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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610351478.8 (22)申请日 2016.05.25 (71)申请人 南通大学 地址 226000 江苏省南通市崇川区啬园路9 号 (72)发明人 刘晓娟沈爱国朱曼辉陈辉 (74)专利代理机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 代理人 徐激波 (51)Int.Cl. C07K 14/00(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 27/02(20。
2、06.01) (54)发明名称 62aa多肽类似物及其载体和应用 (57)摘要 本发明公开了62aa多肽类似物及其载体和 应用。 本发明利用生物工程技术， 基因重组一段 多肽类似物对应的序列到pCMV-HA真核表达载 体。 经酶切和序列分析证明重组成功后， 将此真 核表达多肽类似物对应的质粒转染到脉络膜血 管内皮细胞， 免疫印迹证明多肽的蛋白表达， 实 现了多肽的重组。 并通过免疫共沉淀验证此多肽 类似物可促进Fra-1与MMP-1相互作用， 并通过细 胞生物学实验表明此多肽类似物具有抑制CNV后 CECs的增殖、 迁移及管腔生成能力。 该多肽类似 物高效表达， 纯化工艺简单， 有利于进一步大。
3、规 模制备。 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 附图2页 CN 105777874 A 2016.07.20 CN 105777874 A 1.62aa多肽类似物， 其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。 2.编码权利要求1所述的62aa多肽类似物的基因， 其DNA序列如SEQIDNO.2所示。 3.含有权利要求2所述的62aa多肽类似物的编码基因的DNA序列的载体。 4.根据权利要求3所述的载体， 其特征在于： 将62aa多肽类似物的DNA序列连接进pCMV- HA真核表达载体， 构建出重组表达质粒。 5.权利要求1所述的62aa多肽类似物在制备用于抗CNV活性的药物中的应用。 6.权。
4、利要求1所述的62aa多肽类似物在制备用于抑制CECs增殖、 迁移及管腔形成的药 物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105777874 A 2 62aa多肽类似物及其载体和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体是62aa多肽类似物及其载体和应用。 背景技术 0002 脉络膜新生血管(choroidalneovascularization， CNV)， 包括血管发生和血管生 成过程， 是多种可造成严重不可逆视力丧失的视网膜疾病的共同病理基础。 CNV的发展是一 个非常复杂的动态过程， 对于其发生发展的具体机制仍然知之甚少。 CNV主要病理机制是源 自脉络膜的新。
5、生血管， 穿过Bruch膜及视网膜色素上皮， 进入视网膜下腔， 继而产生出血、 渗 出和瘢痕化的过程。 作为CNV发生的关键性细胞， 脉络膜微血管内皮细胞(CECs)对于研究这 种异常血管的发生和防治具有重要的意义。 因此， 抑制CNV后CECs的增殖、 迁移及管腔生成， 可为寻找CNV有效的干预靶点并开发新的治疗药物提供理论依据， 对于CNV相关的视网膜疾 病临床治疗具有十分重要的开发前景。 发明内容 0003 发明目的： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种62aa多肽类似 物， 具有抗CNV活性功能。 本发明的另一目的是提供上述62aa多肽类似物的应用。 0004 技术方案。
6、： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案为： 0005 62aa多肽类似物， 其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。 0006 编码所述的62aa多肽类似物的基因， 其DNA序列如SEQIDNO.2所示。 0007 含有所述的62aa多肽类似物的编码基因的DNA序列的载体。 0008 所述的载体， 将62aa多肽类似物的DNA序列连接进pCMV-HA真核表达载体， 构建出 重组表达质粒。 0009 所述的62aa多肽类似物在制备用于抗CNV活性的药物中的应用。 0010 所述的62aa多肽类似物在制备用于抑制CECs增殖、 迁移及管腔形成的药物中的应 用。 0011 有益效果： 与现有。
7、技术相比， 本发明利用生物工程技术， 基因重组一段多肽类似物 对应的序列到pCMV-HA真核表达载体。 经酶切和序列分析证明重组成功后， 将此真核表达多 肽类似物对应的质粒转染到脉络膜血管内皮细胞(CECs)， 免疫印迹证明多肽的蛋白表达， 实现了多肽的重组。 并通过免疫共沉淀验证此多肽类似物可促进Fra-1与MMP-1相互作用， 并通过细胞生物学实验表明此多肽类似物具有抑制CNV后CECs的增殖、 迁移及管腔生成能 力。 该多肽类似物高效表达， 纯化工艺简单， 有利于进一步大规模制备。 本发明所获得的多 肽类似物能够抑制Fra-1与MMP-1相互作用， 抑制脉络膜血管内皮细胞(CECs)的增。
8、殖、 迁移 及管腔生成， 抑制CNV发生发展。 可为寻找CNV有效的干预靶点并开发新的治疗药物提供理 论依据。 对于应用于CNV相关的视网膜疾病临床治疗具有十分重要的开发前景。 附图说明 说明书 1/3 页 3 CN 105777874 A 3 0012 图1是62aa多肽类似物抑制Fra-1与MMP-1的相互作用结果图； 0013 图2是62aa多肽类似物加强Fra-1对MMP-1的抑制作用结果图； 0014 图3是62aa多肽类似物抑制CNV后脉络膜血管内皮细胞增殖结果图； 0015 图4是62aa多肽类似物抑制CNV后脉络膜血管内皮细胞迁移结果图； 0016 图5是62aa多肽类似物抑制。
9、CNV后脉络膜血管内皮细胞管腔生成结果图。 具体实施方式 0017 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例中未注明具体条件的实验 方法， 通常按照常规条件， 例如分子克隆实验指南(第三版， J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等 译， 科学出版社， 2002年)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件进行。 0018 实施例1多肽类似物的重组 0019 62aa多肽类似物的克隆载体构建： 提取人的mRNA， 逆转录为cDNA， 以cDNA为模板， 应用PCR技术成功扩增出62aa多肽类似物(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示)对应的mRNA序 列(DNA如SEQIDNO.2所示)。 扩增。
10、得到的片段与载体连接， 将连接产物转入感受态大肠杆 菌中， 在含Amp+琼脂平板上挑选克隆， 以碱裂解法小提重组质粒后， 以ECOR1酶切鉴定。 0020 多肽类似物真核表达载体构建及其表达检测： 将克隆质粒和质粒pCMV-HA双酶切 后， 利用回收试剂盒获得目的片段和载体连接。 经转化、 提取等步骤获得重组真核表达载 体。 酶切鉴定重组体， 并且测序进一步确定； 将正确连接的多肽真核表达载体转染脉络膜血 管内皮细胞， 48小时后搜集样品， 免疫印迹结果证明了此62aa多肽类似物的表达。 0021 实施例2 0022 62aa多肽类似物抑制Fra-1和MMP-1的相互作用的确定： 将构建的pC。
11、MVHA-Fra-1 9-70aa转染至脉络膜血管内皮细胞中， 转染3648h后， 收集细胞并以IP裂解液(50mMTris- HCl,pH8.0,150mMNaCl,1NP-40,5mMEDTA,20mMMgCl2， 1Rochephosphatase&Protease inhibitorcocktail)裂解细胞， 13000g， 4离心15min。 将上清转移至新管， 保留部分样品 作为Input后， 加入4 g的对照pCMVHA抗体过夜孵育后， 加入30 LProteinA/Gbeads进行 免疫沉淀。 以IP裂解液洗涤4遍后， 加入25 L上样缓冲液并煮沸5min， 免疫印迹明确Fr。
12、a-1和 MMP-1的相互作用增强， 如图1所示。 0023 62aa多肽类似物加强Fra-1对MMP1-1的抑制： 将构建的pCMVHA-Fra-19-70aa转染 至脉络膜血管内皮细胞中， 转染3648h后， 收集细胞， 免疫印迹结果此多肽Fra-1对MMP-1 的抑制作用， 如图2所示。 0024 实施例3多肽类似物抗新生血管生成功能的检测 0025 1)CCK8检测62aa多肽类似物抑制CNV后脉络膜血管细胞增殖的能力。 将脉络膜血 管内皮细胞按2104个/孔密度接种于96孔板， 37、 5CO2培养箱中孵育12小时细胞贴壁， 1640(10FBS)内加入200 MCoCl2致化学缺氧。
13、， 37、 5CO2培养箱继续培养。 转染多肽类 似物， 每孔加入100 LCCK8(5mg/mL)， 37、 5CO2培养箱继续培养4小时； 震荡混匀后在 570nm酶标仪上测定吸光值， 以时间为横坐标， 相应的空白对照调零校正后的OD值为纵坐 标， 绘制细胞生长曲线， 如图3所示， RF6A细胞在转染pCMVHA-Fra-19-70aa情况下细胞增殖 明显减少， 该片段可以有效减少CNV中内皮细胞的增殖能力。 0026 2)Transwell实验检测62aa多肽类似物抑制CNV后脉络膜血管内皮细胞迁移的能 说明书 2/3 页 4 CN 105777874 A 4 力 0027 将5104个。
14、预处理的RF6A细胞用含1FBS的1640接种在小室内， 将小室移入有 10FBS的24孔板内； 培养46小时后， 将小室取出， 以棉签拭去小室内底面滤膜上的内皮 细胞， PBS洗涤， 5min3次； 4多聚甲醛固定10分钟， PBS洗涤， 5min3次； 结晶紫染色15 分钟， 显微镜下掌控； 水洗返蓝； 1盐酸酒精分化(视情况决定是否进行此步操作)； 相差显 微镜下(200)随机选取5个区域进行计数， 重复3次， 如图4所示， RF6A细胞在转染pCMVHA- Fra-19-70aa情况下细胞迁移数量明显减少， 该片段可以有效减少CNV中内皮细胞的迁移能 力。 0028 3)Transwe。
15、ll实验检测62aa多肽类似物抑制CNV后脉络膜血管内皮细胞管腔生成 的能力 0029 冰浴条件下， 将200 L基质胶铺于24孔板内， 37条件下孵育1小时形成凝胶； 根据 脉络膜血管内皮细胞预处理培养48小时， 以每孔1105个接种于胶原凝胶上， 1640(1 FBS)培养， 37、 5CO2培养箱中继续培养； 培养24小时后， 倒置显微镜下观察， 每孔随机选 取5个区域， 照相； 利用Image-ProPlus软件测量管腔长度， 表示为每孔每个显微镜视野管， 如图5所示， RF6A细胞在未转染pCMVHA-Fra-19-70aa情况下管腔形成数量， RF6A细胞在转染 pCMVHA-Fra-19-70aa情况下管腔形成数量明显减少， 该片段可以有效减少CNV中内皮细胞 的管腔形成能力。 说明书 3/3 页 5 CN 105777874 A 5 0001 序列表 1/2 页 6 CN 105777874 A 6 0002 序列表 2/2 页 7 CN 105777874 A 7 图1图2 图3 图4 说明书附图 1/2 页 8 CN 105777874 A 8 图5 说明书附图 2/2 页 9 CN 105777874 A 9 。