由TRa2编码的推定氨基酸序列按前述方法进行同源性检索时，显示了与AN3388.2(EAA63356)有最高的同源性。将TRa2蛋白质的推定氨基酸序列与已知的作为α-淀粉酶的高峰淀粉酶的氨基酸序列进行比较。其结果，在该酶中也保留有α-淀粉酶家族酶的4个保守区域(图6双下划线)，成为活性中心的天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基也全部被保留(图6＊号氨基酸残基)。
〔实施例5：酵母中TRa2蛋白质分泌表达系统的构建〕
将用限制性内切酶EcoRI及XhoI酶切质粒pCRTRa2-cDNA后得到的约1.5kb的片段与用限制性内切酶EcoRI及SalI酶切质粒pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59(7)，1221-1228，1995)后得到的片段使用ligationhigh(东洋纺)进行连接，获得质粒pYETRa2。
通过质粒pYETRa2，用醋酸锂法转化酿酒酵母(S.cerevisiae)EH1315株。将所得到的转化株作为TRa2-1株。在YPD(Difco)液体培养基10mL中接种一白金耳TRa2-1株，在30℃下振荡培养2天。因TRa2蛋白质在N末端存在20个氨基酸残基所组成的分泌信号序列，所以，认为其是在培养液中分泌的。通过离心分离沉淀菌体，回收培养上清。
〔实施例6：TRa2的糖分解活性的测定〕
使用Microcon YM-30(Amicon)，将培养上清500L浓缩约5倍。将上述浓缩液10μL添加到含有0.5％的麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、糊精、α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精的20mM醋酸缓冲液(pH5.0)100μL中，在50℃下反应1小时。
反应终止后，如下用TLC进行分析。薄板使用硅胶G-60薄板(Merck)，作为展开液使用2-丙醇∶丙酮∶0.5M乳酸＝2∶2∶1。按硫酸∶乙醇＝1∶9喷雾、风干后，用加热板加热进行检测。其结果，在用载体pYE22m转化的对照株(C-1株)的培养液中，未确认出有任何糖的分解。另一方面，虽可确认TRa2-1株的培养液中麦芽三糖、麦芽四糖、糊精及γ-环糊精被分解而主要生成了麦芽糖及葡萄糖，但未能确认出麦芽糖、α-环糊精及β-环糊精的分解。
〔实施例7：TRa2的糖转移活性的测定〕
在培养上清的原液、或用VIVASPIN 10000MWCO/PES制(VIVASCIENCE公司)浓缩约5倍的培养上清浓缩液100μL中，加入(+)-儿茶素或(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯3mg和糊精10mg，在50℃下搅拌、反应1天。反应终止后，将反应液用0.1％三氟乙酸溶液稀释10倍，用高效液相色谱法(HPLC)在与实施例1同样的条件下进行分析。其结果，在与用载体pYE22m转化的对照株(C-1株)的培养上清进行反应的反应液中，未能确认出反应生成物，相对于此，可确认出TRa2-1株生成了儿茶素糖苷及表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯糖苷(图7)。
〔实施例8：通过TRa2进行的儿茶素糖苷的制造〕
将TRa2-1株接种于YPD液体培养基200mL中，在30℃下振荡培养3天。通过离心分离收集菌体，得到培养上清。使用超滤盘：NMWL30000/再生纤维素，在加入0.1M醋酸缓冲液(pH5)100mL的同时将该培养上清100mL浓缩至50mL，作为TRa2酶液。在上述TRa2酶液50mL中混合(+)-儿茶素1.5g和糊精5g，在45℃下搅拌18hr。将反应液离心分离，使上清吸附在LH20(AmershamBiosciences)树脂60mL/Φ2.5×20cm色谱柱上。用蒸馏水120mL、10％乙醇240mL洗脱，回收、冷冻干燥糖苷组分，得到冻干粉末530mg。取其50mg溶于蒸馏水5mL中，在DevelosilC30-UG-5色谱柱20×250mm、A：0.1％TFA/蒸馏水、B：90％甲醇/0.1％TFA、30％B、3mL/min、280nm条件下制备。按HPLC的保留时间快的顺序回收、冷冻干燥谱峰1～6。由MS及NMR分析，表明谱峰1是5-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素，谱峰2是5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素，谱峰3是4’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素，谱峰4是4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素，谱峰5是3’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素，谱峰6是3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素。
5-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素：m/z615.2、NMRδppm(D₂O)；2.71(1H，dd)，2.85(1H，dd)，3.42(1H，t)，3.56-3.85(9H，m)，4.19(1H，t)，4.26(1H，dd)，4.87(1H，d)，5.70(1H，d)，6.19(1H，d)，6.39(1H，d)，6.83(1H，dd)，6.90-6.93(2H，m)。
5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素：m/z 453.2、NMRδppm(D₂O)；2.62(1H，dd)，2.81(1H，dd)，3.43(1H，t)，3.45-3.55(1H，m)，3.6-3.7(3H，m)，3.83(1H，t)，4.18(1H，dd)，4.76(1H，d)，5.61(1H，d)，6.09(1H，d)，6.31(1H，d)，6.77(1H，d)，6.8-6.9(2H，m)。
4’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素：m/z615.2、NMRδppm(D₂O)；2.54(1H，dd)，2.81(1H，dd)，3.43(1H，t)，3.60(1H，dd)，3.68-3.94(9H，m)，4.19-4.28(2H，m)，4.82(1H，d)，5.44(1H，d)，5.62(1H，d)，6.04(1H，d)，6.11(1H，d)，6.91(1H，dd)，7.00(1H，d)，7.22(1H，d)。
4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素：m/z 453.2、NMRδppm(D₂O)；2.45(1H，dd)，2.73(1H，dd)，3.45(1H，t)，3.65-3.75(4H，m)，4.11(1H，dd)，4.7-4.75(2H，m)，5.53(1H，d)，5.95(1H，d)，6.02(1H，d)，6.83(1H，dd)，6.91(1H，d)，7.15(1H，d)。
3’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(+)-儿茶素：m/z615.2、NMRδppm(D₂O)；2.54(1H，dd)，2.80(1H，dd)，3.44(1H，t)，3.59(1H，dd)，3.67-3.90(9H，m)，4.17-4.24(2H，m)，4.83(1H，d)，5.41(1H，d)，5.55(1H，d)，6.03(1H，d)，6.10(1H，d)，7.10(1H，d)，7.06(1H，d)，7.26(1H，d)。
3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素：m/z 453.2、NMRδppm(D₂O)；2.43(1H，dd)，2.73(1H，dd)，3.27(1H，s)，3.44(1H，t)，3.6-3.7(4H，m)，3.88(1H，t)，4.10(1H，dd)，4.69(1H，d)，5.46(1H，d)，5.93(1H，s)，6.01(1H，s)，6.89(1H，d)，6.94(1H，dd)，7.18(1H，d)。
〔实施例9：通过TRa2进行的表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯糖苷的制造〕
将TRa2-1株接种于YPD液体培养基100mL中，在30℃下振荡培养3天。通过离心分离收集菌体，得到培养上清。使用超滤盘：NMWL30000/再生纤维素，在加入0.1M醋酸缓冲液(pH5)50mL的同时将该培养上清45mL浓缩至20mL，制成TRa2酶液。在TRa酶液20mL中混合(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯600mg和糊精2g，在50℃下搅拌1天。离心反应液，使上清吸附于LH2O树脂25mL/Φ1.5×30cm色谱柱上。用蒸馏水100mL、10％乙醇100mL、20％乙醇100mL、30％乙醇200mL洗脱，回收、冷冻干燥30％乙醇组分。将冻干粉末120mg溶于蒸馏水12mL中，在DevelosilC30-UG-5色谱柱20×250mm、A：0.1％TFA/蒸馏水、B：90％甲醇/0.1％TFA、40％B、3mL/min、280nm的条件下进行制备。由MS及NMR分析，表明谱峰2是7-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，谱峰5是3’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，谱峰6是3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯。另-方面，由MS(m/z 621.2、1107.3)，表明谱峰3是葡萄糖苷和麦芽四糖苷(maltotetraoside)的混合物，从保留时间来看，认为葡萄糖苷是7-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯。
7-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯：m/z 783.2、NMRδppm(CD₃OD)；2.88(1H，dd)，2.01(1H，dd)，3.26(1H，t)，3.46(1H，dd)，3.6-3.9(9H，m)，4.08(1H，t)，5.00(1H，s)，5.20(1H，d)，5.43(1H，d)，5.54(1H，s)，6.27(1H，d)，6.34(1H，d)，6.51(2H，d)，6.94(2H，d)。
3’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯：m/z621.1，δppm(CD3OD)；2.88(1H，dd)，2.99(1H，dd)，3.42(1H，dd)，3.51(1H，t)，3.69(1H，m)，3.8-3.9(3H，m)，4.88(1H，d)，4.98(1H，s)，5.49(1H，broad s)，5.95(1H，d)，5.96(1H，d)，6.65(1H，d)，7.01(2H，s)，7.11(1H，d)。
3’-O-(4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯：m/z 783.2，δppm(CD3OD)；2.87(1H，broad d)，2.99(1H，dd)，3.27(1H，t)，3.44-3.48(2H，m)，3.6-3.8(4H，m)，3.85(2H，d)，3.98(1H，dd)，4.06(H，t)，4.85(1H，d)，4.99(1H，s)，5.28(1H，d)，5.49(1H，broad s)，5.94(1H，d)，5.96(1H，d)，6.64(1H，d)，7.01(2H，s)，7.09(1H，d)。
〔实施例10：TRa2蛋白质的酵母表面表达系统的构建〕
为使TRa2蛋白质在酵母的表面展示表达，构建以下载体。以质粒pCRTRa2-cDNA为模板，使用引物TraEcoRI-f2和引物TRa2XhoI-r3进行PCR反应。PCR使用Ex Taq(TAKARA BIO)，进行94℃2分钟、(94℃1分钟、58℃1分钟、72℃2分钟)25个循环、72℃10分钟的反应。将所得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析时，可确认出约1.5kb的DNA片段。
将该片段从琼脂糖凝胶中切出，用GFX纯化。将所得到的DNA片段用TOPO-TA cloning kit(invitrogen)克隆，确认碱基序列，作为质粒pCRTRa2-cDNA2。将用EcoRI和XhoI酶切质粒pCRTRa2-cDNA-2后得到的约1.5kb的DNA片段与用EcoRI和XhoI酶切质粒pGA11(Appl.Environ.Microbiol.，63，1362-1366(1997)后得到的约9.2kb的DNA片段连接，得到质粒pCAS-TRa2。
〔实施例11：TRa2蛋白质表面表达酵母活性的确认〕
用质粒pCAS-TRa2转化酿酒酵母(S.cerevisiae)EH1315株。将所得到的转化株作为TRa2-2株。将1白金耳TRa2-2株及用在质粒pGA11的葡萄糖淀粉酶基因的分泌信号和编码α-凝集素的3’端一半的基因之间插入多克隆位点的质粒pCAS1转化酿酒酵母(S.cerevisiae)EH1315株后得到的对照株(C-2株)接种于YPD液体培养基10mL中，在30℃下培养2天。通过离心分离回收菌体，用PBS洗涤后，悬浮于1mL PBS中。使用该悬浮液，与实施例6及实施例7同样进行糖分解反应及糖转移反应，对反应生成物进行分析。其结果，可确认TRa2-2株具有糊精分解活性及将糊精作为糖供体向儿茶素转移糖的活性，而C-2株没有这些活性。即表明TRa2-2株以TRa2具有活性的形态展示于酵母表面。
〔实施例12：从木霉属(Trichoderma)的各种菌株中的TRa2同源物的取得〕
将绿色木霉(Trichoderma viride)IFO31137株、绿色木霉(Trichodermaviride)SAM1427株、绿色木霉(Trichoderma viride)IFO31327株、绿色木霉(Trichoderma viride)IFO30498株、绿色木霉(Trichoderma viride)IFO5720株、里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31329株、里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31328株、里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31326株、Trichoderma saturnisporum IAM12535株、Trichodermaghanense_IAM13109株、康氏木霉(Trichoderma koningii)IAM12534株、钩状木霉(Trichoderma hamatum)IAM12505株、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)IFO31292株、多孢木霉(Trichoderma polysporum)SAM357株分别接种于酵母膏(Difco)1％、多聚蛋白胨(日本制药)1％、糊精(NacalaiTesque)2％的液体培养基10mL中，在30℃下振荡培养4天。通过过滤器过滤回收菌体，通过DNeasy plant mini Kit(QIAGEN)提取基因组DNA。以该基因组DNA50ng为模板，使用引物AMY-12f和引物AMY-15r进行PCR反应。即使用ExTaq(TAKARA BIO公司制)，进行94℃2分钟、(94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟)30个循环、72℃10分钟的反应。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析时，可确认出约0.6kbp的片段。将这些DNA片段从琼脂糖凝胶上切出，通过GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamBiosciences)纯化DNA。将其用TOPO-TA cloning kit(invitrogen)克隆，用ABI3100Avant(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)制)进行碱基序列的分析。其结果，得到了序列号：11～24的序列。比对结果如图8所示。TRa2基因中相当于这些序列的区域及这些序列之间的同源性为63～99.5％。
基于这些序列，使用与获得绿色木霉(T.viride)IAM5141的TRa2基因、cDNA全长同样的方法，即可获得与TRa2具有同样活性的TRa2同源物。
〔实施例13：TRa2的底物特异性分析〕
将TRa2-1株用YPD培养基10mL，在30℃下振荡培养过夜。将达到静止期的培养液接种于相同培养基中(2％(v/v))，在30℃下振荡培养3天。培养后，用离心分离回收上清，浓缩5倍，得到TRa2的粗酶液。在酶反应溶液(0.5mM及10mM糖受体底物((+)-儿茶素、(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯、七叶亭、柚皮素、槲皮素、大豆素、金雀异黄素、山奈酚)、10mg糊精、100mM醋酸缓冲液(pH 5.2)、粗酶液)100μL中45℃下反应24hr，用HPLC分析。结果如图9所示。
受体底物和糖苷生成物的面积比(％)为(+)-儿茶素：10％、(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯：17.7％、七叶亭：3.5％、柚皮素：4.4％、槲皮素：9.4％、大豆素：10.7％、金雀异黄素：6.8％、山奈酚：3.1％。
〔实施例14：TRa2鉴定〕
附加His-tag的TRa2蛋白质(TRa2-His)的表达：
TRa2-His表达用质粒的构建和转化酵母的取得
为了在TRa2蛋白质的C末端附加His-tag并使其在酵母中表达，设计以下引物。
TRa2HisXhoI-r2：Gctcgagttagtggtggtggtggtggtgtgaagacagcagcaa(序列号：28)。以质粒pCRTRa2-cDNA为模板，使用引物TraEcoRI-f2和引物TRa2HisXhoI-r2进行PCR反应。PCR使用Ex Taq(TAKARA BIO)，进行94℃2分钟、(94℃1分钟、58℃1分钟、72℃2分钟)25个循环、72℃10分钟的反应。将所得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析时，可确认出约1.5kb的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中切出，用GFX纯化。将所得到的DNA片段用TOPO-TA cloning kit(invitrogen)克隆，确认碱基序列，作为质粒pCRTRa2-cDNA-His。将用EcoRI和XhoI酶切pCRTRa2-cDNA-His后的约1.5kb的DNA片段与用限制性内切酶EcoRI及SalI酶切质粒pYE22m后的片段使用ligation high(东洋纺)连接，得到质粒pYE-TRa2-His。用质粒pYE-TRa2-His转化酿酒酵母(S.cerevisiae)EH1315株。将所得到的转化株作为TRa2-3株。
培养
将TRa2-3株在SD(-Trp)20mL中，在30℃下培养16hr。将前培养液接种于SD(-Trp)+100mM KH₂PO₄-KOH(pH 6.0)1L中，在30℃下培养3天。通过离心分离回收培养液上清。
纯化
将培养液上清注入用Buffer S1[20mM NaH₂PO₄-NaOH(pH 7.4)、10mM咪唑、0.5M NaCl、15mM 2-巯基乙醇]平衡化的Ni²⁺螯合的ChelatingSepharose Fast Flow(5mL、Pharmacia Biotech)色谱柱，用相同缓冲液(40mL)洗涤。而后通过Buffer E1[20mM NaH₂PO₄-NaOH(pH 7.4)、200mM咪唑、0.5M NaCl、15mM 2-巯基乙醇]洗脱与色谱柱结合的蛋白质。收集活性组分，使用VIVASPIN(30000MWCO、VIVASCIENCE)进行脱盐、浓缩。
而后，将酶溶液注入用Buffer S2[20mM KH₂PO₄-KOH(pH 7.4)、15mM2-巯基乙醇、0.1％CHAPS]平衡化的Resource Q(1mL、Pharmacia Biotech)色谱柱(1.5mL/min)，用相同缓冲液(10mL)洗涤。随后，通过Buffer E2[20mM KH₂PO₄-KOH(pH 7.4)、0.6M NaCl、15mM 2-巯基乙醇、0.1％CHAPS]的0-100％直线浓度梯度(60mL)洗脱与色谱柱结合的蛋白质。收集活性组分，使用VIVASPIN(30000MWCO、VIVASCIENCE)进行脱盐、浓缩。
再次用同样方法进行Resource Q柱色谱法，收集显示活性且在SDS-PAGE上为单一条带的组分，使用VIVASPIN(30000MWCO、VIVASCIENCE)进行脱盐、浓缩。
酶活性测定：
糖转移活性
将反应液(10mM儿茶素、10mg糊精、100mM Acetate-NaOH(pH 5.3)、酶溶液)100μL在45℃下搅拌24hr，通过添加0.5％TFA 100μL以终止反应。将反应终止后的样品离心分离，回收上清。将生成物按以下条件进行HPLC分析。HPLC条件：洗脱液A、0.1％TFA；洗脱液B、90％乙腈、0.08％TFA；分析色谱柱、Develosil C30-UG-5(4.6×150mm、NOMURA CHEMICAL)；流速、1mL/min；分离模式、0min-5％B、20min-50％B、20.5min-5％B、25min-5％B。
水解活性
使反应液(5mM麦芽四糖、20mM KH₂PO₄-KOH(pH 6.0)、酶溶液)100μL在35℃下反应15min，通过热处理(100℃、5min)终止反应。将反应终止后的样品离心分离，回收上清。将生成物按以下条件进行HPLC分析。HPLC条件：洗脱液、68％乙腈；分析色谱柱、SUPELCOSIL LC-NH₂(5μm、4.6×250mm、SUPELCO)；流速、1mL/min；分离模式、isocratic
温度稳定性分析：
将酶溶液(±10mM表没食子儿茶素没食子酸酯)在20～60℃的各温度下处理1hr后，冷却至4℃。在冷却后的样品中，添加10mM表没食子儿茶素没食子酸酯、10mg糊精进行反应(各温度，pH 5.3，24hr)。添加0.5％TFA使反应终止后，用反相HPLC进行分析。
结果如图10(左)所示。
pH稳定性分析：
在酶溶液(±10mM表没食子儿茶素没食子酸酯)中，添加各种pH的最终浓度为167mM的缓冲液(pH 4、4.5、5、Acetate-NaOH；pH 5.5、6、6.5、7、NaH₂PO₄-NaOH；pH 8、9、Tris-HCl)，在4℃下处理16hr后，添加最终浓度为400mM的Acetate-NaOH(pH 5.3)。在处理后的样品中，添加10mM表没食子儿茶素没食子酸酯、10mg糊精进行反应(45℃，各pH，24hr)。添加0.5％TFA使反应终止后，用反相HPLC进行分析。活性测定时反应液的Acetate-NaOH浓度为200mM。
结果如图10(右)所示。
反应温度依赖性分析：
在5mM麦芽四糖中添加酶，以进行水解反应(20～60℃的各温度，pH6.0、15min)。100℃、5min使反应终止后，用正相HPLC进行分析。结果如图11(左)所示。
另外，在10mM儿茶素、10mg糊精中添加酶，进行糖转移反应(20～60℃的各温度，pH 5.3，24hr)。添加TFA使反应终止后，用反相HPLC进行分析。结果如图12(左)所示。
反应pH依赖性分析：
在5mM麦芽四糖中添加酶，在各种pH的缓冲液中进行水解反应(35℃、pH 4、4.5、5、Acetate-NaOH；pH 5.5、6、6.5、7、NaH₂PO₄-NaOH；pH 8、9、Tris-HCl、15min)。100℃、5min使反应终止后，用正相HPLC进行分析。结果如图11(右)所示。
此外，在10mM儿茶素、10mg糊精中添加酶，进行糖转移反应(45℃、pH 4、4.5、5、Acetate-NaOH；pH 5.5、6、6.5、7、NaH₂PO₄-NaOH；pH 8、9、Tris-HCl、24hr)。添加TFA使反应终止后，用反相HPLC进行分析。结果如图12(右)所示。
〔实施例15：糖苷的鉴定〕
热稳定性：
将100μM的(+)-儿茶素、或含有4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)30μL在4～100℃的各温度下处理0～4小时后移到冰中，接着加入0.1％TFA 60μL，与实施例1同样进行HPLC分析。在各温度下处理时的(+)-儿茶素或4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素的残留量如图13所示。与儿茶素相比，4’-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素对热稳定。
溶解性：
将(+)-儿茶素或5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素添加于水中，使其成为10～450mg/mL的各浓度，并通过剧烈搅拌使其溶解。其后，通过离心分离除去沉淀物，将上清通过HPLC进行分析，对(+)-儿茶素及5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素的量进行定量。其结果如图14所示。(+)-儿茶素几乎不溶于水，而5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(+)-儿茶素则显示出至少40倍以上的溶解性。
工业实用性
通过本发明得到的新型酶基因或改造了该酶基因的基因、导入了上述基因的转化体、及新型酶蛋白质或改造了该酶蛋白质的蛋白质，在生产类黄酮类的糖苷或生产使用了这些糖苷的食品、医药品、化妆品上非常有用。
序列表
<110>三得利株式会社(Suntory Limited)
<120>新型糖苷酶及编码该酶的多核苷酸
     (NOVEL GLUCOSYLTRANSFERASES AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME)
<130>YCT-1339
<150>JP 2007-010759
<151>2007-01-19
<160>28
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>子囊菌类(Ascomycetes)
<220>
<223>Inventor：Ochiai，Misa
     Inventor：Fukami，Harukazu
     Inventor：Nakao，Masahiro
     Inventor：Noguchi，Akio
<220>
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<400>3
ggtnayrtcy tcnckrttng cnggrtc      27
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<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
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<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
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<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
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tcatacaaag ctatttcgaa gaccaatatt ctaccccctt ctccgacgat agagccctat    60
ggtaatgggc cgatgggttg cttattcggc cctttgtcgg ccggggcatg cgtgtttgac    120
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tggtggcctt taccaccaac agcggcggcg gcagctcggc ccagttctgc ttcggcacgc    1800
aggtccccaa cgggagctgg acgaatgtgt ttgatggcgg caatggcccg acgtacactg    1860
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ggatagatgt gcttgaaaga cctgccatgc gctcaaagta attgttattg aatagtccgt    2280
cccaaaatat taactgcagt gccgagatat ctgttgttcc gtcaggcctg ttcaacctgc    2340
ggggatagaa aatctccatg tgctcatgag tgcataaatt ccgcaccgaa tcctccgctt    2400
ccaaaaaaaa aaaagaagca atattataaa aagcaaagtc gtcatgccgt caaatagcct    2460
ttatagtccc gtgtatgctc gcaagtcttg tccgtcgtcg ttagcctgta ttattcacat    2520
gcgtgtgtca tcgatagcct tgtgtttctc gtgtcgcacg atttgctctt gatattgacc  2580
acattccttc ggtacaatga gcaaatatat ataccgttgt ggtgggtaat gag         2633
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
<400>7
ggaattcatg aagcttcgat ccgccgtccc                                   30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
<400>8
ccgctcgagt tatgaagaca gcagcacaat                                   30
<210>9
<211>1392
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
<400>9
atgaagcttc gatccgccgt cccgctgctg ttgcagcttt ctctcccggc cgtccttggc    60
gccgacacgg cagactggag gtctcgtacc atctactttg ccctgacaga ccgaattgct    120
cgcagctcaa gcgacacggg aggctctgcg tgtacaaatc tgaatgacta ctgtggtggc    180
acgttccagg gcttggagag caagctggac tacatcaagg gcatgggatt tgatgccatc    240
tggatcaacc ccgtcgtaac caacagtgat ttcggcttcc atggctactg ggcactggat    300
ctaaacacta tcaattctca ctatggcact gcggatgatt taaagagtct cgttgatgct    360
gcacatggca agggcttcta catgatggtc gacgttgtag ccaaccacat gggaaacgca    420
aacatcacag acgactcccc ctcccctctg aaccaacaat cctcatacca cacaaaatgt    480
gacattgact tcaacaacca gaccagcgtc gaaaactgtt ggcttgctgg cctcccagac    540
gttgacaccc aggaccctac catcaggagc ctctaccagg actgggtgtc caacctggta    600
tctacatacg gcttcgacgg cgtccgcatc gacaccgtca ggcacgtcga gcaggactac    660
tggcccggct tcgtcaatgc cagcggcgtg tactgcatcg gcgaagtctt caacggagac    720
ccagacttta tgcagcccta ccaatcgctc atgcccggcc tcctcaacta cgccatcttc    780
taccccctca acgcctttta tcagcagacg ggctcctccc aagccctggt cgacatgcat    840
gaccgtctca gctcgttccc agacccgacg gcgctgggca cctttgtcga taaccacgac  900
aacccccgct tcctcagcgt caagaacgac acgtctctct tcaagaatgc cctgacctac  960
accattctcg gccgaggcat ccccattgtc tactacggct ccgagcaagc cttttcggga  1020
agcaacgacc ccgccaacag agaggacctc tggcgcagcg gctacaacac cgagacggac  1080
atgtacaatg ccatctccaa gctcaccttt gccaagcaca cggccggcgg cctcgccgac  1140
aacgaccaca agcacctgta cgtcgagccc acggcatacg cctggagccg cgccggcggc  1200
aagctggtgg cctttaccac caacagcggc ggcggcagct cggcccagtt ctgcttcggc  1260
acgcaggtcc ccaacgggag ctggacgaat gtgtttgatg gcggcaatgg cccgacgtac  1320
actgctgatg gcaatggaca gctctgcttg accacgacga atggtgagcc gattgtgctg  1380
ctgtcttcat aa                                                      1392
<210>10
<211>463
<212>PRT
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
<400>10
Met Lys Leu Arg Ser Ala Val Pro Leu Leu Leu Gln Leu Ser Leu Pro
1               5                   10                  15
Ala Val Leu Gly Ala Asp Thr Ala Asp Trp Arg Ser Arg Thr Ile Tyr
            20                  25                  30
Phe Ala Leu Thr Asp Arg Ile Ala Arg Ser Ser Ser Asp Thr Gly Gly
        35                  40                  45
Ser Ala Cys Thr Asn Leu Asn Asp Tyr Cys Gly Gly Thr Phe Gln Gly
    50                  55                  60
Leu Glu Ser Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Ile Asn Pro Val Val Thr Asn Ser Asp Phe Gly Phe His Gly Tyr
                85                  90                  95
Trp Ala Leu Asp Leu Asn Thr Ile Asn Ser His Tyr Gly Thr Ala Asp
            100                 105                 110
Asp Leu Lys Ser Leu Val Asp Ala Ala His Gly Lys Gly Phe Tyr Met
        115                 120                 125
Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Asn Ala Asn Ile Thr Asp
    130                 135                 140
Asp Ser Pro Ser Pro Leu Asn Gln Gln Ser Ser Tyr His Thr Lys Cys
145                 150                 155                 160
Asp Ile Asp Phe Asn Asn Gln Thr Ser Val Glu Asn Cys Trp Leu Ala
                165                 170                 175
Gly Leu Pro Asp Val Asp Thr Gln Asp Pro Thr Ile Arg Ser Leu Tyr
            180                 185                 190
Gln Asp Trp Val Ser Asn Leu Val Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Gly Val
        195                 200                 205
Arg Ile Asp Thr Val Arg His Val Glu Gln Asp Tyr Trp Pro Gly Phe
    210                 215                 220
Val Asn Ala Ser Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp
225                 230                 235                 240
Pro Asp Phe Met Gln Pro Tyr Gln Ser Leu Met Pro Gly Leu Leu Asn
                245                 250                 255
Tyr Ala Ile Phe Tyr Pro Leu Asn Ala Phe Tyr Gln Gln Thr Gly Ser
            260                 265                 270
Ser Gln Ala Leu Val Asp Met His Asp Arg Leu Ser Ser Phe Pro Asp
        275                 280                 285
Pro Thr Ala Leu Gly Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe
    290                 295                 300
Leu Ser Val Lys Asn Asp Thr Ser Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Ile Leu Gly Arg Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln
                325                 330                 335
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Asp Leu Trp Arg
            340                 345                 350
Ser Gly Tyr Asn Thr Glu Thr Asp Met Tyr Asn Ala Ile Ser Lys Leu
        355                 360                 365
Thr Phe Ala Lys His Thr Ala Gly Gly Leu Ala Asp Asn Asp His Lys
    370                 375                 380
His Leu Tyr Val Glu Pro Thr Ala Tyr Ala Trp Ser Arg Ala Gly Gly
385                 390                 395                 400
Lys Leu Val Ala Phe Thr Thr Asn Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ala Gln
                405                 410                 415
Phe Cys Phe Gly Thr Gln Val Pro Asn Gly Ser Trp Thr Asn Val Phe
            420                 425                 430
Asp Gly Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Thr Ala Asp Gly Asn Gly Gln Leu
        435                 440                 445
Cys Leu Thr Thr Thr Asn Gly Glu Pro Ile Val Leu Leu Ser Ser
    450                 455                 460
<210>11
<211>583
<212>DNA
<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31328
<400>11
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggatttga tgcaatctgg attacgcctg  60
ttgtgacgag tgagtttcac cttgccttgc cttgcgtcgc acaaagcctt cgggagggaa  120
taggtagctg actctgtgat acccatgggt agacagtgat ggcggctatc atggctactg  180
ggcggaggac attgactcca tcaattccca ttatggctct gcggacgact tgaagagtct  240
tgtcaatgcc gcgcatagca aggtactttc ttcccatcat cacatggctt tacccttttg  300
cgttgttcta aagcgagaga aactagggct tctatatgat ggtggatgtc gtcgccaacc  360
acatgggcta cgccaacatc accgacgata gtcctactcc tctgaaccaa gcctcttcgt  420
atcacccgga gtgtgacatc gactacaaca accagaccag cgtccaggaa tgctggatca  480
gtggtctccc ggatctcgac accgagagcc cgatgatccg cagcctctac caggactggg  540
tctccaacct cgtgtccacg tacggcttcg acggcgtccg cat                    583
<210>12
<211>592
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IFO31327
<400>12
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggatccga tgccatctgg atcacacctg  60
ttgtgacgag tgagtctttt cataccttgc cctgccttgc ctcgcctcgc cttgcatgtg  120
tcgcatacag gcttctggta tgcatagcta aacctgatac ctctggacag acagtgatgg  180
gggctaccat ggctattggg cggaggacat cgactccatc aactctcatt atggctctgc  240
ggacgatctc aagagtctcg tcaacgccgc gcatagcaag gtattccctt ttgttcacac  300
cagacttcat gattatcaaa attaacacaa accagggctt ctatatgatg gtggacgtcg  360
tggccaacca catgggctac gccaatatct ctgacgatag tccctctcca ctgaaccagg  420
cctcgtcgta tcaccccgag tgtgatatcg actacaacag ccaaaccagc gtcgagaact  480
gctggatcag cggcctcccg gatctcaaca cgcagagctc aaccatccgc agcctctacc  540
aggactgggt ctccaacctc gtgtccacgt acggcttcga cggcgtccgc at          592
<210>13
<211>583
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IFO5720
<400>13
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacgcctg  60
ttgtgacgag tgagtctttg ccctgtcccg ccttgcctcg ggtcgtacat gggctgctag  120
agtgaacagc tgacactgat acctctgaac agacagtgat gggggctacc atggctattg  180
ggcggaggat ctcgattcca tcaactctca ctacggctct gcggatgact tgaagagtct  240
cgtcaacgcc gcacatagca aggtacttct tcctggcatg atatgacctt cgcctattct  300
cctggttcta atgcgagaca aaccagggct tctatatgat ggtagacgtc gtggccaacc  360
acatgggcta cgccaacatc tccgatgaca gccccccccc tctgaaccag gcctcttcgt  420
atcacgccga gtgtgacatt gactacaaca accagaccag cgtccagaac tgctggatca  480
gcggcctccc tgatctcgac acgcagagcc cgaccatccg cagcctctac caggactggg  540
tctccgacct cgtgtccacg tacggcttcg acggcgtccg cat                    583
<210>14
<211>569
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IFO30498
<400>14
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacccccg  60
tcgttaccag tgagttgccg acctatcccc agccaatgat atcaattcat cctcttgatt  120
aatagctaac atgccttgaa tagacagcga tttcggatac cacggttact gggctcagga  180
tattaattcc atcaattctc actatggttc ctcggatgat ttaaagagtc ttgttgatgc  240
tgctcatagc aaggtatata tttacacgac actttcaatt ttatgggtct gtgctaaacc  300
aatcaacaac agggcttcta catgatggtc gatgtcgtcg ccaaccatat gggaaacgca  360
aacatcacag acgactctcc ctctcctctg aaccaagact cctcatacca cacaaagtgt  420
gacatcgacy tcaacaacca gaccagcgtc gaaaactgtt ggctcgccgg cctcccggat  480
cttgacactc aaagccctac catcaggagc ttgtaccagg actgggtgtc caaccttgta  540
tctacatacg gcttcgacgg cgtccgcat                                    569
<210>15
<211>592
<212>DNA
<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31329
<400>15
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacacctg  60
ttgtgacgag tgagtctttt cataccttgc cctgccttgc ctcgcctcgc cttgcatgtg  120
tcgcatacag gcttctggta tgcatagcta aacctgatac ctctggacag acagtgatgg  180
gggctaccat ggctattggg cggaggacat cgactccatc aactctcatt atggctctgc  240
ggacgatctc aagagtctcg tcaacgccgc gcatagcaag gtattccctt ttgttcacac  300
cagacttcat gattatcaaa attaacacaa accagggctt ctatatgatg gtggacgtcg  360
tggccaacca catgggctac gccaatatct ctgacgatag tccctctcca ctgaaccagg  420
cctcgtcgta tcaccccgag tgtgatatcg actacaacaa ccaaaccagc gtcgagaact  480
gctggatcag cggccycccg gatctcaaca cgcagagctc aaccatccgc agcctctacc  540
aggactgggt ctccaacctc gtgtccacgt acggcttcga cggcgtccgc at          592
<210>16
<211>592
<212>DNA
<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31328
<400>16
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacacctg  60
ttgtgacgag tgagtctttt cataccttgc cctgccttgc ctcgcctcgc cttgcatgtg  120
tcgcatacag gcttctggta tgcatagcta aacctgatac ctctggacag acagtgatgg  180
gggctaccat ggctattggg cggaggacat cgactccatc aactctcatt atggctctgc  240
ggacgatctc aagagtctcg tcaacgccgc gcatagcaag gtattccctt ttgttcacac  300
cagacttcat gattatcaaa attaacacaa accagggctt ctatatgatg gtggacgtcg  360
tggccaacca catgggctac gccaatatct ctgacgatag tccctctcca ctgaaccagg  420
cctcgtcgta tcaccccgag tgtgatatcg actacaacaa ccaaaccagc gtcgagaact  480
gctggatcag cggcctcccg gatctcaaca cgcagagctc aaccatccgc agcctctacc  540
aggactgggt ctccaacctc gtgtccacgt acggcttcga cggcgtccgc at          592
<210>17
<211>592
<212>DNA
<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31326
<400>17
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacacctg  60
ttgtgacgag tgagtctttt cataccttgc cctgccttgc ctcgcctcgc cttgcatgtg  120
tcgcatacag gcttctggta tgcatagcta aacctgatac ctytggacag acagtgatgg  180
gggctaccat ggctattggg cggaggacat cgactccatc aactctcatt atggctctgc  240
ggacgatctc aagagtctcg tcaacgccgc gcatagcaag gtattccctt ttgttcacac  300
cagacttcat gattatcaaa attaacacaa accagggctt ctatatgatg gtggacgtcg  360
tggccaacca catgggctac gccaatatct ctgacgatag tccctctcca ctgaaccagg  420
cctcgtcgta tcaccccgag tgtgatatcg actacaacaa ccaaaccagc gtcgagaact  480
gctggatcag cggcctcccg gatctcaaca cgcagagctc aaccatccgc agcctctacc  540
aggactgggt ctccaacctc gtgtccacgt acggcttcga cggcgtccgc at          592
<210>18
<211>583
<212>DNA
<213>康氏木霉(Trichoderma koningii)IAM12534
<400>18
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacgcctg  60
ttgtgacgag tgagtctttg ccctgtcccg ccttgcctcg ggtcgtacat gggctgctag  120
agtgaacagc tgacactgat acctctgaac agacagtgat gggggctacc atggctattg  180
ggcggaggat ctcgattcca tcaactctca ctacggctct gcggatgact tgaagagtct  240
cgtcaacgcc gcacatagca aggtacttct tcctggcatg atatgacctt cgcctattct  300
cctggttcta acgcgagaca aaccagggct tctatatgat ggtagacgtc gtggccaacc  360
acatgggcta cgccaacatc tccgatgaca gccctccccc tctgaaccag gcctcttcgt  420
atcacgccga gtgtgacatt gactacaaca accagaccag cgtccagaac tgctggatca  480
gcggcctccc tgatctcgac acgcagagcc cgaccatccg cagcctctac caggactggg  540
tctccaacct cgtgtccacg tacggcttcg acggcgtccg cat                    583
<210>19
<211>584
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)SAM1427
<400>19
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggatttga tgccatctgg atcactcctg  60
ttgtgacgag tgagtttcac cttgccttgc cttgcgtcgc acaaagcctt cgagagggaa  120
taggtagctg actctgtgat acccatgggt agacagtgat ggcggctatc atggctactg  180
ggcggaggac attgactcca tcaattccca ttatggctct gcagacgact tgaagagtct  240
tgtcaatgcc gcgcatagca aggtattttc ttcccagcat tggtttgatg tttgcccctt  300
tggcattatt ctcaagcaag aaaccagggc ttctatatga tggtggatgt cgtcgccaac  360
catatgggct acgccaacat caccgacgat agtcctactc ctctgaacca agcctcttcg  420
tatcacccgg agtgtgacat cgactacagc aaccagacca gcgtccagga atgctggatc  480
agcggcctcc cggatctcga caccgagagc ccgacgatcc gcagcctcta ccaggactgg  540
gtctccaatc tcgtgtccac gtacggcttc gacggcgtcc gcat                   584
<210>20
<211>614
<212>DNA
<213>Trichoderma  ghanense IAM13109
<400>20
tggagagcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacccctg  60
ttgtgacgag tgagtctttt gccttgcctt gccttgcctt gccttgcctt gccttgcctt  120
rccttgcctt gtgtcgcaca caggctcctg gaggaaatgg ctgatgctga taccttggaa  180
tagacagtga tgggggttat catggctatt gggcggagga cattgattcc atcaactctc  240
attacggctc tgcggacgac ctgaagagtc tcgtcaatgc cgcgcatagc aaggtacatc  300
tccccatcat tgacataggt ttaccctttt gcatgattct gacgtgagac aaaccagggc  360
ttctatatga tggtggacgt cgtggccaac cacatgggct acgccaacat ctccgacgac  420
agtccttctc ctctgaacca agcgtcgtcc tatcacccag agtgtgacat tgactacaac  480
aaccagacca gcgtccagaa ctgctggatc agcggcctcc cggatctcaa cacgcagagc  540
tcgacgatcc gcagcctcta ccagggctgg gtctccgacc tcgtgtccac ctacggcttc  600
gacggcgtcc gcat                                                    614
<210>21
<211>572
<212>DNA
<213>Trichoderma saturnisporum IAM12535
<220>
<221>misc_feature
<222>(445)..(445)
<223>n stands for any base
<400>21
tggagagcaa gctggactac atcaagggca tgggattcga tgccatctgg atcacgcctg  60
ttgtgacgag tgagtctttg attaccttgt gtcgcacaca gtcttataga ggagatggat  120
cacactgaca tgtccggata gacagtcagg ggggctacca wggctactgg gcagaggaca  180
ttgactccat caattctcat tacggctctg cggacgacct gaagagtctc gtcaatgccg  240
cgcatagcaa ggtacttctt cctctcattg acatgccttt attcctttcg cgttgtccta  300
aaccgagatt tacagggctt ctatatgatg gtggatgtcg tcgccaacca catgggcaac  360
gccaacatct ccgacgatag tcctcctcct ctgaacgaag cctcttcgta tcacccccag  420
tgtgacattg actacaacaa ccamnccagc gtccagaact gctggatcag cggcctcccg  480
gatctcaaca cccagagctc gacgatccgc agcctctacc aggactgggt ccacaacctc  540
gtgtcgacgt acggcttcga cggcgtccgc at                                572
<210>22
<211>572
<212>DNA
<213>多孢木霉(Trichoderma polysporum)SAM357
<400>22
tggagggcaa gttggattac atcaagggga tgggatttga tgctatttgg atcacgcctg  60
ttgtaacgag taagttattc ataacagcct cagatatcat ctcctgggtc aatagctaat  120
atatcttgat agatagcgat caggggtatc atggctactg ggcagaggat ctcgattcta  180
tcaattctca ctatggttct tcggatgatt tgaagagtct tgtcgatgct gcacacagca  240
aggtacgtca tatcacctca cccccctaca ttctgctaat cctcatggat cgtgctaaac  300
cgaatgttaa aatagggctt ctatatgatg gtcgatgttg ttgccaatca catgggatat  360
gcaaacatca ccgacgacct tcccactcct ctaaaccaaa actcgtctta ccacgcagag  420
tgtaacatcg actataacaa tcagaccagc gtcgaaaact gctggatcga tggtctccca  480
gaccttgaca cacagagcga gactatccgc accctttaca aggactgggt ttccaacctc  540
gtctccacat acggcttcga cggcgtccgc at                                572
<210>23
<211>571
<212>DNA
<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)IFO31329
<400>23
tggagggcaa gttggactac atcaagggca tgggattcga cgccatctgg atcacgcccg  60
tcgttacgag tgagttacac acagcctcag gcattacctc ttgaatgcgc ttctaatgtt  120
aatatttaaa tagatagcga cggggggtac cacggttact gggctgagtc tctggattcg  180
atcaattctc attatggttc tgcggatgat ttaaagagtc tcgttgatgc tgcgcatagc  240
aaggtacgtg atactccaca ccccatctta tatgcctcta ttttcgaagt acggtgctaa  300
aaaggtgaaa acagggtttc tatatgatgg tagatgttgt tgccaatcat atgggttatg  360
ccaacatttc tgacgacctc ccaactcccc tgaacgaaaa ctcgtcgtat catccagaat  420
gcgacattga ctacaacaac cagaccagcg tcgaaaactg ctggatcgat ggccttccgg  480
atctcgacac tcagagccct accatccgca gcctctacca ggactgggtc tccaacctcg  540
tatcgaccta cggcttcgac ggcgtccgca t                                 571
<210>24
<211>572
<212>DNA
<213>钩状木霉(Trichoderma hamatum)IAM12505
<400>24
tggagagcaa gttggactat atcaagggca tgggatttga cgccatctgg atcacgcccg  60
tcgttacgag tgagttatat acagcctcac acattatccc ttcaaagagc atctaatatt  120
tatatttaaa tagacagtga taagggctat cacggctact gggcagaaga tatcgattct  180
attaattctc actatggttc tgcggacgat ttaaagagtc tcgtcgatgc tgcgcatagc  240
aaggtacatc atacgcaaca ccccatctta tatgcctcta ctctcgaaat gtcctgctaa  300
aacaagtgaa aacagggctt ctacatgatg gtagatgttg tcgccaatca tatgggctat  360
gccaatattc ctgacgacct tccaaccccc ctgaacgaga actcgtcgta tcacccggaa  420
tgcgacattg actacaacaa cgagaccagc gtcgaaaact gctggatcag cggtctcccc  480
gatctcgaca cccagagccc taccatccgc agtctctacc aggactgggt ctccaacctc  540
gtctcgacct acggcttcga cggcgtccgc at                                572
<210>25
<211>1329
<212>DNA
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
<400>25
gccgacacgg cagactggag gtctcgtacc atctactttg ccctgacaga ccgaattgct  60
cgcagctcaa gcgacacggg aggctctgcg tgtacaaatc tgaatgacta ctgtggtggc  120
acgttccagg gcttggagag caagctggac tacatcaagg gcatgggatt tgatgccatc  180
tggatcaacc ccgtcgtaac caacagtgat ttcggcttcc atggctactg ggcactggat  240
ctaaacacta tcaattctca ctatggcact gcggatgatt taaagagtct cgttgatgct  300
gcacatggca agggcttcta catgatggtc gacgttgtag ccaaccacat gggaaacgca  360
aacatcacag acgactcccc ctcccctctg aaccaacaat cctcatacca cacaaaatgt  420
gacattgact tcaacaacca gaccagcgtc gaaaactgtt ggcttgctgg cctcccagac  480
gttgacaccc aggaccctac catcaggagc ctctaccagg actgggtgtc caacctggta  540
tctacatacg gcttcgacgg cgtccgcatc gacaccgtca ggcacgtcga gcaggactac  600
tggcccggct tcgtcaatgc cagcggcgtg tactgcatcg gcgaagtctt caacggagac  660
ccagacttta tgcagcccta ccaatcgctc atgcccggcc tcctcaacta cgccatcttc  720
taccccctca acgcctttta tcagcagacg ggctcctccc aagccctggt cgacatgcat  780
gaccgtctca gctcgttccc agacccgacg gcgctgggca cctttgtcga taaccacgac  840
aacccccgct tcctcagcgt caagaacgac acgtctctct tcaagaatgc cctgacctac  900
accattctcg gccgaggcat ccccattgtc tactacggct ccgagcaagc cttttcggga  960
agcaacgacc ccgccaacag agaggacctc tggcgcagcg gctacaacac cgagacggac  1020
atgtacaatg ccatctccaa gctcaccttt gccaagcaca cggccggcgg cctcgccgac  1080
aacgaccaca agcacctgta cgtcgagccc acggcatacg cctggagccg cgccggcggc  1140
aagctggtgg cctttaccac caacagcggc ggcggcagct cggcccagtt ctgcttcggc  1200
acgcaggtcc ccaacgggag ctggacgaat gtgtttgatg gcggcaatgg cccgacgtac  1260
actgctgatg gcaatggaca gctctgcttg accacgacga atggtgagcc gattgtgctg  1320
ctgtcttca                                                          1329
<210>26
<211>443
<212>PRT
<213>绿色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141
<400>26
Ala Asp Thr Ala Asp Trp Arg Ser Arg Thr Ile Tyr Phe Ala Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Ala Arg Ser Ser Ser Asp Thr Gly Gly Ser Ala Cys Thr
            20                  25                  30
Asn Leu Asn Asp Tyr Cys Gly Gly Thr Phe Gln Gly Leu Glu Ser Lys
        35                  40                  45
Leu Asp Tyr Ile Lys Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro
    50                  55                  60
Val Val Thr Asn Ser Asp Phe Gly Phe His Gly Tyr Trp Ala Leu Asp
65                  70                  75                  80
Leu Asn Thr Ile Asn Ser His Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser
                85                  90                  95
Leu Val Asp Ala Ala His Gly Lys Gly Phe Tyr Met Met Val Asp Val
            100                 105                 110
Val Ala Asn His Met Gly Asn Ala Asn Ile Thr Asp Asp Ser Pro Ser
        115                 120                 125
Pro Leu Asn Gln Gln Ser Ser Tyr His Thr Lys Cys Asp Ile Asp Phe
    130                 135                 140
Asn Asn Gln Thr Ser Val Glu Asn Cys Trp Leu Ala Gly Leu Pro Asp
145                 150                 155                 160
Val Asp Thr Gln Asp Pro Thr Ile Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Trp Val
                165                 170                 175
Ser Asn Leu Val Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Gly Val Arg Ile Asp Thr
            180                 185                 190
Val Arg His Val Glu Gln Asp Tyr Trp Pro Gly Phe Val Asn Ala Ser
        195                 200                 205
Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Asp Phe Met
    210                 215                 220
Gln Pro Tyr Gln Ser Leu Met Pro Gly Leu Leu Asn Tyr Ala Ile Phe
225                 230                 235                 240
Tyr Pro Leu Asn Ala Phe Tyr Gln Gln Thr Gly Ser Ser Gln Ala Leu
                245                 250                 255
Val Asp Met His Asp Arg Leu Ser Ser Phe Pro Asp Pro Thr Ala Leu
            260                 265                 270
Gly Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Ser Val Lys
        275                 280                 285
Asn Asp Thr Ser Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Thr Ile Leu Gly
    290                 295                 300
Arg Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Ala Phe Ser Gly
305                 310                 315                 320
Ser Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Asp Leu Trp Arg Ser Gly Tyr Asn
                325                 330                 335
Thr Glu Thr Asp Met Tyr Asn Ala Ile Ser Lys Leu Thr Phe Ala Lys
            340                 345                 350
His Thr Ala Gly Gly Leu Ala Asp Asn Asp His Lys His Leu Tyr Val
        355                 360                 365
Glu Pro Thr Ala Tyr Ala Trp Ser Arg Ala Gly Gly Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Phe Thr Thr Asn Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ala Gln Phe Cys Phe Gly
385                 390                 395                 400
Thr Gln Val Pro Asn Gly Ser Trp Thr Asn Val Phe Asp Gly Gly Asn
                405                 410                 415
Gly Pro Thr Tyr Thr Ala Asp Gly Asn Gly Gln Leu Cys Leu Thr Thr
            420                 425                 430
Thr Asn Gly Glu Pro Ile Val Leu Leu Ser Ser
        435                 440
<210>27
<211>499
<212>PRT
<213>GBNo.BAA00336
<400>27
Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala
1               5                   10                  15
Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile
            20                  25                  30
Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr
        35                  40                  45
Ala Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln
    50                  55                  60
Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala
65                  70                  75                  80
Ile Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr
                85                  90                  95
Gly Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn
            100                 105                 110
Glu Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu
        115                 120                 125
His Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met
    130                 135                 140
Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro
145                 150                 155                 160
Phe Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr
                165                 170                 175
Glu Asp Gln Thr Gln Val Glu Tyr Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val
            180                 185                 190
Ser Leu Leu Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp
        195                 200                 205
Tyr Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu
    210                 215                 220
Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr
225                 230                 235                 240
Asn Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Val Asp
                245                 250                 255
Pro Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn
            260                 265                 270
Tyr Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly
        275                 280                 285
Ser Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys
    290                 295                 300
Pro Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro
305                 310                 315                 320
Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala
                325                 330                 335
Ala Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln
            340                 345                 350
Glu Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr
        355                 360                 365
Trp Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala
    370                 375                 380
Ser Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe
385                 390                 395                 400
Val Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala
                405                 410                 415
Met Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn
            420                 425                 430
Lys Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly
        435                 440                 445
Tyr Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val
    450                 455                 460
Thr Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu
465                 470                 475                 480
Pro Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys
                485                 490                 495
Ser Ser Ser
<210>28
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物TRa2HisXhoI-r2
<400>28
gctcgagtta gtggtggtgg tggtggtgtg aagacagcag caa    43