一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗体与应用.pdf

本发明公开一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗体与应用，该抗原肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的抗原肽为12短肽，易于化学合成，且产物纯度高。利用本发明的抗原肽制备的抗体，其效价可达1∶8000以上，对UL49原核表达蛋白、真核表达蛋白以及HCMV颗粒都具有高特异性，可用于制备体外诊断或治疗人巨细胞病毒的药物。本发明的抗原肽制备的抗体是HCMV UL49生物学功能研究的基础要素，利用该抗体，可以对HCMV感染进行定性或定量检测。

1、  一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽，其特征在于该抗原肽具有如SEQID No.1所示的氨基酸序列。

2、  一种编码权利要求1所述抗原肽的DNA序列。

3、  根据权利要求2所述DNA序列，其特征在于该DNA序列具有如SEQID No.2所示的核苷酸序列。

4.  一种含有权利要求2所述DNA序列的重组载体。

5、  一种含有权利要求2所述DNA序列的重组微生物。

6、  一种诊断人巨细胞病毒的试剂，其特征在于该试剂至少含有如权利要求1所述抗原肽。

7、  一种与权利要求1所述抗原肽特异性结合的抗体。

8、  根据权利要求7所述抗体，其特征在于该抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

9、  权利要求7所述抗体在制备体外诊断或治疗人巨细胞病毒的药物中的应用。

一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗体与应用
技术领域
本发明涉及免疫生物学领域，具体涉及人巨细胞病毒UL49基因的免疫学研究，尤其涉及一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗体与应用。
背景技术
人类巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)是一种在全世界不同种族人群中广泛传播且感染率很高的病原体。目前研究发现，HCMV感染造成的主要危害是引发移植感染、宫内感染，导致胎儿流产、骨髓发育不良、畸形、智力低下等，因此是医学和优生学以及骨髓移植研究中的重大课题。
病毒体外培养实验发现，缺失UL49基因对HCMV是致死的，说明该基因可能表达一个功能蛋白，因此UL49基因有望成为研究治疗HCMV的一个突破点。但目前HCMV UL49生物学功能尚无法确定，也无直接证据表明UL49基因是否表达蛋白，其中一个主要原因是难以得到效价高、特异性强的抗体。
传统制备HCMV UL49基因的抗体是采用HCMV UL49编码的氨基酸序列，设计并制备全长及截取片段的原核表达蛋白，继而以此为免疫原制备抗体，这类方法的免疫原获取过程复杂、所获免疫原纯度得不到保证，最终制备的抗体效价与特异性均无法满足研究的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可通过化学合成法合成的，能够获得效价高、特异性强的抗体的人巨细胞病毒UL49基因抗原肽。
本发明的另一个目的在于提供由上述人巨细胞病毒UL49基因抗原肽制备所得抗体。
本发明的另一个目的在于提供由上述人巨细胞病毒UL49基因抗原肽制备所得抗体在制备体外诊断或治疗人巨细胞病毒的药物中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明人通过Genebank上已经公开的序列确定HCMV UL49编码氨基酸序列，然后应用生物学软件对HCMV UL49编码氨基酸序列进行B细胞表位预测，主要是对以下几个方面的分析预测：二级结构、跨膜区、亲水性、可及性、极性、柔韧性和抗原性等，然后对B细胞表位重叠区域分析，最后确定一段12肽的高抗原性的特殊片段，该片段即为本发明的人巨细胞病毒UL49基因抗原肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
接着本发明人根据上述抗原肽制备相应的抗体，并采用ELISA法检测抗体的效价，采用Western blot方法检测抗体对UL49原核表达蛋白、真核表达蛋白以及HCMV颗粒的特异性，结果根据本发明抗原制备得到的抗体效价可达1∶8000以上，对UL49原核表达蛋白、真核表达蛋白以及HCMV颗粒也具有高特异性。
由本发明人巨细胞病毒UL49基因抗原肽制备所得抗体，可以为多克隆抗体也可以为单克隆抗体，因为该抗体的效价可达1∶8000以上，且又对UL49原核表达蛋白、真核表达蛋白以及HCMV颗粒都具有高特异性，因此可用于制备体外诊断或治疗人巨细胞病毒的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的抗原肽为12个短肽，易于化学合成，且产物纯度高；
2.利用本发明的抗原肽制备的抗体，其效价高、特异性强；
3.本发明的抗原肽制备的抗体是HCMV UL49生物学功能研究的基础要素；
4.利用本发明的抗原肽制备的抗体，可以对HCMV感染进行定性或定量检测。
附图说明
图1为ELISA法检测人巨细胞病毒UL49编码蛋白的抗体效价曲线；
其中，1为稀释后的血清的效价曲线，2为免疫前血清的效价曲线；
图2为Western blot检测实施例2制备所得抗体针对UL49原核表达蛋白的特异性的电泳图；
其中，1为DE3裂解菌液，2为融合表达UL49大片断(aa3～246)蛋白的DE3裂解菌液，3为感染HCMV的HFF细胞裂解液；
图3为Western blot检测实施例2制备所得抗体针对UL49真核表达蛋白的特异性的电泳图；
其中，1为Hela细胞裂解液，2为融合表达UL49全蛋白的Hela细胞裂解液，3为感染HCMV的HFF细胞裂解液；
图4为Western blot检测实施例2制备所得抗体针对HCMV感染细胞的特异性的电泳图；
其中，1为HFF细胞裂解液，2为感染HCMV的HFF细胞裂解液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1人巨细胞病毒UL49基因抗原肽
本实施例首先通过专业在线软件Genebank输入pUL49蛋白氨基酸序列，选择二级结构、跨膜区、亲水性、可及性、极性、柔韧性及抗原性参数模式，分别预测各模式下pUL49的抗原序列(如表1所示)，将上述数据汇总后与吴玉章等(吴玉章，朱锡华.一种病毒蛋白B细胞表位预测方法的建立[J].科学通报，1994，39(24)：2275～22279.)建立的B细胞表位预测法得出高分值指数的序列(如表2所示)进行重叠性的综合判定，最终设计得出人巨细胞病毒UL49基因抗原肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
表1应用不同方法预测pUL49蛋白细胞表位

表2预测pUL49蛋白B细胞表位的平均抗原性指数

实施例2抗体的制备
本实施例根据实施例1设计得到的人巨细胞病毒UL49基因抗原肽序列(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)设置合成参数，以Fmoc固相法合成抗原肽树脂，再用三氟乙酸(TFA)将抗原肽与树脂切开，初步纯化制品肽后，再用高效液相色谱法(HPLC)纯化，最后将纯化多肽冷冻抽干。
选择无病原的一级新西兰大白兔，抗原采用上述纯化冷冻抽干后的人巨细胞病毒UL49基因抗原肽，实施，取血、分离纯化、制备得到人巨细胞病毒UL49基因抗原肽的抗体，将该抗体于-20℃～-70℃保存。
本实施例抗体的制备，其过程中涉及的各个步骤，如以Fmoc固相法合成抗原肽树脂、HPLC纯化、弗氏完全佐剂乳化的抗原基础免疫、加强免疫、以及纯化等，均为本领域技术人员根据抗原制备相应抗体所采用的常规操作。
实施例3ELISA法检测抗体的效价
本实施例采用ELISA法检测实施例2制备所得抗体的效价，所用ELISA检测法采用本领域技术人员的常规操作：用包被缓冲液将抗原(2μg/μl)稀释2000倍包被、封闭，将抗血清10倍连续稀释后加入包被孔，设对照，温育，用工作浓度羊抗兔IgG-HRP温育、显色，终止反应后在酶联检测仪上测定每孔的OD₄₅₀值，与相应阴性对照，测定值的比值＞2.1者为阳性反应。
效价曲线结果如图1所示，从图中可以看出，实施例2制备所得抗体其效价可达1∶8000以上。
实施例4Western blot检测
本实施例采用Western blot方法检测实施例2制备所得抗体对UL49原核表达蛋白、真核表达蛋白以及HCMV颗粒的特异性，检测过程中所涉及到的UL49原核表达蛋白的构建、UL49真核表达蛋白的构建、HCMV病毒感染细胞、以及Western blot检测等试验均为本领域技术人员的常规操作，其实验步骤可参考教科书或者相关试剂盒说明。
1.Western blot方法检测实施例2制备所得抗体对UL49原核表达蛋白的特异性
选取UL49编码氨基酸序列的3-246aa区域(GeneBank：DQ462280)，并选择表达载体pGEX-4T-3(市售)，构建原核表达载体pGEX-4T-3-UL49a质粒，将该质粒转染DE3细胞，用IPTG诱导表达pUL49a-GST融合蛋白，得到UL49原核表达蛋白。
将HCMV感染人包皮成纤维细胞(HFF，市售)，收集感染病变后的HFF细胞裂解蛋白液。
以DE3细胞裂解液为阴性对照，以上述感染病变后的HFF细胞裂解蛋白液为阳性对照，用Western blot方法检测实施例2制备所得抗体对UL49原核表达蛋白的特异性。
检测结果如图2所示，从图中可以看出1泳道的阴性对照样本无条带，3泳道的阳性对照样本出现条带(UL49表达蛋白具570个氨基酸序列，理论值为570×110＝62kDa)，2泳道的UL49原核表达蛋白样品出现条带(UL49^3-246aa大片段表达蛋白具244个氨基酸序列，理论值为244×110＝27kDa，GST蛋白自身分子量26kDa，原核融合表达蛋白的分子量理论值为两者之和53kDa)，证明实施例2制备所得抗体对UL49原核表达蛋白具有特异性。
2.Western blot方法检测实施例2制备所得抗体对UL49真核表达蛋白的特异性
采用UL49编码氨基酸全序列(GeneBank：DQ462280)，以及真核表达载体pCDNA3.1-myc(市售)，构建真核表达载体pCDNA3.1-UL49-myc质粒，瞬时转染Hela细胞后收集Hela细胞裂解蛋白液，制备得到UL49真核表达蛋白。
将HCMV感染人包皮成纤维细胞(HFF，市售)，收集感染病变后的HFF细胞裂解蛋白液。
以Hela细胞裂解液为阴性对照，以上述感染病变后的HFF细胞裂解蛋白液为阳性对照，用Western blot方法检测实施例2制备所得抗体对UL49真核表达蛋白的特异性。
检测结果如图3所示，从图中可以看出1泳道的阴性对照样本无条带，3泳道的阳性对照样本出现条带，2泳道的UL49真核表达蛋白样品出现条带，2、3泳道的蛋白分子量与理论值一致(UL49表达蛋白具570个氨基酸序列，理论值为570×110＝62kDa)，证明实施例2制备所得抗体对UL49真核表达蛋白具有特异性。
3.Western blot检测实施例2制备所得抗体针对HCMV感染细胞的特异性
将HCMV感染人包皮成纤维细胞(HFF，市售)，收集感染病变后的HFF细胞裂解蛋白液，以HFF细胞裂解液为阴性对照，用Western blot方法检测实施例2制备所得抗体对HCMV感染细胞表达蛋白的特异性。
检测结果如图4所示，从图中可以看出1泳道的阴性对照样本无条带，2泳道的HCMV感染细胞表达蛋白样品出现条带，2泳道的蛋白分子量与理论值一致(UL49表达蛋白具570个氨基酸序列，理论值为570×110＝62kDa)，证明实施例2制备所得抗体对HCMV感染细胞表达蛋白具有特异性。
根据上述实验结果可以看出，由本发明人巨细胞病毒UL49基因抗原肽制备得到的抗体对UL49原核表达蛋白、真核表达蛋白以及HCMV颗粒都具有高特异性。
一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗体与应用 序列表
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>一种人巨细胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗体与应用
<130>
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人(human)
<400>1
Lys Arg Phe Asp Ala Arg Ala Asp Leu Ala Val Tyr
1               5                   10
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人(human)
<400>2
aagcgcttcg acgcccgcgc tgatttggcc gtatac    36
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人(human)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(36)
<400>3
aag cgc ttc gac gcc cgc gct gat ttg gcc gta tac    36
Lys Arg Phe Asp Ala Arg Ala Asp Leu Ala Val Tyr
1               5                   10
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>人(human)
<400>4
Lys Arg Phe Asp Ala Arg Ala Asp Leu Ala Val Tyr
1               5                   10